Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC) Canada, Pilot og mulighetsstudie studier Grant av Banting & beste Diabetes sentrum (BBDC), SickKids oppstart fondet til H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gjennom de National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger å J-RK

Alle eksperimentelle dyr protokoller ble godkjent av dyr omsorg komiteen av The Center for Phenogenomics (TCP) likedannet standarder for kanadiske Rådet for Animal Care. Mus ble opprettholdt på 12-h lys/mørke sykluser og leveres med gratis tilgang til vann og mat. 7 mnd gamle C57BL/6J mannlige mus ble brukt i hele-mount flekker eksperimentet.
Merk: Avsnitt 1 til 2 er i kronologisk rekkefølge, del 3 er et valgfritt trinn rett etter avsnitt 1. Del 4 kan utføres for å analysere adipocyte st...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

Selv om konvensjonelle teknikker som histology og cryosection fordeler for å observere intracellulær struktur, gir hele-mount flekker et annerledes perspektiv i fettvev forskning, som muliggjør 3D-visualisering av mobilnettet arkitekturen av minimalt prosesserte vev.
For å utføre hele-mount flekker, bør følgende forslag tas i betraktning. Forskjellige fettvev depoter kan gi ulike immunostai-resultater; dermed bør av fettvev depot brukes fastsettes først. For eksempel, er brun fettvev ...

Fettvev er et viktig organ for energilagring og er preget av dynamisk ombygging og nesten ubegrenset utvidelse1. I tillegg til energi homeostase spiller fettvev også en viktig rolle i hormon sekresjonen over 50 endotelial å modulere hele kroppen metabolsk funksjon2. Fettvev har en variert arkitektur består av forskjellige celletyper inkludert eldre adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyte stamfar celler3. Nyere studier har vist at fedme og andre metabolsk dysfunksjon kan betydelig endre fettvev funksjon og dens microenvironment, som inkluderer men er ikke begrenset til utvidelse av adipocytter, infiltrasjon av inflammatoriske celler (f.eks makrofager), og vaskulær dysfunksjon3.
Konvensjonelle morfologiske teknikker som histology og og kryosnitt vise flere begrensninger i å studere adipose biologi som lange kjemisk behandling skritt, som kan føre til vev krymping og struktur forvrengning3, 4. Videre er disse 2D teknikkene ikke nok å observere intercellulære interaksjoner utøves av ulike celletyper, som delene innhentet er begrenset til mindre regioner av hele vev3. Forhold til konvensjonelle metoder for fluorescerende bildebehandling, hele-mount flekker ikke krever flere invasiv trinn, som innebygging, skjæring og dehydrering; Dermed unngår dette problemet minskende antistoff spesifisitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for bildebehandling fettvev, med bedre bevaring av adipocyte morfologi og generelle fettvev struktur5. Derfor hele-mount flekker som en rask og rimelig immunolabeling teknikk var etablert fettvev 3D arkitektur1,6,7,8.
Men til tross for bevaring av fettvev morfologi med bruk av hele-mount flekker er denne teknikken fremdeles ikke kan visualisere indre strukturer under lipid overflaten av vev. Flere nyere studier9,10 har etablert vev clearing teknikker kombinert med hele-mount immunolabeling1,6 å gi omfattende 3D-visualisering i fettvev. Spesielt var tett nevrale og blodkar nettverk visualisert i nyere studier9,10,11,12 med 3D-volum imaging. Faktisk er studere nevrale og vaskulær plastisitet av fettvev under ulike fysiologiske forhold viktig å studere sin biologi. Immunolabeling-aktivert tredimensjonale imaging av løsemiddel klarert organer (iDISCO +) vev clearing er en prosess består av metanol forbehandling, immunolabeling, og clearing av vev opaqueness med organisk kjemiske reagenser diklormetan (DCM ) og dibenzyl Eter (DBE)13,14. Ved å gjøre fettvev helt gjennomsiktig, kan en mer nøyaktig gjengivelse av anatomi i vevet som blodkar og nevrale fibre fås9,10. IDISCO + har fordeler i at det er kompatibelt med forskjellige antistoffer og fluorescerende journalister11,14, og det har demonstrert suksess i flere organer og selv embryoes14. Men er den viktigste begrensningen en lang incubation periode, der 18 til 20 dager kreves for å fullføre hele eksperimentet.
Et annet viktig program for hele-mount flekker er visualisering av cellen skjebne i kombinasjon med en slektslinje sporing system. Avstamning sporing er merking av et bestemt gen/indikator i en celle som kan sendes videre til alle datter celler og er bevart over tid15. Som sådan, er det et kraftig verktøy som kan brukes til å avgjøre skjebnen til en celle avkom15. Siden 1990 grobunn-LoxP rekombinant systemet har blitt en kraftig metode for avstamning sporing i levende organismer15. Når en mus linje som uttrykker grobunn, en DNA recombinase enzym, er krysset med en annen mus linje uttrykke reporter som er til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein uttrykt15.
For hele-mount flekker, er bruk av fluorescerende multicolor journalister egnet for imaging av fettvev fordi det gir minimale forstyrrelser med intracellulære aktiviteter adipocyte16. Men flekken tradisjonelle journalister vanligvis cytoplasma, gjør det vanskelig å spore slektslinje hvit adipocytter, som har begrenset cytoplasmatiske innhold17. Du løser dette problemet, er bruken av membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt verktøy. Membran målrettede tdTomato uttrykkes i grobunn-negativ celler18. På grobunn excision oppstår bytte til uttrykk for membran målrettede eGFP, gjør denne reporteren egnet for sporing slektslinje adipocyte progenitors17,18 (Supplerende figur 1).
Formålet med denne utredningen er å gi en detaljert protokoll for hele-mount flekker og viser hvordan den kan kombineres med andre teknikker å studere utviklingen og fysiologi av fettvev. To eksempler på programmer som er beskrevet i denne protokollen er bruken med 1) multicolor reporter musen linjer å identifisere ulike opprinnelsen til adipocytter og 2) vev fjerne for å ytterligere visualisere den nevrale arborization i hvit fettvev (WAT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Fettvev er et viktig metabolsk organ med høy plastisitet og svarer til miljømessige stimuli og næringsstoffer status. Som sådan, er ulike teknikker utviklet for å studere morfologi og biologi av fettvev. Men er konvensjonelle visualisering metoder begrenset til å studere vevet i 2D deler, unnlater å fange 3D arkitektur hele orgel. Her presenterer vi hele-mount flekker, en immunohistochemistry metode som beholder intakt fettvev morfologi med minimal behandlingstrinnene. Dermed opprettholdes konstruksjoner av adipocytter og andre cellulære komponenter uten forvrengning, oppnå mest representative 3D-visualisering av vev. I tillegg kan hele-mount flekker kombineres med avstamning sporing metoder for å bestemme cellen skjebne beslutninger. Denne teknikken har imidlertid noen begrensninger til å gi nøyaktig informasjon om dypere deler av fettvev. For å overkomme denne begrensningen, kan hele-mount flekker videre kombineres med vev clearing teknikker for å fjerne opaqueness av vev og tillater fullstendig oversikt over hele fettvev anatomi bruker lys arks fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en høyere oppløsning og mer nøyaktig gjengivelse av fettvev strukturer hentes med kombinasjonen av disse teknikkene.

På grunn av skjørhet av fettvev, kan metoder som involverer flere behandlingstrinnene og snitting føre til skjemmende fettvev morfologi3 (figur 1A). Men kan hele-mount flekker beholde morfologi av adipocytter, sikrer nøyaktig tolkning av resultater (figur 1B).
Over fiksering av fettvev fører til bindemiddel-indusert autofluorescence. Som vist i figur 2A, overlappe grønne og r...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Fokus for studien er å vise hele-mount immunostai- og visualisering teknikken som en ideell metode for 3D-bildebehandling av fettvev arkitektur og cellular komponenten.

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i fettbiologifeltet, for eksempel hvordan intercellulære interaksjoner og fettvevfysiologi endres på ulike metabolske forhold som faste og fedme. Den største fordelen med denne teknikken er at den optimalt bevarer den opprinnelige fett 3D-strukturen og unngår lange behandlingstrinn som vanligvis kreves for konvensjonell immunohistochemistry. Selv om denne metoden kan gi innsikt i strukturen i fettvevet, kan den også brukes på andre organsystemer, for eksempel nervesystemet, ved å farge hjernen.Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite på grunn av vanskelighetene med å få eiendomsvevssteder, finne riktig fikseringsperiode og de optimale antistoffkonsentrasjonene. Etter at disseksjonen er fullført, overfører du parabolen som inneholder vevsprøvene i 1% paraformaldehyd fra isen til romtemperatur i en time. Deretter overfører vevet til enten en 12 eller 24-brønns cellekulturplate for raskere vask.Det er viktig å huske at fargeprosedyren for hele fjellet må begynne umiddelbart etter disseksjon, og at det ikke er noen pausepunkter mellom hvert trinn. Vask vevet med PBS-0,3T på en shaker vippet ved 22 grader med en hastighet mellom 20 og 25 vipper per minutt ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne vasken to ekstra ganger.Etter dette legger du til omtrent 0,5 til en milliliter blokkeringsbuffer som inneholder 5% dyreserum. Inkuber platen på en shaker ved hjelp av de tidligere forholdene i en time. Aspirer blokkeringsløsningen, og legg til milliliter primære antistoffer fortynnet i PBS-0,3T med 1% dyreserum til hver brønn.Inkuber platen over natten på en shaker ved fire grader Celsius med en tilt på 22 grader og en hastighet på 20 til 25 vipper per minutt. Neste dag, bruk PBS-0,3T til å vaske vevet ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne vasken to ekstra ganger.Deretter legger du til mellom 0,5 og en milliliter passende og fortynnet sekundære antistoffløsninger til hver brønn. Pakk platen i aluminiumsfolie og inkuber den på en shaker ved romtemperatur i en time. Etter dette vasker du platen to ganger med PBS-0,3T ved romtemperatur i fem minutter per vask.Hvis visualisering av væskedråper er nødvendig under den nøytrale lipidflekken, vask to ganger med 1x PBS med hver vask som varer i fem minutter. Tilsett den nøytrale lipidflekken fortynnet i PBS, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. For å begynne å bilde, bruk tang til å legge vevet flatt på en 24 med 60 millimeter glassdekselslipp.Hvis det er ønskelig med kjernefarging med DAPI, legger du til en til to dråper av et monteringsmedium som inneholder DAPI for å senke vevet helt ned og forhindre at det tørker. Plasser deretter lysbildet på et omvendt konokalt lasermikroskopsystem. For å få bilder av helmontert farget vev ved flere fokalplan, utfør Z-stabler på 100 til 150 mikrometer i dybden med trinnstørrelse på fire til seks mikrometer ved ønsket forstørrelse.I denne studien brukes full-mount farging til å bevare fettvev arkitektur. I motsetning til metoder som involverer flere behandlingstrinn og snitting, noe som kan føre til vansiring av fettvevsmorfologien, kan full-mount farging metoden bevare morfologien av adipocytter, noe som sikrer nøyaktighet når du tolker resultater. Overfixation av fettvev fører til fikserings-indusert fluorescens, som kan indikeres ved overlappende identiske regioner, for eksempel i tyrosinhydroksylase og PECAM-1 signaler sett her.Riktig faste, helmonterte flekkprøver viser imidlertid separate og tydelige signaler, noe som indikerer at disse signalene ikke er autofluorescence. Imaging hel-mount farget fettvev gir kvantifisering av morfologiske endringer under ulike eksperimentelle forhold. Spesielt er fettvev svært vaskularisert, noe som er viktig for å mege metabolsk homeostase ved raske endringer i energinivået.For eksempel viser C57 svarte 6J-mus, som gjennomgår 24 timers faste, en betydelig mindre adipocyttstørrelse, noe som indikerer lipolyse, og en trend i forhøyet blodkartetthet sammenlignet med kontinuerlig matet mus. Rydding av fettvev med iDISCO+gjør det mulig for fettvev å bli optisk gjennomsiktig. Immunolabeling av fettvev som har gått gjennom vevsrydding viser mye tyngre nevrale arborisering sammenlignet med det som observeres i full-mount farging uten vevrydding ved samme forstørrelse.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å ikke overfix prøvene i mer enn en time ved romtemperatur i PFA, ellers vil dette øke bakgrunnen autofluorescence. Denne fikseringsperioden kan imidlertid forlenges hvis prøvene er festet til fire grader Celsius. Etter denne prosedyren kan andre metoder som kvantifisering ved hjelp av ImageJ utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel hvordan cellulær arkitektur, for eksempel adipocytesteder og blodkartetthet, endres som svar på ulike fysiologiske forhold.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunstaining av heldekkende drosophila-testikler for 3D-konfomisk analyse av store spermatocytter

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Utforske fettvevsstruktur av Methylsalicylate Clearing og 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...