Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי מענקים מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC) של קנדה, טייס, מענק מחקר היתכנות של בנטינג & הטוב סוכרת במרכז (BBDC), לקרן סטארט-אפ SickKids H-ק' ס', רפואי מרכז תכנית המחקר (2015R1A5A2009124) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, תקשוב, העתיד מתכנן J-ר. ק

כל הפרוטוקולים בעלי חיים ניסיוני אושרו על-ידי הוועדה אכפת לי חיה של המרכז עבור Phenogenomics (TCP) תאמו את הסטנדרטים של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים. עכברים היו ביום 12-h/כהה מחזורים, מספק גישה חופשית אל מים ומזון. חודש 7 עכברים זכר הישן של C57BL/6J שימשו בניסוי מכתימים כולה-הר.
הערה: סעי...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

למרות טכניקות שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosection להציע יתרונות להתבוננות מבנה תאיים, כולה-הר מכתים מספק נקודת מבט שונה במחקר רקמת שומן, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של הסלולרי ארכיטקטורה של רקמות מינימלית מעובד.
על מנת לבצע בהצלחה את כולה-הר מכתים, ההצעות הבאות צריכה להילקח בחשבו?...

רקמת שומן הוא איבר חיוני עבור אחסון אנרגיה, מאופיין על-ידי נערכו דינמי והרחבת כמעט ללא הגבלה1. בנוסף אנרגיה הומאוסטזיס, רקמת שומן גם ממלא תפקיד חיוני הפרשת הורמון adipokines מעל 50 לווסת פונקציה מטבולית לכל הגוף2. רקמת שומן יש של ארכיטקטורה מגוונת הכוללת של סוגי תאים שונים לרבות adipocytes בוגר, fibroblasts, תאי אנדותל, תאים חיסוניים adipocyte קדמון תאים3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השמנת יתר, תפקוד מטבולי אחר יכול לשנות משמעותית את תפקוד רקמת שומן ואת microenvironment שלו, אשר כולל אך אינו מוגבל להגדלה של adipocytes, חדירה של תאים דלקתיים (למשל, macrophages), ותפקוד כלי הדם3.
טכניקות מורפולוגי שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosectioning להדגים מספר מגבלות ללמוד ביולוגיה אדיפוז כגון שלבי עיבוד כימי ממושך, אשר יכול להוביל רקמות הצטמקות ומבנה עיוות3, 4. יתר על כן, טכניקות 2D אלה אינם מספיקים לקיים אינטראקציות המערכת שהופעל על ידי סוגי תאים שונים, כמו הסעיפים שהושגו מוגבלת לאזורים קטנים יותר של רקמת כולה3. בהשוואה לקונבנציונלי שיטות הדמיה פלורסנט, כולה-הר מכתים אינה דורשת שלבים פולשניים נוספים, כגון הטבעה, חלוקתה, התייבשות; לכן, זה מונע את הבעיה של צמצום נוגדן ירידה לפרטים. ככזו, היא שיטה פשוטה ויעילה עבור הדמיה רקמת שומן, עם שימור טוב יותר של רקמת שומן הכולל מבנה5ומורפולוגיה adipocyte. לכן, כל הר מכתים כל טכניקה מהירה וזולה immunolabeling הוקם כדי לשמר את רקמת שומן ארכיטקטורה תלת-ממד1,6,7,8.
עם זאת, למרות שימור רקמת שומן מורפולוגיה עם השימוש כולה-הר מכתים, טכניקה זו היא עדיין מסוגלים לדמיין את המבנים הפנימיים מתחת לפני השטח השומנים של הרקמה. מספר האחרונות מחקרים9,10 הקימו רקמות ניקוי טכניקות בשילוב עם1,כולה-הר immunolabeling6 כדי לאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה בתוך רקמת שומן. בפרט, רשתות עצביות, להערכת צפופה היו דמיינו האחרונות מחקרים9,10,11,12 עם הדמיה תלת-ממדי. אכן, לומד את פלסטיות עצבית ואת כלי הדם של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים שונים חיוני ללמוד ביולוגיה שלה. מאופשר Immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של ניקוי רקמות איברים הממס-והפנים (iDISCO +) הוא תהליך מורכב של מתנול קדם טיפול, immunolabeling, וניקוי של רקמת opaqueness עם ריאקטיבים כימיים אורגניים דיכלורומתאן (DCM ) ו dibenzyl (אנגלית) אתר13,14. על ידי ביצוע של רקמת שומן שקוף לחלוטין, ייצוג מדויק יותר של האנטומיה בתוך רקמת הדם ו סיבים עצביים ניתן להשיג9,10. IDISCO + יש יתרונות בכך שהוא תואם נוגדנים שונים,11,כתבים פלורסנט14, זה הוכיח הצלחה איברים מרובים, אפילו embryoes14. עם זאת, מגבלה הראשי שלה הוא זמן דגירה ארוך, שבו 18-20 ימים יש צורך להשלים את הניסוי כולו.
יישום חשוב נוסף של צביעת כולה-הר הוא הפריט החזותי של גורל בשילוב עם מערכת מעקב אחר שושלת היוחסין. מעקב אחר שושלת היוחסין היא תוויות של הגן/סמן ספציפי בתא ניתן להעביר כל התאים הבת, כולו מעל הזמן15. ככזה, הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לקבוע את גורלו של רומא התא15. מאז שנות ה-90, המערכת רקומביננטי Cre-LoxP הפכה בגישה רב-עוצמה עבור מעקב אחר שושלת היוחסין חי אורגניזמים15. כאשר קו העכבר המבטאת Cre, אנזים recombinase ה-DNA, הוא חצה עם קו אחר העכבר לבטא כתב הסמוכה לרצף loxP-עצור-loxP, החלבון הכתב הוא ביטוי15.
עבור כל-הר מכתים, השימוש של כתבים ססגוניות פלורסנט מתאים הדמיה של רקמת שומן, כי זה מאפשר התערבות מינימלית עם פעילויות תאיים של adipocyte ה-16. עם זאת, כתבים מסורתיים בדרך כלל כתם הציטופלסמה, ולכן קשה לאתר את שושלת היוחסין של לבן adipocytes, אשר מוגבלת תוכן cytoplasmic17. כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש של קרום מכורך פלורסנט tdTomato/ממברנה eGFP (mT/מ ג) כתב סמן הוא כלי אידיאלי. TdTomato, ממוקדות ממברנה מתבטא Cre-שלילי תאים18. על כריתה Cre, לעבור הביטוי של eGFP, ממוקדות ממברנה מתרחש, שהופך את הכתב מתאים לאתר את שושלת היוחסין של adipocyte אבות17,18 (איור משלים 1).
מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט עבור כל-הר מכתים ולהראות איך זה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות ללמוד פיתוח, הפיזיולוגיה של רקמת שומן. שתי דוגמאות של יישומים שמתואר פרוטוקול זה הם השימוש עם הכתב 1) ססגוניות קווים העכבר כדי לזהות את המקורות השונים של adipocytes ו- 2) רקמת ניקוי להמחיש עוד יותר את arborization עצבית של שומן לבן (וואט).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

רקמת שומן הוא איבר חשוב מטבולית עם פלסטיות גבוה, והוא מגיב לגירויים סביבתיים, מזין מעמד. ככזה, טכניקות שונות פותחו כדי ללמוד על מורפולוגיה וביולוגיה של רקמת שומן. עם זאת, שיטות הדמיה קונבנציונאלי מוגבלות ללמוד את הרקמה בסעיפים 2D, נכשל ללכוד את הארכיטקטורה תלת-ממד של האיבר כולו. כאן אנו מציגים כולה-הר מכתים, שיטה אימונוהיסטוכימיה ששומרת מורפולוגיה רקמת שומן ללא פגע עם שלבי עיבוד מינימלי. לפיכך, המבנים של adipocytes ורכיבים אחרים התאית נשמרים ללא עיוות, השגת את קנאס לוויזואליזציה תלת-ממדית של הרקמה. בנוסף, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם שושלת היוחסין שיטות מעקב כדי לקבוע החלטות גורל התא. עם זאת, טכניקה זו יש כמה מגבלות לספק מידע מדויק לגבי בחלק העמוק של רקמת שומן. כדי להתגבר על מגבלה זו, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם עוד רקמות ניקוי טכניקות כדי להסיר את opaqueness של רקמת ולאפשר הדמיה מלאה של אנטומיה כולה רקמת שומן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות. לכן, רזולוציה גבוהה יותר וייצוג מדויקת יותר של רקמת שומן מבנים ניתן ללכוד עם השילוב של טכניקות אלה.

בשל השבריריות של רקמת שומן, שיטות המערבים מספר שלבי עיבוד, חלוקתה יכול להוביל עיוות של רקמת שומן מורפולוגיה3 (איור 1 א'). עם זאת, כולה-הר מכתים ניתן לשמור על המורפולוגיה של adipocytes, הבטחת לפירוש מדויק של תוצאות (איור 1B).
קיבוע יתר של רק?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של השומן, כגון כיצד אינטראקציות בין תאיות ופיזיולוגיה של רקמת שומן משתנות על תנאים מטבוליים שונים כגון צום והשמנת יתר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא שומרת באופן אופטימלי על מבנה ה- 3D המקורי של השם ונמנעת מצעדי עיבוד ארוכים הנדרשים בדרך כלל עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך המבנה של רקמת השומן, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות איברים אחרות, כגון מערכת העצבים, על ידי הר שלם מכתים את המוח.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקשיים להשיג אתרי רקמת רכוש, מציאת תקופת הקיבוע הנכונה, ואת ריכוזי הנוגדנים האופטימליים. לאחר השלמת הניתוח, מעבירים את המנה המכילה את דגימות הרקמה בפרפורמלדהיד של 1% מהקרח לטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן להעביר את הרקמות או 12 או 24 גם צלחת תאים לכביסה מהירה יותר.חשוב לזכור כי הליך הכתם של כל ההר חייב להתחיל מיד לאחר הניתוח, כי אין נקודות השהיה בין כל שלב. לשטוף את הרקמות עם PBS-0.3T על שייקר מוטה ב 22 מעלות עם מהירות בין 20 ל 25 הטיות לדקה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.לאחר מכן, הוסף כ- 0.5 למיליליטר אחד של חיץ חסימה המכיל 5% סרום בעלי חיים. הדגירה את הצלחת על שייקר באמצעות התנאים הקודמים במשך שעה אחת. שאפו את פתרון החסימה, והוסיפו מיליליטר של נוגדנים ראשוניים מדוללים ב-PBS-0.3T עם 1% סרום לבעלי חיים לכל באר.הדגירה את הצלחת לילה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס עם הטיה של 22 מעלות ומהירות של 20 עד 25 הטיות לדקה. למחרת, להשתמש PBS-0.3T לשטוף את הרקמות בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים נוספות.לאחר מכן, הוסיפו בין 0.5 למיליליטר של פתרונות נוגדנים משניים מתאימים ומדוללים לכל באר. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים אותה על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS-0.3T בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לכל לשטוף.אם יש צורך בהדמיה של טיפות נוזליות במהלך כתם השומנים הניטרלי, יש לשטוף פעמיים עם 1x PBS כאשר כל שטיפה נמשכה חמש דקות. מוסיפים את כתם השומנים הניטרלי מדולל ב- PBS, ומדגרים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. כדי להתחיל הדמיה, להשתמש במטלפות להניח את הרקמה שטוחה על 24 על ידי 60 מילימטר כיסוי זכוכית להחליק.אם רצוי כתמי גרעינים עם DAPI, הוסף טיפה אחת עד שתי טיפות של מדיום הרכבה המכיל DAPI כדי להטביע לחלוטין את הרקמה ולמנוע ממנה להתייבש. לאחר מכן, מקם את השקופית על מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקל הפוכה. כדי לקבל תמונות של רקמה מוכתמת כולה במישורי מוקד מרובים, בצע ערימות Z של 100 עד 150 מיקרומטר לעומק עם גודל צעד של ארבעה עד שישה מיקרומטרים בהגדלה הרצויה.במחקר זה, כתמים בהר שלם משמשים לשימור ארכיטקטורת רקמת שומן. שלא כמו שיטות הכרוכות בשלבי עיבוד מרובים וקטעים, אשר יכול להוביל עיוות של מורפולוגיה רקמת השומן, שיטת הכתם כל הר יכול לשמר את המורפולוגיה של adipocytes, הבטחת דיוק בעת פרשנות תוצאות. overfixation של רקמת שומן מוביל פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי תיקון, אשר ניתן לציין על ידי אזורים זהים חופפים, כגון טירוסין הידרוקסילאז ו PECAM-1 אותות לראות כאן.עם זאת, דגימות כתם קבועות כמו שצריך, שלם-הרכבה, מציגות אותות נפרדים ומובחנים, המציינים כי אותות אלה אינם שפעת אוטומטית. הדמיית רקמת שומן מוכתמת בהר שלם מאפשרת כימות של שינויים מורפולוגיים בתנאים ניסיוניים שונים. בפרט, רקמת שומן הוא vascularized מאוד, אשר חשוב לתווך הונוסטזיס מטבולי על שינויים מהירים ברמת האנרגיה.לדוגמה, עכברי C57 שחורים 6J, שעוברים 24 שעות של צום, מציגים גודל adipocyte קטן משמעותית, אשר מצביע על lipolysis, מגמה בצפיפות כלי דם גבוהה בהשוואה לעכברים המוזנים ברציפות. ניקוי רקמות שומן עם iDISCO+מאפשר לרקמות השומן להיות שקופות אופטית. Immunolabeling של רקמת שומן שעבר ניקוי רקמות מראה ארבוריזציה עצבית צפופה הרבה יותר בהשוואה לזה שנצפה בכתמים בהר שלם ללא ניקוי רקמות באותה הגדלה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא overfix הדגימות שלך במשך יותר משעה בטמפרטורת החדר PFA, אחרת, זה יגדיל את שפעת אוטומטית ברקע. עם זאת, תקופת קיבוע זו יכולה להיות ממושכת אם דגימות קבועות בארבע מעלות צלזיוס. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כימות באמצעות ImageJ, ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו איך ארכיטקטורה הסלולר, כגון אתרי adipocyte וצפיפות כלי הדם, לשנות בתגובה לתנאים פיזיולוגיים שונים.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...