Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

यह काम कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC), बंटिंग एंड बेस्ट डायबिटीज सेंटर (BBDC) के पायलट और व्यवहार्यता अध्ययन अनुदान, SickKids स्टार्ट-अप फंड से एच-कश्मीर तक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. एस., मेडिकल रिसर्च सेंटर प्रोग्राम (2015R1A5A2009124) कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के माध्यम से वित्त पोषित विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना के लिए जम्मू-आर. के.

सभी प्रायोगिक पशु प्रोटोकॉल जानवरों की देखभाल पर कनाडा परिषद के मानकों के अनुरूप Phenogenomics (टीसीपी) के लिए केंद्र की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । चूहों 12-h प्रकाश/अंधेरे चक्र पर बनाए रखा गया थ?...

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हालांकि ऐसे प्रोटोकॉल और cryosection intracellular संरचना, पूरे-धुंधला माउंट के लिए प्रस्ताव लाभ के रूप में पारंपरिक तकनीक वसा ऊतक अनुसंधान, जो सेलुलर के 3 डी दृश्य में सक्षम बनाता है में एक अलग परिप्रेक्ष्य प्रदान करत...

वसा ऊतक ऊर्जा भंडारण के लिए एक आवश्यक अंग है और गतिशील पुननिर्माण और लगभग असीमित विस्तार1की विशेषता है । ऊर्जा homeostasis के अलावा, वसा ऊतक भी पूरे शरीर चयापचय समारोह2मिलाना करने के लिए ५० से अधिक adipokines के हार्मोन स्राव में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । वसा ऊतक एक विविध वास्तुकला परिपक्व adipocytes, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और adipocyte जनक कोशिकाओं3सहित विभिन्न प्रकार के सेल के शामिल है । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि मोटापा और अंय चयापचय रोग काफी वसा ऊतक समारोह और उसके microenvironment है, जो भी शामिल है बदल सकते हैं, लेकिन adipocytes की वृद्धि तक ही सीमित नहीं है, भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ (जैसे, मैक्रोफेज), और संवहनी रोग3.
इस तरह के प्रोटोकॉल और cryosectioning के रूप में पारंपरिक रूपात्मक तकनीक वसा जीव विज्ञान जैसे लंबा रासायनिक प्रसंस्करण कदम है, जो ऊतक संकोचन और संरचना विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अध्ययन में कई सीमाएं प्रदर्शित करता है3, 4. इसके अलावा, इन 2 डी तकनीक अलग सेल प्रकार द्वारा लागू सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए अपर्याप्त हैं, के रूप में प्राप्त वर्गों पूरे3ऊतक के छोटे क्षेत्रों तक ही सीमित हैं । फ्लोरोसेंट इमेजिंग के पारंपरिक तरीकों की तुलना में, पूरे-धुंधला दाग ऐसे embedding, अनुभाग, और निर्जलीकरण के रूप में अतिरिक्त इनवेसिव कदम, की आवश्यकता नहीं है; इस प्रकार, यह एंटीबॉडी विशिष्टता कम की समस्या से बचा जाता है । जैसे, यह इमेजिंग वसा ऊतक के लिए एक सरल और कुशल विधि है, adipocyte आकृति विज्ञान और समग्र वसा ऊतक संरचना5के बेहतर संरक्षण के साथ । इसलिए, पूरे-एक त्वरित और सस्ती immunolabeling तकनीक के रूप में धुंधला माउंट वसा ऊतक 3 डी वास्तुकला1,6,7,8के संरक्षण के लिए स्थापित किया गया था ।
हालांकि, पूरे-माउंट धुंधला के उपयोग के साथ वसा ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के बावजूद, इस तकनीक अभी भी ऊतक के लिपिड सतह के नीचे भीतरी संरचनाओं कल्पना करने में असमर्थ है । कई हाल के अध्ययन9,10 पूरे-माउंट immunolabeling1,6 वसा ऊतक के भीतर व्यापक 3 डी दृश्य के लिए अनुमति देने के साथ संयुक्त ऊतक समाशोधन तकनीक की स्थापना की है । विशेष रूप से, घने तंत्रिका और vasculature नेटवर्क हाल ही में अध्ययन में visualized थे9,10,11, 3 डी मात्रा इमेजिंग के साथ । वास्तव में, विभिंन शारीरिक स्थितियों के तहत वसा ऊतक के तंत्रिका और संवहनी प्लास्टिक का अध्ययन करने के लिए अपने जीव विज्ञान की पढ़ाई जरूरी है । Immunolabeling-सक्षम तीन आयामी विलायक-खाली अंगों की इमेजिंग (iDISCO +) ऊतक समाशोधन एक प्रक्रिया है मेथनॉल पूर्व उपचार, Immunolabeling के शामिल है, और जैविक रासायनिक रिएजेंट के साथ ऊतक अपारदर्शीता के समाशोधन dichloromethane (डीसीएम ) और dibenzyl ईथर (DBE)13,14. वसा ऊतक पूरी तरह से पारदर्शी बनाने के द्वारा, रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के रूप में ऊतक के भीतर शरीर रचना विज्ञान के एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व9,10प्राप्त किया जा सकता है । IDISCO + में है कि यह विभिंन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट11,14पत्रकारों के साथ संगत है लाभ है, और यह कई अंगों और यहां तक कि14भ्रूण में सफलता का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इसकी मुख्य सीमा एक लंबी मशीन का समय है, जिसमें 18 से 20 दिन पूरे प्रयोग को पूरा करने के लिए आवश्यक हैं ।
पूरे की एक और महत्वपूर्ण आवेदन-धुंधला माउंट एक वंश अनुरेखण प्रणाली के साथ संयोजन में सेल भाग्य का दृश्य है । वंश अनुरेखण एक विशिष्ट जीन के लेबल है कि सभी बेटी कोशिकाओं पर पारित किया जा सकता है और15समय के साथ संरक्षित है एक सेल में मार्कर/। जैसे, यह एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक कोशिका की संतान15के भाग्य का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 1990 के दशक के बाद से, Cre-LoxP रिकॉमबिनेंट प्रणाली15जीवों रहने में वंश अनुरेखण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया है । जब एक माउस लाइन कि Cre, एक डीएनए recombinase एंजाइम व्यक्त करता है, एक और माउस एक रिपोर्टर है कि एक loxP-रोक-loxP अनुक्रम के निकट है व्यक्त लाइन के साथ पार कर रहा है, रिपोर्टर प्रोटीन15व्यक्त की है ।
पूरे-धुंधला माउंट के लिए, फ्लोरोसेंट बहुरंगा पत्रकारों का उपयोग वसा ऊतक की इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, क्योंकि यह adipocyte16के intracellular गतिविधियों के साथ ंयूनतम हस्तक्षेप के लिए अनुमति देता है । हालांकि, पारंपरिक संवाददाताओं आम तौर पर कोशिका द्रव्य दाग, यह मुश्किल सफेद adipocytes, जो cytoplasmic17सामग्री सीमित है की वंश का पता लगाने के लिए बना । इस समस्या को दूर करने के लिए, झिल्ली के प्रयोग से बंधे फ्लोरोसेंट tdTomato/झिल्ली eGFP (mT/मिलीग्राम) रिपोर्टर मार्कर एक आदर्श उपकरण है । झिल्ली-लक्षित tdTomato Cre-नकारात्मक कोशिकाओं18में व्यक्त की है । Cre उत्पाद पर, झिल्ली की अभिव्यक्ति के लिए एक स्विच-लक्षित eGFP होता है, इस रिपोर्टर adipocyte progenitors17,18 (अनुपूरक चित्रा 1) की वंशावली अनुरेखण के लिए उपयुक्त बना ।
इस कागज के उद्देश्य के लिए पूरे के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल-धुंधला और दिखाने के लिए यह कैसे अंय तकनीकों के साथ संयुक्त किया जा सकता है के विकास और वसा ऊतक फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए प्रदान करना है । इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुप्रयोगों के दो उदाहरण के साथ इसके उपयोग कर रहे है 1) बहुरंगा रिपोर्टर माउस लाइनों को adipocytes और 2 के विभिंन मूल की पहचान) ऊतक समाशोधन के लिए आगे सफेद वसा ऊतक (वाट) में तंत्रिका arborization कल्पना ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

वसा ऊतक उच्च प्लास्टिक के साथ एक महत्वपूर्ण चयापचय अंग है और पर्यावरण उत्तेजनाओं और पोषक तत्वों की स्थिति के लिए उत्तरदायी है । जैसे, विभिंन तकनीकों वसा ऊतक विज्ञान और जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । हालांकि, पारंपरिक दृश्य विधियों 2d वर्गों में ऊतक का अध्ययन करने के लिए सीमित हैं, पूरे अंग के 3 डी वास्तुकला पर कब्जा करने में विफल । यहाँ हम पूरे-धुंधला माउंट, एक immunohistochemistry विधि है कि न्यूनतम प्रसंस्करण कदम के साथ बरकरार वसा ऊतक आकृति विज्ञान संरक्षित करता है उपस्थित । इसलिए, adipocytes और अंय सेलुलर घटकों की संरचनाओं विरूपण के बिना बनाए रखा, ऊतक के सबसे प्रतिनिधि 3 डी दृश्य प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, पूरे माउंट धुंधला वंश अनुरेखण तरीके सेल भाग्य निर्णय निर्धारित करने के साथ जोड़ा जा सकता है । हालांकि, इस तकनीक वसा ऊतक के गहरे भागों के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करने के लिए कुछ सीमाएं हैं । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, पूरे-धुंधला आगे ऊतक समाशोधन तकनीक के साथ संयुक्त करने के लिए ऊतक की अपारदर्शी हटाने और पूरे वसा ऊतक शरीर रचना विज्ञान के पूर्ण दृश्य के लिए अनुमति प्रकाश-पत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सकते हैं । इसलिए, एक उच्च संकल्प और वसा ऊतक संरचनाओं के अधिक सटीक प्रतिनिधित्व इन तकनीकों के संयोजन के साथ कब्जा किया जा सकता है ।

वसा ऊतक की कमजोरी के कारण, कई प्रसंस्करण कदम और खंड शामिल तरीकों वसा ऊतक आकृति विज्ञान3 (आंकड़ा 1a) के विरूपण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, पूरे-माउंट धुंधला adipocytes की आकृति विज्ञा...

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

वर्तमान अध्ययन का ध्यान वसा ऊतक वास्तुकला और सेलुलर घटक के 3 डी इमेजिंग के लिए एक आदर्श विधि के रूप में पूरे माउंट immunostaining और दृश्य तकनीक का प्रदर्शन है ।

3 डी सफेद वसा ऊतक संरचना के दृश्य का उपयोग कर पूरे माउंट धुंधला

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

यह विधि आदिपोज जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि कैसे इंटरसेलुलर इंटरैक्शन और एडीपोज ऊतक शरीर विज्ञान उपवास और मोटापे जैसी विभिन्न मेटाबोलिक स्थितियों पर बदलते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह मूल एडीपोज 3 डी संरचना को बेहतर ढंग से संरक्षित करता है और पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए आमतौर पर आवश्यक लंबे प्रसंस्करण चरणों से बचाता है। यद्यपि यह विधि आदिपोस ऊतक की संरचना में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन मस्तिष्क को पूरे माउंट धुंधला करके, तंत्रिका तंत्र जैसे अन्य अंग प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है।आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति संपत्ति ऊतक साइटों को प्राप्त करने में कठिनाइयों, उचित निर्धारण अवधि और इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता खोजने के कारण संघर्ष करेंगे। विच्छेदन पूरा होने के बाद, एक घंटे के लिए बर्फ से कमरे के तापमान में 1% पैराफॉर्मलडिहाइड में ऊतक नमूनों युक्त पकवान स्थानांतरित करें। फिर ऊतकों को जल्दी धोने के लिए या तो 12 या 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें।यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि पूरे माउंट धुंधला प्रक्रिया विच्छेदन के तुरंत बाद शुरू करना चाहिए और प्रत्येक चरण के बीच कोई ठहराव अंक नहीं हैं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 और 25 झुकाव प्रति मिनट के बीच एक गति के साथ 22 डिग्री पर झुका एक शेखर पर PBS-0.3T के साथ ऊतकों को धोएं । इस धो को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।इसके बाद, 5% पशु सीरम युक्त बफर को अवरुद्ध करने के लगभग 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। एक घंटे के लिए पिछली स्थितियों का उपयोग कर एक शेखर पर थाली इनक्यूबेट। अवरुद्ध समाधान को एएसपिरेट करें, और प्रत्येक कुएं में 1% पशु सीरम के साथ पीबीएस-0.3T में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के मिलीलीटर पर जोड़ें।थाली को रात भर एक शेकर पर चार डिग्री सेल्सियस पर 22 डिग्री के झुकाव और प्रति मिनट 20 से 25 झुकाव की गति के साथ इनक्यूबेट करें । अगले दिन, पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊतकों को धोने के लिए पीबीएस-0.3T का उपयोग करें। इस धो को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से उपयुक्त और पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 और एक मिलीलीटर के बीच जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में थाली लपेटें और यह एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक शेखर पर इनक्यूबेट । इसके बाद, प्लेट को दो बार पीबीएस-0.3T के साथ कमरे के तापमान पर पांच मिनट प्रति धोने के लिए धोएं।यदि तटस्थ लिपिड दाग के दौरान तरल बूंदों के दृश्य की आवश्यकता होती है, तो पांच मिनट तक चलने वाले प्रत्येक धोने के साथ 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं। PBS में पतला तटस्थ लिपिड दाग जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट । इमेजिंग शुरू करने के लिए, 60 मिलीमीटर ग्लास कवर स्लिप द्वारा 24 पर ऊतक फ्लैट बिछाने के लिए संदंश का उपयोग करें।यदि डीएपीआई के साथ नाभिक धुंधला वांछित है, तो एक बढ़ते माध्यम की एक से दो बूंदें जोड़ें जिसमें ऊतक को पूरी तरह से जलमग्न करने और इसे सूखने से रोकने के लिए DAPI शामिल है। इसके बाद स्लाइड को उल्टे कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप सिस्टम पर रखें। कई फोकल विमानों पर पूरे माउंट दाग ऊतक की छवियों को प्राप्त करने के लिए, वांछित आवर्धन पर चार से छह माइक्रोमीटर के कदम आकार के साथ गहराई में 100 से 150 माइक्रोमीटर के जेड स्टैक प्रदर्शन करते हैं।इस अध्ययन में, पूरे माउंट धुंधला ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कई प्रसंस्करण चरणों और खंडों को शामिल करने वाले तरीकों के विपरीत, जिससे एडीपोज ऊतक आकृति विज्ञान का विरूपण हो सकता है, पूरे माउंट धुंधला विधि आदिपोसाइट्स की आकृति विज्ञान को संरक्षित कर सकती है, परिणामों की व्याख्या करते समय सटीकता सुनिश्चित कर सकती है। एडिपोस ऊतक के अतिसत्पारण से फिक्सेटिव-प्रेरित फ्लोरेसेंस होता है, जिसे समान क्षेत्रों को ओवरलैप करके इंगित किया जा सकता है, जैसे कि टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज़ और पेकैम-1 संकेतों में यहां देखा जाता है।ठीक से तय, पूरे माउंट दाग नमूने, हालांकि, अलग और अलग संकेत दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि ये संकेत ऑटोफ्लोरेसेंस नहीं हैं। इमेजिंग पूरे माउंट दाग आदिपोज ऊतक विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में रूपात्मक परिवर्तनों की मात्रा के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, एडीपोज ऊतक अत्यधिक संवहनी है, जो ऊर्जा स्तर में तेजी से परिवर्तन पर मेटाबोलिक होमोसेस्टेसिस मध्यस्थता में महत्वपूर्ण है।उदाहरण के लिए, C57 काले 6J चूहों, जो उपवास के 24 घंटे से गुजरते हैं, एक काफी छोटे एडीपोसाइट आकार को प्रदर्शित करते हैं, जो लिपोलिसिस को इंगित करता है, और लगातार खिलाए गए चूहों की तुलना में ऊंचा रक्त वाहिका घनत्व में एक प्रवृत्ति। iDISCO + के साथ एडिपोस ऊतकों को साफ करने से एडीपोज ऊतक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी हो जाते हैं। ऊतक समाशोधन के माध्यम से चले गए एडिपोस ऊतकों की इम्यूनोलबेलिंग एक ही आवर्धन पर ऊतक समाशोधन के बिना पूरे माउंट धुंधला में मनाया की तुलना में बहुत सघन तंत्रिका arborization से पता चलता है ।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, पीएफए में कमरे के तापमान पर एक घंटे से अधिक समय तक अपने नमूनों को ओवरफिक्स न करना याद रखना महत्वपूर्ण है, अन्यथा, इससे पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि होगी। हालांकि, अगर नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर तय किया जाता है तो यह निर्धारण अवधि लंबे समय तक हो सकती है । इस प्रक्रिया के बाद, इमेजजे का उपयोग करके क्वांटिफिकेशन जैसे अन्य तरीकों को अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि कैसे सेलुलर वास्तुकला, जैसे एडिपोसिट साइटें और रक्त वाहिका घनत्व, विभिन्न शारीरिक स्थितियों के जवाब में बदलते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

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Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

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