Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
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이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 캐나다, 조종사 및 타당성 연구 그랜트 밴팅 최고의 당뇨병 센터 (BBDC), H.에 SickKids 시작 기금에서 교부 금에 의해 투자 되었다 미, 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신와 J R.K. 미래 계획

Phenogenomics (TCP) 동물 관리에 캐나다 위원회의 표준 준수에 대 한 모든 실험 동물 프로토콜 센터의 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 명암 주기 12 h에 유지 하 고 물과 음식에 대 한 무료 액세스와 함께 제공 했다. 7 달 오래 된 C57BL/6J 남성 쥐 전체 마운트 착 실험에 사용 되었다.
참고: 섹션 1 ~ 2 시간 순서 대로, 섹션 3 직후에 제 1 단계는 선택적 되 고 있습니다. 제 4 ?...

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조직학 및 cryosection 같은 기존의 기술을 세포내 구조를 관찰에 대 한 혜택을 제공, 지방 조직 연구, 세포의 3 차원 시각화를 가능 하 게 다른 관점을 제공 합니다 전체 마운트 얼룩 최소한 처리 조직의 아키텍처입니다.
성공적으로 전체 마운트 얼룩을 수행 하기 위해 다음 제안 사항은 고려 사항으로 취해야 한다. 다른 지방 조직 창 고 수 결과가 다양 한 immunostaining; 따라서, 지?...

지방 조직 에너지 저장에 대 한 필수적인 장기 이며 동적 개장 및 거의 무제한 확장1특징 이다. 에너지 항상성, 지방 조직 또한 담당 한다 필수적인 역할 50 adipokines2전체 신체 신진 대사 기능 조절 하는 호르몬 분 비에. 지방 조직 성숙 adipocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 면역 세포, 및 체형 조상 세포3를 포함 하 여 다양 한 세포 유형의 다양 한 아키텍처 구성 하고있다. 최근 연구는 비만 다른 대사 장애 크게 변경할 수 지방 조직 기능 및 그것의 microenvironment, 포함 하지만 adipocytes, 염증 세포의 침투의 확대에 국한 되지 않습니다 (예: 대 식 세포), 및 관 역 기능3.
조직학, cryosectioning 등 기존의 형태학 기법 설명 조직 수축 및 구조 왜곡3로 이어질 수 있는 긴 화학 처리 단계와 같은 많은 생물학을 공부 하 고 몇 가지 제한 4. 또한, 이러한 2D 기술을 얻은 섹션은 전체 조직을3의 작은 지역에 한정 된 다른 세포 유형에 의해 발휘 된 세포 상호 작용을 관찰 충분 하지 않습니다. 기존에 비해 형광 이미징 방법, 전체 마운트 얼룩 단계가 필요 없습니다 추가 침략, 등 포함, 단면, 탈수; 따라서,이 항 체 특이성을 감소의 문제를 방지 합니다. 이와 같이, 체형 형태 및 전반적인 지방 조직 구조5의 더 나은 보존 이미징 지방 조직에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법입니다. 따라서, 전체 마운트 얼룩으로 신속 하 고 저렴 한 immunolabeling 기법 지방 조직 3D 아키텍처1,6,,78을 유지 하기 위해 설립 되었다.
그러나, 전체 마운트 얼룩의 사용과 지방이 많은 직물 형태학의 보존에도 불구 하 고이 기술은 조직의 지질 표면 아래 내부 구조 시각화 수 아니다. 몇몇 최근 연구9,10 조직 지방 조직 내에서 포괄적인 3D 시각화 수 있도록 전체 마운트 immunolabeling1,6 와 결합 하는 기법을 삭제를 설립 했다. 특히, 조밀한 신경 및 맥 관 구조 네트워크 최근 연구9,10,,1112 3D 볼륨 영상과 시각화 했다. 실제로, 다른 생리 적인 조건 하에서 지방 조직의 신경 및 혈관 소성을 공부 하 고 그것의 생물학을 공부 필수적 이다. 솔벤트 허가 기관 (iDISCO +) 조직 비운의 3-차원 영상 Immunolabeling 사용은 비운의 유기 화학 시 약 dichloromethane (DCM와 불투명 함 조직 그리고 메탄올 전처리, immunolabeling의 구성 과정 )와 dibenzyl 에테르 (DBE)13,14. 지방 조직을 투명 하 게 함으로써, 혈관과 신경 섬유 등 조직 내의 해부학의 더 정확한 표현9,10얻을 수 있습니다. IDISCO + 장점이 그것은 다양 한 항 체와 형광 기자11,14, 그리고 여러 장기와 심지어 embryoes14에서 성공을 보여주었다. 그러나, 그것의 주요 제한은 있는 18 ~ 20 일 전체 실험을 완료 하는 데 필요한 긴 보육 시간입니다.
전체 산 얼룩의 또 다른 중요 한 응용 프로그램 계보 추적 시스템와 함께에서 셀 운명의 시각화 이다. 계보 추적 모든 딸 세포에 전달 될 수 있다 고15시간 이상 보존 하는 셀에는 특정 유전자/마커 라벨입니다. 따라서, 셀의 자손15의 운명을 결정 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 1990 년대 이후, Cre LoxP 재조합 시스템 생활의 혈통 추적에 대 한 강력한 접근 되고있다 유기 체15. Cre, DNA recombinase 효소를 표현 하는 마우스 선을 loxP-정지-loxP 시퀀스에 인접 한 기자를 표현 하는 다른 마우스 라인 넘은, 기자 단백질 표현된15입니다.
전체-마운트 얼룩에 대 한 형광 색 기자 들의 사용은 세포내 활동 체형16의 최소한의 간섭에 대 한 허용 하기 때문에 지방이 많은 직물의 이미징 적합 합니다. 그러나, 전통적인 기자는 일반적으로 제한 된 세포질 콘텐츠17흰색 adipocytes의 계보를 추적 하 고 어려운 세포질, 얼룩. 이 문제를 해결 하려면 막 도약 형광 tdTomato/막 eGFP (mT/mG) 기자 마커를 사용 하 여 이상적인 도구입니다. 막-타겟 tdTomato Cre 음수가 셀18로 표시 됩니다. Cre 절단 시 막 대상 eGFP 식 스위치,이 기자 체형 창시자17,18 (보충 그림 1)의 계보를 추적에 대 한 적당 한 만드는 발생 합니다.
이 문서의 목적은 전체 마운트 얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 결합 하 수 다른 기술을 개발 및 지방이 많은 직물의 생리학을 공부 하는 방법을 보여 것입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 응용 프로그램의 두 가지 예는 1) 멀티 컬러 기자 마우스 라인 adipocytes 2) 조직 흰색 adipose 조직 (WAT)에 신경 arborization 추가 시각화를 비운의 다양 한 출처를 식별 하는 사용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

지방이 많은 직물은 높은 소성으로 중요 한 변화 기관 이다 이며 환경 자극 및 영양 상태에 반응. 따라서, 다양 한 기법 형태학 및 지방이 많은 직물의 생물학 연구 개발 되었습니다. 그러나, 기존의 시각화 방법을 공부 전체 기관의 3D 아키텍처를 캡처를 2D의 섹션에서 조직으로 제한 됩니다. 여기에 우리가 전체-마운트 현재 얼룩, 최소한의 처리 단계를 그대로 지방 조직 형태를 유지 하는 immunohistochemistry 메서드. 따라서, adipocytes 및 다른 세포 구성 성분의 구조는 조직의 가장 대표적인 3D 시각화를 달성 하는 왜곡 없이 유지 됩니다. 또한, 전체 마운트 얼룩 세포 운명 결정을 결정 하는 계보 추적 방법 결합할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지방이 많은 직물의 더 깊은 부분에 관한 정확한 정보를 제공 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 한계를 극복 하기 위해 전체 산 얼룩이 지 수 추가와 결합 될 조직 기법 조직의 불투명 함 제거 하 고 빛-시트 형광 현미경을 사용 하 여 전체 지방 조직 해부학의 완전 한 시각화에 대 한 허용을 삭제. 따라서, 더 높은 해상도 지방 조직 구조의 더 정확한 표현을 이러한 기술의 조합으로 캡처할 수 있습니다.

지방이 많은 직물의 취약성 때문 방법 여러 처리 단계를 포함 하 고 단면 지방 조직 형태3 (그림 1A)의 외관을 손상 될 수 있습니다. 그러나, 전체 마운트 얼룩 adipocytes, 결과 (그림 1B)의 정확한 해석을 보장의 형태를 보존할 수 있습니다.
지방 조직의 과잉 고정 정착 액을 이용한 autofluorescence 이끌어 낸다. <strong class=...

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

이 방법은 세포 간 상호 작용과 지방 조직 생리학이 금식과 비만과 같은 다른 신진 대사 조건에 어떻게 변화하는지와 같은 지방 생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원래 지방 3D 구조를 최적으로 보존하고 통상적인 면역 조직 화학에 일반적으로 필요한 긴 처리 단계를 피한다는 것입니다. 이 방법은 지방 조직의 구조에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 뇌를 염색 하는 전체 마운트에 의해 신경계와 같은 다른 장기 시스템에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 속성 조직 사이트를 얻기에 어려움 때문에 투쟁 할 것 이다, 적절 한 고정 기간을 찾는, 그리고 최적의 항체 농도. 해부가 완료된 후, 1시간 동안 얼음에서 실온으로 1%파라포름알데히드에 티슈 샘플을 함유한 접시를 옮는다. 그런 다음 조직을 12 또는 24웰 세포 배양 판으로 이송하여 더 빠른 세척을 합니다.전체 마운트 염색 절차는 해부 직후에 시작해야 하며 각 단계 사이에 일시 중지 점이 없다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. PBS-0.3T로 티슈를 22도기울어실온에서 분당 20~25°C의 속도로 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.그 후, 5%의 동물 혈청을 포함하는 블로킹 버퍼의 약 0.5~1밀리리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 셰이커에 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 차단 용액을 흡습하고 PBS-0.3T에서 희석된 1차 항체의 밀리리터를 각각 1%의 동물 혈청으로 첨가한다.22도의 기울기와 분당 20 ~25 기울기의 속도로 4 섭씨에서 셰이커에 밤새 접시를 배양. 다음 날 PBS-0.3T를 사용하여 실온에서 5 분 동안 조직을 씻으실 수 있습니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.그런 다음, 각각의 우물에 적절하고 희석된 이차 항체 솔루션의 0.5 와 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 감싸고 실온에서 셰이커에 1시간 동안 배양합니다. 그 후 실온에서 PBS-0.3T로 플레이트를 2회 세척하여 세척당 5분간 세척합니다.중성 지질 얼룩 중에 액체 방울의 시각화가 필요한 경우, 5 분 동안 지속 각 세척1x PBS로 두 번 세척하십시오. PBS에서 희석된 중성 지질 얼룩을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이미징을 시작하려면 집게를 사용하여 조직을 24 x 60mm 유리 커버 슬립에 평평하게 놓습니다.DAPI로 염색하는 핵이 바람직한 경우, 조직을 완전히 침수하고 건조를 방지하기 위해 DAPI를 포함하는 마운팅 매체의 1 ~ 2 방울을 추가합니다. 그런 다음 슬라이드를 반전된 공초점 레이저 현미경 시스템에 배치합니다. 여러 초점 평면에서 전체 마운트 스테인드 조직의 이미지를 얻으려면 원하는 배율에서 4 ~ 6 마이크로 미터의 단계 크기로 깊이 100 내지 150 마이크로미터의 Z 스택을 수행하십시오.이 연구에서는, 전체 탈염 염색은 지방 조직 아키텍처를 보존하기 위하여 이용됩니다. 다중 처리 단계와 단면화를 수반하는 방법과 달리, 이는 지방 조직 형태의 손상으로 이어질 수 있으며, 전체 마운트 염색 방법은 결과를 해석할 때 정확성을 보장하면서 지방 세포의 형태를 보존할 수 있습니다. 지방 조직의 과고착은 고정 유도 형광으로 이어지며, 이는 여기에서 볼 수 있는 티로신 하이드록실라제 및 PECAM-1 신호와 같은 동일한 영역을 겹쳐서 표시될 수 있다.제대로 고정, 전체 마운트 얼룩 샘플, 그러나, 별도의 별개의 신호를 표시, 이러한 신호가 자가 형광이 아니라는 것을 나타내는. 이미징 전체 마운트 스테인드 지방 조직은 다른 실험 조건하에서 형태학적 변화의 정량화를 허용합니다. 특히, 지방 조직은 에너지 레벨의 급격한 변화에 따라 대사 의 항상성을 중재하는 데 중요한 혈관이 높게 조직된다.예를 들어, 24시간의 금식을 겪는 C57 블랙 6J 마우스는 lipolysis를 나타내는 상당히 작은 홍포세포 크기를 표시하고, 지속적으로 공급되는 마우스와 비교할 때 혈관 밀도가 상승하는 추세를 나타낸다. iDISCO+로 지방 조직을 지우면 지방 조직이 광학적으로 투명해질 수 있습니다. 조직 정리를 통해 간 지방 조직의 면역 라벨링은 동일한 배율에서 조직 클리어링없이 전체 마운트 염색에서 관찰된 것에 비해 훨씬 조밀한 신경 절기를 나타낸다.이 절차를 시도하는 동안 PFA의 실온에서 1 시간 이상 샘플을 과대화하지 않는 것이 중요합니다. 그러나 샘플이 섭씨 4도로 고정되면 이 고정 기간이 연장될 수 있습니다. 이 절차에 따라 ImageJ를 이용한 정량화와 같은 다른 방법은 형포 부위 및 혈관 밀도와 같은 세포 구조가 다양한 생리적 조건에 대한 응답으로 변화하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

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Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

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전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...