Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC) van Canada, Pilot en haalbaarheid studie Grant Banting & beste Diabetes centrum (BBDC), het startfonds SickKids aan H-K. S., medische Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst van plan om J-R.K.

Alle experimentele dierlijke protocollen werden goedgekeurd door het dier Care Comité van het centrum voor Phenogenomics (TCP) gelijkvormig aan de normen van de Canadese Raad op Animal Care. Muizen werden gehandhaafd op 12 uur licht/donker cycli en voorzien van gratis toegang tot water en voedsel. 7 maand oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt in het geheel-mount kleuring experiment.
Opmerking: Secties 1 tot en met 2 zijn in chronologische volgorde, met punt 3 wordt een optionele sta...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

Hoewel conventionele technieken zoals histologie en cryosection voordelen bieden voor de observatie van intracellulaire structuur, biedt geheel-mount kleuring een ander perspectief in adipeus weefsel onderzoek, waarmee 3D-visualisatie van cellulaire architectuur van minimaal verwerkte weefsel.
Om het geheel-mount kleuring uitvoeren, moeten de volgende suggesties in aanmerking worden genomen. Verschillende adipeus weefsel depots kunnen verschillende immunokleuring resultaten opleveren; Dus, het...

Vetweefsel is een essentieel orgaan voor energieopslag en wordt gekenmerkt door de dynamische reorganisatie en bijna onbeperkte uitbreiding1. Naast energie homeostase speelt adipeus weefsel ook een essentiële rol in hormoon afscheiding van meer dan 50 adipokines te moduleren van gehele lichaam metabole functie2. Vetweefsel heeft een divers het platform bestaande uit verschillende celtypen, met inbegrip van volwassen adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, immune cellen en adipocyte voorlopercellen cellen3. Recente studies hebben aangetoond dat overgewicht en andere metabole disfunctie aanzienlijk veranderen kunnen adipeus weefsel functie en de communicatie, die omvat, maar is niet beperkt tot uitbreiding van de adipocytes, infiltratie van ontstekingscellen (b.v., macrofagen), en vasculaire dysfunctie3.
Conventionele morfologische technieken zoals histologie en cryosectioning tonen verschillende beperkingen bij het bestuderen van obesitas biologie zoals lange chemische verwerking stappen, die tot weefsel krimp en structuur vervorming3leiden kan, 4. Bovendien, deze 2D technieken zijn onvoldoende om het observeren van intercellulaire interacties uitgeoefend door verschillende soorten cellen, zoals de secties verkregen beperkt tot kleinere regio's van de gehele weefsel3 zijn. In vergelijking met conventionele methoden voor fluorescerende imaging, geheel-mount kleuring vereist geen extra invasieve stappen, zoals insluiten, afdelen en uitdroging; Dus, dit voorkomt het probleem van de afnemende antilichamenspecificiteit. Als zodanig is het een eenvoudige en efficiënte methode voor imaging adipeus weefsel, met beter behoud van de adipocyte morfologie en algehele adipeus weefsel structuur5. Daarom geheel-mount kleuring zoals een snelle en goedkope immunolabeling techniek werd opgericht voor het behoud van vetweefsel 3D het platform1,6,7,8.
Echter, ondanks het behoud van vetweefsel morfologie met gebruik van het geheel-mount kleuring, deze techniek is nog steeds niet in staat om te visualiseren van innerlijke structuren onder de oppervlakte van de lipide van het weefsel. Verschillende recente studies9,10 geconstateerd weefsel clearing technieken gecombineerd met geheel-mount immunolabeling1,6 te voorzien van uitgebreide 3D-visualisatie in adipeus weefsel. In het bijzonder zijn dichte neurale en therapieën netwerken gevisualiseerd in recente studies9,10,11,12 met 3D-volume imaging. Inderdaad, het bestuderen van de neurale en vasculaire plasticiteit van vetweefsel onder verschillende fysiologische omstandigheden is essentieel voor de studie van de biologie. Immunolabeling ingeschakelde driedimensionale beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO +) weefsel clearing is een proces bestaat uit methanol voorbehandeling, immunolabeling, en ruimen van weefsel ondoorzichtigheid met organische chemische reagentia dichloormethaan (DCM ) en dibenzyl ether (DBE)13,14. Door het vetweefsel volkomen transparant te maken, kan een meer accurate weergave van anatomie binnen het weefsel zoals bloedvaten en neurale vezels worden verkregen9,10. IDISCO + heeft voordelen het is compatibel met verschillende antilichamen en fluorescerende verslaggevers11,14, en het heeft aangetoond dat succes in meerdere organen en zelfs embryoes14. De belangrijkste beperking is echter een lange incubatietijd, waarin 18 tot 20 dagen nodig om te voltooien van het hele experiment.
Een andere belangrijke toepassing van geheel-mount kleuring is de visualisatie van het lot van de cel in combinatie met een systeem voor de tracering van afkomst. Lineage tracering is de etikettering van een specifiek gen/markering in een cel die kan worden doorgegeven aan alle cellen van de dochter en over tijd15wordt behouden. Als zodanig is het een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het bepalen van het lot van15nakomelingen van een cel. Sinds de jaren 1990, de Cre-LoxP recombinante systeem is uitgegroeid tot een krachtige aanpak voor lineage tracering in levende organismen15. Wanneer een muis-lijn die Cre, een DNA recombinase enzym uitdrukt, is gekruist met een andere muis lijn uiting van een verslaggever die grenst aan een reeks loxP-STOP-loxP, is het eiwit verslaggever uitgedrukt15.
Voor geheel-mount kleuring, is het gebruik van fluorescerend multicolor verslaggevers geschikt voor imaging van vetweefsel, omdat het zorgt voor minimale interferentie met intracellulaire activiteiten van de adipocyte16. Echter, traditionele verslaggevers meestal vlek het cytoplasma, waardoor het moeilijk is om te traceren van de bloedlijn van witte adipocytes, die weinig hebben cytoplasmatische inhoud17. Om dit probleem te verhelpen, is het gebruik van membraan-gebonden fluorescerende tdTomato/membraan eGFP (mT/mG) verslaggever marker een ideaal hulpmiddel. Membraan-gerichte tdTomato wordt uitgedrukt in Cre-negatieve cellen18. Op Cre excisie optreedt een schakelaar op de expressie van eGFP membraan-gerichte, waardoor deze verslaggever geschikt voor het traceren van de bloedlijn van adipocyte voorlopercellen17,18 (Aanvullende figuur 1).
Het doel van deze paper is te voorzien in een gedetailleerd protocol geheel-mount kleuring en tonen hoe het kan worden gecombineerd met andere technieken te bestuderen voor de ontwikkeling en de Fysiologie van vetweefsel. Twee voorbeelden van toepassingen die zijn beschreven in dit protocol zijn het gebruik ervan met 1) Multikleur verslaggever muis lijnen te identificeren van verschillende oorsprong van adipocytes en 2) weefsel wissen om de neurale arborization in witte vetweefsel (WAT) verder te visualiseren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Vetweefsel is een belangrijk metabolisch orgaan met hoge plasticiteit en inspelen op milieu stimuli en de status van de nutriënten. Als zodanig, zijn verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van de morfologie en de biologie van vetweefsel. Conventionele visualisatie methoden zijn echter beperkt tot het bestuderen van het weefsel in 2D secties, niet te vangen de 3D architectuur van het gehele orgaan. Hier presenteren we geheel-mount kleuring, een immunohistochemistry methode die bewaart intact adipeus weefsel morfologie met minimale processing stappen. Vandaar, de structuren van adipocytes en andere cellulaire componenten worden gehandhaafd zonder vervorming, bereiken de meest representatieve 3D visualisatie van het weefsel. Geheel-mount kleuring kan bovendien worden gecombineerd met lineage tracering methoden ter bepaling van de cel lot besluiten. Deze techniek heeft echter enkele beperkingen aan het verstrekken van nauwkeurige informatie met betrekking tot de diepere delen van vetweefsel. Om deze beperking ondervangen kan geheel-mount kleuring worden verder gecombineerd met weefsel van het ontruimen van technieken om de ondoorzichtigheid van weefsel te verwijderen en te zorgen voor volledige visualisatie van hele adipeus weefsel anatomie met behulp van licht vel fluorescent microscopie. Dus kunnen een hogere resolutie en meer accurate weergave van vetweefsel structuren worden vastgelegd met de combinatie van deze technieken.

Als gevolg van de kwetsbaarheid van vetweefsel, kunnen methoden waarbij meerdere verwerking stappen en segmenteren leiden tot verminking van vetweefsel morfologie3 (figuur 1A). Echter kunt geheel-mount kleuring behouden de morfologie van adipocytes, zorgen voor nauwkeurige interpretatie van de resultaten (figuur 1B).
Overmatige fixatie van vetweefsel leidt tot fixeer-geïnduceerde autofluorescence. Zoals blijkt...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

De focus van de huidige studie is om aan te tonen van de gehele-mount immunokleuring en visualisatie techniek als een ideale methode voor 3D beeldvorming van vetweefsel architectuur en cellulaire component.

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vetbiologie veld, zoals hoe intercellulaire interacties en vetweefsel fysiologie veranderen op verschillende metabole voorwaarden zoals vasten en obesitas. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het optimaal behoudt de oorspronkelijke vet 3D-structuur en vermijdt lange verwerking stappen die meestal nodig zijn voor conventionele immunohistochemie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structuur van het vetweefsel, kan het ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals het zenuwstelsel, door de hersenen in het hele vat te bevlekken.Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de moeilijkheden bij het verkrijgen van eigendom weefsel sites, het vinden van de juiste fixatie periode, en de optimale concentratie van antilichamen. Nadat de dissectie is voltooid, breng je de schotel met de weefselmonsters in 1% paraformaldehyde gedurende een uur van het ijs naar kamertemperatuur. Breng vervolgens de weefsels over naar een celkweekplaat van 12 of 24 goed voor een snellere wasbeurt.Het is belangrijk om te onthouden dat de hele montage kleuring procedure moet onmiddellijk beginnen na dissectie en dat er geen pauze punten tussen elke stap. Was de weefsels met PBS-0.3T op een shaker gekanteld op 22 graden met een snelheid tussen 20 en 25 kantelt per minuut bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Herhaal deze was twee keer extra.Voeg hierna ongeveer 0,5 tot een milliliter blokkeerbuffer toe met 5%dierlijk serum. Broed de plaat op een shaker met behulp van de vorige voorwaarden voor een uur. Aspirate de blokkerende oplossing, en voeg op milliliter van primaire antilichamen verdund in PBS-0.3T met 1%dier serum aan elke put.Incubeer de plaat 's nachts op een shaker bij vier graden Celsius met een kanteling van 22 graden en een snelheid van 20 tot 25 kantelt per minuut. De volgende dag gebruikt u PBS-0.3T om de weefsels vijf minuten op kamertemperatuur te wassen. Herhaal deze was twee keer extra.Voeg vervolgens tussen 0,5 en een milliliter geschikte en verdunde secundaire antilichaamoplossingen toe aan elke put. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en broed het een uur lang op een shaker bij kamertemperatuur. Daarna was je de plaat twee keer met PBS-0.3T op kamertemperatuur gedurende vijf minuten per wasbeurt.Als visualisatie van vloeibare druppels nodig is tijdens de neutrale lipide vlek, was twee keer met 1x PBS met elke wasbeurt van vijf minuten. Voeg de neutrale lipidevlek verdund in PBS toe en broed 30 minuten op kamertemperatuur. Om te beginnen met beeldvorming, gebruik tangen om het weefsel plat te leggen op een 24 bij 60 millimeter glazen deksel slip.Als nuclei vlekken met DAPI gewenst is, voeg een tot twee druppels van een montagemedium dat DAPI bevat om het weefsel volledig onder te dompelen en te voorkomen dat het drogen. Plaats vervolgens de dia op een omgekeerd confocale lasermicroscoopsysteem. Om beelden van geheel gemonteerd gekleurd weefsel op meerdere brandpuntsvlakken te verkrijgen, voert u Z-stapels van 100 tot 150 micrometer diepte uit met een stapgrootte van vier tot zes micrometer bij de gewenste vergroting.In deze studie wordt kleuring in het hele vat gebruikt om de architectuur van vetweefsel te behouden. In tegenstelling tot methoden die meerdere verwerkingsstappen en secties omvatten, wat kan leiden tot verminking van de vetweefselmorfologie, kan de kleurwijze van het hele vat zich de morfologie van adipocyten behouden, wat de nauwkeurigheid garandeert bij het interpreteren van resultaten. Overfixatie van vetweefsel leidt tot fixatief geïnduceerde fluorescentie, die kan worden aangegeven door overlappende identieke gebieden, zoals in de tyrosine hydroxylase en PECAM-1 signalen hier gezien.Goed vaste, hele-mount vlek monsters, echter, tonen aparte en duidelijke signalen, wat aangeeft dat deze signalen zijn niet autofluorescentie. Imaging whole-mount gekleurd vetweefsel zorgt voor de kwantificering van morfologische veranderingen onder verschillende experimentele omstandigheden. In het bijzonder, vetweefsel is zeer gevasculariseerd, wat belangrijk is bij het bemiddelen van metabole homeostase op snelle veranderingen in het energieniveau.Bijvoorbeeld, C57 zwarte 6J muizen, die ondergaan 24 uur van het vasten, tonen een aanzienlijk kleinere adipocyte grootte, die lipolyse aangeeft, en een trend in verhoogde bloedvatdichtheid in vergelijking met continu gevoede muizen. Het wissen van vetweefsel met iDISCO+ maakt het mogelijk om vetweefsels optisch transparant te maken. Immunolabeling van vetweefsel dat is gegaan door weefsel clearing toont veel dichter neurale arborisatie in vergelijking met die waargenomen in de hele montage kleuring zonder weefsel clearing op dezelfde vergroting.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden niet om uw monsters te overfixen voor meer dan een uur op kamertemperatuur in PFA, anders zal dit verhogen achtergrond autofluorescentie. Deze fixatieperiode kan echter worden verlengd als monsters worden vastgesteld op vier graden Celsius. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals kwantificering met ImageJ worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe cellulaire architectuur, zoals adipocytesites en bloedvatdichtheid, veranderen in reactie op verschillende fysiologische aandoeningen.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...