Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
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Este trabalho foi financiado por doações de ciências naturais e Conselho de pesquisa engenharia (NSERC) do Canadá, piloto e subsídio de estudo de viabilidade de Banting e Best Diabetes Centre (BBDC), o fundo de arranque SickKids de H-K. S., pesquisa centro programa médico (2015R1A5A2009124) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, das TIC e futuro planejamento para J-R.K.

Todos os protocolos de animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de cuidado Animal do centro para Phenogenomics (TCP) em conformidade com as normas do Conselho canadense de cuidado Animal. Ratos foram mantidos em ciclos de 12 h claro/escuro e fornecidos com livre acesso à água e comida. 7 mês antiga C57BL/6J camundongos machos foram usados no experimento manchando toda a montagem.
Nota: As seções 1 e 2 estão em ordem cronológica, com seção 3 sendo uma etapa opcional logo apó...

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Embora as técnicas convencionais como histologia e cryosection oferecem benefícios para observar a estrutura intracelular, manchando toda a montagem fornece uma perspectiva diferente na investigação de tecido adiposo, que permite a visualização 3D de celulares arquitetura do tecido minimamente processado.
Para com êxito executar toda a montagem de coloração, as sugestões a seguir devem ser tida em conta. Depósitos de diferentes de tecido adiposo podem produzir vários resultados de ...

Tecido adiposo é um órgão essencial para o armazenamento de energia e é caracterizado pela dinâmica de remodelação e expansão quase ilimitada1. Além de homeostase de energia, o tecido adiposo também desempenha um papel essencial na secreção de hormônio de mais de 50 adipocinas para modular a função metabólica de corpo inteiro2. Tecido adiposo tem uma arquitectura diversificada composta por vários tipos de células, incluindo os adipócitos maduros, fibroblastos, células endoteliais, células do sistema imunológico e de células progenitoras dos adipócitos3. Estudos recentes têm mostrado que a obesidade e outras disfunções metabólicas podem significativamente alterar função do tecido adiposo e seu microambiente, que inclui mas não está limitado ao alargamento dos adipócitos, infiltração de células inflamatórias (por exemplo, macrófagos) e disfunção vascular3.
Técnicas morfológicas convencionais como histologia e cryosectioning demonstram várias limitações em estudar Biologia adiposa como etapas longas processamento químico, que pode levar ao tecido encolhimento e estrutura distorção3, 4. Além disso, estas técnicas 2D são insuficientes para observar interações intercelulares exercidas pelos diferentes tipos de células, como as seções obtidas são limitadas a pequenas regiões do tecido inteiro3. Em comparação com os convencionais métodos de imagem fluorescente, manchando toda a montagem não requer etapas adicionais invasivas, tais como incorporação, corte e desidratação; assim, isto evita o problema de diminuir a especificidade do anticorpo. Como tal, é um método simples e eficiente para o tecido adiposo de imagem, com melhor preservação da morfologia dos adipócitos e de estrutura de tecido adiposo total5. Portanto, toda a montagem coloração como uma técnica rápida e barata immunolabeling foi estabelecida para preservar o tecido adiposo arquitetura 3D1,6,7,8.
No entanto, apesar da preservação da morfologia do tecido adiposo, com uso de coloração toda a montagem, esta técnica é ainda incapaz de visualizar estruturas internas sob a superfície de lipídios do tecido. Vários estudos recentes9,10 estabeleceram tecido limpando técnicas combinadas com toda a montagem immunolabeling1,6 , para permitir a visualização 3D abrangente no tecido adiposo. Em particular, redes neurais e a vasculatura densas foram visualizadas em recentes estudos9,10,11,12 com imagem de volume 3D. Com efeito, estudar a plasticidade neural e vascular do tecido adiposo em diferentes condições fisiológicas é essencial para o estudo de sua biologia. Habilitado para Immunolabeling imagem tridimensional da clareira de tecidos de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO +) é um processo composto de pré-tratamento de metanol, immunolabeling e limpeza de opacidade de tecido com reagentes químicos orgânicos diclorometano (DCM ) e dibenzyl de13,de éter (DBE)14. O tecido adiposo, tornando totalmente transparente, uma representação mais precisa da anatomia dentro do tecido, tais como os vasos sanguíneos e fibras neurais pode ser obtida9,10. IDISCO + tem vantagens em que é compatível com vários anticorpos e repórteres fluorescente11,14, e tem demonstrado sucesso em vários órgãos e embriões até14. No entanto, sua principal limitação é um tempo de incubação longa, em que 18 a 20 dias são necessários para completar todo o experimento.
Outra aplicação importante da mancha toda a montagem é a visualização do destino de célula em combinação com um sistema de rastreamento de linhagem. Rastreamento de linhagem é a rotulagem de um gene/marcador específico em uma célula que pode ser transmitida a todas as células da filha e é conservada ao longo do tempo,15. Como tal, é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para determinar o destino de progênie15 de uma célula. Desde a década de 1990, o sistema de recombinação de Cre-LoxP tornou-se uma poderosa abordagem para rastreamento de linhagem em vida organismos15. Quando uma linha de rato que expressa Cre, uma enzima recombinase de DNA, é cruzada com uma outra linha de rato, expressando uma repórter que é adjacente a uma sequência de loxP-STOP-loxP, a proteína de repórter é expressa15.
Para a coloração de toda a montagem, o uso de repórteres multicoloridos fluorescentes é apropriado para a imagem do tecido adiposo, porque permite a mínima interferência com atividades intracelulares do adipócito16. No entanto, repórteres tradicionais normalmente mancham o citoplasma, tornando difícil traçar a linhagem dos adipócitos brancos, que têm limitado a conteúdo citoplasmático17. Para superar este problema, o uso do marcador de repórter eGFP (mT/mG) membrana-limite tdTomato fluorescente/membrana é uma ferramenta ideal. TdTomato membrana-alvo é expressa em células de Cre-negativo18. Após excisão de Cre, ocorre um interruptor para a expressão da membrana-alvo eGFP, tornando este repórter adequado para rastreamento da linhagem do adipócito progenitores17,18 (Complementar a figura 1).
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado para montagem em toda a coloração e mostrar como ele pode ser combinado com outras técnicas para estudar o desenvolvimento e a fisiologia do tecido adiposo. Dois exemplos de aplicativos descritos no presente protocolo são seu uso com linhas de rato 1) multicolor repórter para identificar várias origens de adipócitos e 2) tecido de compensação para visualizar mais a arborização neural no tecido adiposo branco (WAT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Tecido adiposo é um órgão metabólico importante com alta plasticidade e é sensível ao status de nutrientes e estímulos ambientais. Como tal, desenvolveram-se várias técnicas para estudar a morfologia e biologia do tecido adiposo. No entanto, métodos de visualização convencionais limitam-se a estudar o tecido em seções 2D, falhando capturar a arquitetura 3D do órgão inteiro. Aqui nós apresentamos toda a montagem, um método de imuno-histoquímica que preserva a morfologia intacta tecido adiposo com etapas de processamento mínimo de coloração. Portanto, as estruturas de adipócitos e outros componentes celulares são mantidas sem distorção, alcançar a visualização em 3D mais representativa do tecido. Além disso, toda a montagem de coloração pode ser combinado com métodos de rastreamento de linhagem para determinar as decisões de destino de célula. No entanto, esta técnica tem algumas limitações para fornecer informações precisas sobre as partes mais profundas do tecido adiposo. Para contornar essa limitação, montagem de toda a mancha pode ainda ser combinada com tecido técnicas para remover a opacidade do tecido e permitir a completa visualização da anatomia de todo tecido adiposo usando microscopia fluorescente luz-folha de compensação. Portanto, uma maior resolução e uma representação mais precisa das estruturas de tecido adiposo podem ser capturados com a combinação dessas técnicas.

Devido a fragilidade do tecido adiposo, métodos que envolvem várias etapas de processamento e corte podem levar à desfiguração do tecido adiposo morfologia3 (figura 1A). No entanto, toda a montagem de coloração pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo a exata interpretação dos resultados (figura 1B).
Fixação do excesso de tecido adiposo leva a autofluorescência induzida pelo fixador. ...

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

O foco do presente estudo é demonstrar a técnica de imunocoloração e visualização de toda a montagem como um método ideal para tratamento de imagens 3D do tecido adiposo celular e arquitetura de componente.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia adiposa, como como as interações intercelulares e a fisiologia do tecido adiposo mudam em diferentes condições metabólicas, como jejum e obesidade. A principal vantagem desta técnica é que ela preserva de forma ideal a estrutura 3D adiposa original e evita longas etapas de processamento que geralmente são necessárias para a imunohistoquímica convencional. Embora este método possa fornecer uma visão da estrutura do tecido adiposo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de órgãos, como o sistema nervoso, por meio de toda a coloração do cérebro.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às dificuldades em obter locais de tecido imobiliário, encontrar o período de fixação adequado e as concentrações ideais de anticorpos. Após a dissecação completa, transfira o prato contendo as amostras de tecido em 1%paraformaldeído do gelo para a temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, transfira os tecidos para uma placa de cultura celular de 12 ou 24 poços para uma lavagem mais rápida.É importante lembrar que o procedimento de coloração de todo o montagem deve começar imediatamente após a dissecação e que não há pontos de pausa entre cada etapa. Lave os tecidos com PBS-0,3T em um agitador inclinado a 22 graus com uma velocidade entre 20 e 25 inclinações por minuto à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.Depois disso, adicione aproximadamente 0,5 a um mililitro de tampão de bloqueio contendo 5% de soro animal. Incubar a placa em um shaker usando as condições anteriores durante uma hora. Aspire a solução de bloqueio e adicione o mililitro de anticorpos primários diluídos em PBS-0.3T com soro animal de 1% para cada poço.Incubar a placa durante a noite em um agitador a quatro graus Celsius com uma inclinação de 22 graus e uma velocidade de 20 a 25 inclinações por minuto. No dia seguinte, use PBS-0.3T para lavar os tecidos à temperatura ambiente por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes adicionais.Em seguida, adicione entre 0,5 e um mililitro de soluções de anticorpos secundários apropriadas e diluídas a cada poço. Enrole a placa em papel alumínio e incuba-a em um shaker à temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, lave a placa duas vezes com PBS-0,3T em temperatura ambiente por cinco minutos por lavagem.Se for necessária a visualização de gotículas líquidas durante a mancha lipídica neutra, lave duas vezes com 1x PBS a cada lavagem com duração de cinco minutos. Adicione a mancha lipídica neutra diluída na PBS e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Para começar a imagem, use fórceps para colocar o tecido plano em um deslizamento de tampa de vidro de 24 por 60 milímetros.Se for desejada a coloração dos núcleos com DAPI, adicione uma a duas gotas de um meio de montagem que contenha DAPI para submergir completamente o tecido e evitar que ele seque. Em seguida, coloque o slide em um sistema de microscópio a laser confocal invertido. Para obter imagens de tecido manchado de montagem inteira em vários planos focais, realize pilhas Z de 100 a 150 micrômetros de profundidade com tamanho de passo de quatro a seis micrômetros na ampliação desejada.Neste estudo, a coloração de montagem inteira é usada para preservar a arquitetura de tecido adiposo. Ao contrário de métodos que envolvem múltiplas etapas de processamento e secção, que podem levar à desfiguração da morfologia tecidual adiposa, o método de coloração de todo o montagem pode preservar a morfologia dos adipócitos, garantindo precisão na interpretação dos resultados. A superfixação do tecido adiposo leva à fluorescência induzida por fixação, que pode ser indicada por regiões idênticas sobrepostas, como nos sinais de hidroxilase de tirasina e PECAM-1 vistos aqui.Amostras de manchas de montagem total devidamente fixas, no entanto, mostram sinais separados e distintos, indicando que esses sinais não são autofluorescência. A imagem de tecido adiposo manchado de montagem total permite a quantificação de alterações morfológicas em diferentes condições experimentais. Em particular, o tecido adiposo é altamente vascularizado, o que é importante na mediação da homeostase metabólica sobre rápidas mudanças no nível de energia.Por exemplo, os camundongos C57 pretos 6J, que passam por 24 horas de jejum, apresentam um tamanho de adipócito significativamente menor, o que indica lipólise, e uma tendência na densidade elevada dos vasos sanguíneos quando comparados com camundongos continuamente alimentados. Limpar tecidos adiposos com iDISCO+permite que os tecidos adiposos se tornem opticamente transparentes. A imunolabelação do tecido adiposo que passou pela limpeza tecidual mostra arborização neural muito mais densa em comparação com a observada em coloração de montagem inteira sem limpeza tecidual na mesma ampliação.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não sobrefixar suas amostras por mais de uma hora em temperatura ambiente em PFA, caso contrário, isso aumentará a autofluorescência de fundo. No entanto, esse período de fixação pode ser prolongado se as amostras forem fixadas a quatro graus Celsius. Após esse procedimento, outros métodos como quantificação utilizando ImageJ, podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como como a arquitetura celular, como sítios adipócitos e densidade dos vasos sanguíneos, mudança em resposta a várias condições fisiológicas.

Research

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