Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
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这项工作的资金来自加拿大自然科学和工程研究理事会 (nserc)、班廷和最佳糖尿病中心 (bbdc) 的试点和可行性研究赠款、给 h-k 的病童启动基金。s. 医学研究中心计划 (2015r1aa2009124), 通过由科学、信息和通信技术和信息通信技术部资助的韩国国家研究基金会 (nrf) 向 j-r. k。

所有实验动物规程都得到了苯基因组学中心 (tcp) 动物护理委员会的批准, 符合加拿大动物护理委员会的标准。老鼠保持在12小时的光/黑暗循环中, 并免费获得水和食物。采用7个月大的 c57bl/6j 雄性小鼠进行全装染色试验。
注: 第1至第2节按时间顺序排列, 第3节是第1节之后的一个可选步骤。第4节可在第2部分完成后进行脂肪细胞大小和血管密度分析。
1. 材料制...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. 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尽管传统的组织学和冷冻技术为观察细胞内结构提供了好处, 但全贴染色为脂肪组织研究提供了不同的视角, 从而实现了细胞的三维可视化最小处理组织的结构。
为了成功地进行整体染色, 应考虑以下建议。不同的脂肪组织库可以产生不同的免疫染色效果;因此, 应首先确定所使用的脂肪组织仓库的类型。例如, 棕色脂肪组织 (bat) 相对于白色脂肪组织 (wat) 密度较高, 原因是较小?...

脂肪组织是储能的重要器官, 其特点是动态重塑和几乎无限的膨胀1。除了能量稳态外, 脂肪组织在50多只脂肪因子的激素分泌中也起着至关重要的作用, 以调节全身代谢功能2。脂肪组织有一个多样化的结构, 包括各种细胞类型, 包括成熟的脂肪细胞, 成纤维细胞, 内皮细胞, 免疫细胞, 和脂肪细胞祖细胞 3。最近的研究表明, 肥胖和其他代谢功能障碍可以显著改变脂肪组织功能和微环境, 其中包括但不限于脂肪细胞的扩大, 炎症细胞的浸润 (例如,巨噬细胞) 和血管功能障碍3。
传统的形态学技术, 如组织学和冷冻合成, 证明了在研究脂肪生物学的几个局限性, 如冗长的化学处理步骤, 这可能导致组织收缩和结构变形3, 4. 我的工作是什么？此外, 这些二维技术不足以观察不同细胞类型所施加的细胞间相互作用, 因为所获得的切片仅限于整个组织3的较小区域。与传统的荧光成像方法相比, 全贴染色不需要额外的侵入性步骤, 如嵌入、切片和脱水;因此, 这避免了抗体特异性降低的问题。因此, 它是一种简单有效的脂肪组织成像方法, 具有较好的脂肪细胞形态和整体脂肪组织结构5。因此, 建立了一种快速、廉价的免疫标记技术, 以保存脂肪组织三维结构1,6,7, 8.
然而, 尽管使用全贴染色保存脂肪组织形态, 但这项技术仍然无法想象组织脂质表面下的内部结构。最近的几项研究9,10 已建立组织清除技术结合全身安装免疫标记 1,6, 允许在脂肪组织中进行全面的三维可视化。特别是, 在最近的研究中, 密集的神经网络和血管网络被成像9,10,11,12与三维体积成像。事实上, 研究脂肪组织在不同生理条件下的神经和血管可塑性是研究其生物学的关键。溶剂清除器官 (isico +) 组织清除的免疫标签三维成像是一个由甲醇预处理、免疫标记和用有机化学试剂清除组织不透明组成的过程 (dcm)) 和二苯醚 (dbe)13,14。通过使脂肪组织完全透明, 可以获得更准确的解剖表示组织内, 如血管和神经纤维可以获得9,10.idisco + 的优点在于它与各种抗体和荧光记者11、14兼容, 并已在多个器官甚至胚胎14中证明了成功.然而, 它的主要局限性是潜伏期长, 完成整个实验需要 1 8 到 2 0天。
全装染色的另一个重要应用是结合谱系追踪系统对细胞命运的可视化。谱系追踪是细胞中特定基因标记的标记, 可传递给所有子细胞, 并随着时间的推移而守变15。因此, 它是一个强大的工具, 可以用来确定细胞后代的命运.自20世纪90年代以来, Cre-LoxP 重组系统已成为生物中追踪谱系的有力方法.当表达 cre 的小鼠线, dna 重组酶, 与另一小鼠线交叉表示一个记者, 是相邻的 loxp-stop-loxp 序列, 记者蛋白表示 15.
对于全装染色, 使用荧光多色记者是适用于脂肪组织的成像, 因为它允许最小的干扰细胞内活动的脂肪细胞 16.然而, 传统的记者通常染色细胞质, 使其难以追踪白脂肪细胞的谱系,其中细胞质含量有限17。为克服这一问题, 使用膜结合荧光 ttomatich-fp (mt/mg) 记者标记是一个理想的工具。膜靶向番茄在 Cre-negative 细胞18中表达。切除后, 会发生向膜靶向 egfp 表达的开关, 使本报记者适合追踪脂肪细胞祖细胞的血统 17,18 (补充图 1)。
本文的目的是提供一个详细的协议, 整个安装染色, 并说明如何将其与其他技术相结合, 研究脂肪组织的发展和生理。本协议中描述的两个应用示例是它与 1) 多色记者小鼠行一起识别脂肪细胞的各种来源, 2) 组织清除, 以进一步显示白色脂肪组织 (wat) 中的神经乔木化。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

脂肪组织是一种重要的代谢器官, 具有较高的可塑性, 对环境刺激和营养状态有反应。因此, 研究脂肪组织的形态和生物学的各种技术已经发展起来。然而, 传统的可视化方法仅限于研究二维切片中的组织, 无法捕获整个器官的3d 结构。在这里, 我们提出了全贴染色, 一种免疫组织化学方法, 保持完整的脂肪组织形态学与最小的处理步骤。因此, 脂肪细胞和其他细胞成分的结构保持没有扭曲, 实现了最具代表性的三维可视化组织。此外, 整个染色可以与血统追踪方法相结合, 以确定细胞的命运决定。然而, 这种技术有一些限制, 以提供有关脂肪组织的较深层次的准确部分的准确信息。为了克服这一限制, 可以进一步结合组织清除技术, 消除组织的不透明, 并允许使用光片荧光显微镜对整个脂肪组织解剖进行完整的可视化。因此, 结合这些技术可以获得更高的分辨率和更准确的脂肪组织结构表示。

由于脂肪组织的脆弱性, 涉及多个处理步骤和切片的方法可能导致脂肪组织形态的毁容 3 (图 1a)。然而, 全贴染色可以保持脂肪细胞的形态, 确保准确解释结果 (图 1b)。
脂肪组织的过度固定会导致固定性的自体荧光。如图 2 a所示, 分别对酪氨酸羟化酶 (th) 和 pecam-1 信号进行绿色和红色通道染色...

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

本研究的重点是展示全安装免疫染色和可视化技术作为一种理想的方法, 为脂肪组织结构和细胞成分的三维成像。

三维白色脂肪组织结构的全装染色可视化

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

这种方法可以帮助回答脂肪生物学领域的关键问题，如细胞间相互作用和脂肪组织生理学在禁食和肥胖等不同代谢条件下如何变化。该技术的主要优点是，它以最佳方式保留了原有的脂肪3D结构，避免了传统免疫组织化学通常需要的冗长的处理步骤。虽然这种方法可以提供对脂肪组织结构的洞察，它也可以通过全安装染色大脑而应用于其他器官系统，如神经系统。一般来说，由于难以获得财产组织位点、找到合适的固定期和最佳抗体浓度，对这种方法的个体将难以克服。解剖完成后，将含有1%甲醛组织样品的培养皿从冰中转移到室温一小时。然后将组织转移到12或24井细胞培养板，以更快地进行清洗。重要的是要记住，全安装染色过程必须在解剖后立即开始，并且每个步骤之间没有暂停点。用 PBS-0.3T 在倾斜 22 度的摇床上清洗组织，在室温下以每分钟 20 至 25 次的速度倾斜 5 分钟。重复两次此洗涤。在此之后，加入约0.5至1毫升含有5%动物血清的阻断缓冲液。使用以前的条件在摇床上孵育板一小时。吸气阻断溶液，并添加在PBS-0.3T中稀释的毫升原抗体，每井含有1%的动物血清。在4摄氏度的摇床上孵育板，倾斜22度，速度为每分钟20至25度。第二天，使用PBS-0.3T在室温下清洗组织五分钟。重复两次此洗涤。然后，向每一井添加0.5至1毫升适当和稀释的二级抗体溶液。用铝箔包裹板，并在室温下在摇床上孵育一小时。在此之后，用PBS-0.3T在室温下清洗盘子两次，每次洗涤5分钟。如果在中性脂质污渍期间需要液滴的可视化，用 1x PBS 洗涤两次，每次洗涤持续 5 分钟。加入在PBS中稀释的中性脂质污渍，在室温下孵育30分钟。要开始成像，请使用钳子将组织平放在 24 由 60 毫米玻璃盖滑上。如果需要使用 DAPI 进行核染色，请添加一到两滴含有 DAPI 的安装介质，以完全淹没组织并防止其干燥。然后，将幻灯片放在倒置的共体激光显微镜系统中。要在多个焦平面上获取全安装染色组织的图像，请执行 100 到 150 微米的 Z 堆栈，步长为 4 到 6 微米，达到所需的放大倍率。在这项研究中，全安装染色用于保存脂肪组织结构。与涉及多个处理步骤和分节的方法不同，全安装染色方法可以保留脂肪细胞的形态，确保解释结果的准确性。脂肪组织过度固定导致固定诱导荧光，这可以通过重叠的相同区域来表示，例如这里看到的酪氨酸羟基酶和PECAM-1信号。然而，正确固定的全安装污渍样品显示独立和不同的信号，表明这些信号不是自动荧光。成像全安装染色脂肪组织允许在不同的实验条件下定量形态变化。特别是，脂肪组织是高度血管化的，在能量水平的快速变化中，对促进代谢平衡非常重要。例如，C57黑色6J小鼠，经过24小时的禁食，显示明显较小的脂肪细胞大小，这表明脂解，和血管密度上升的趋势相比，连续喂养的小鼠。使用 iDISCO® 清除脂肪组织可使脂肪组织在光学上变得透明。与在全安装染色中观察到的不以相同放大率清除组织相比，通过组织清除的脂肪组织的免疫标记显示神经节化密度要高得多。在尝试此过程时，重要的是要记住，在 PFA 的室温下不要过度固定样品一小时，否则，这会增加背景自荧光。但是，如果样品固定在摄氏四度，则固定期可能会延长。按照这个程序，其他方法，如使用 ImageJ 的定量，可以执行，以回答其他问题，如细胞结构，如脂肪细胞位点和血管密度，如何随着各种生理条件的变化。

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