Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Эта работа финансировалась за счет грантов от естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ) Канада, пилот и осуществимости исследования Грант Бантинг и лучший диабет центр (BBDC), Фонда SickKids Start-up H-K. S., медицинский исследовательский центр программы (2015R1A5A2009124) через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования для J-р.к.

Все экспериментальных животных протоколы были утверждены Комитетом животное уход центр для Phenogenomics (TCP), соответствует стандартам Канадского совета по лечению животных. Мыши были на 12-h свет/темно циклов и обеспечен свободный доступ к воде и пище. 7 месяцев старых самцов мышей C57BL/6J были и...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

Хотя обычные методы, такие как cryosection и гистологии предлагают преимущества для наблюдения за внутриклеточные структуры, окрашивание всей гора предоставляет различные перспективы в исследованиях жировой ткани, что позволяет 3D визуализация сотовой связи Архитектура минимально обрабо?...

Жировой ткани является важным органом для хранения энергии и характеризуется динамической перепланировка и практически неограниченного расширения1. Помимо энергетического гомеостаза жировой ткани также играет важную роль в секреции гормона из более чем 50 адипокинов чтобы модулировать всего тела метаболические функции2. Жировая ткань имеет различные архитектуры, состоящий из различных типов клеток, включая пожилые адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и Адипоцит прогениторных клеток3. Недавние исследования показали, что ожирение и другие метаболические дисфункции может значительно изменить функции жировой ткани и ее микроокружения, которая включает, но не ограничивается расширения адипоциты, инфильтрация воспалительных клеток (например, макрофагов) и сосудистые дисфункции3.
Обычные Морфологические методы, такие как cryosectioning и гистологии продемонстрировать некоторые ограничения в изучении жировой биология таких продолжительных химической обработки шагов, которые могут привести к ткани усадки и структура искажения3, 4. Кроме того эти 2D методы недостаточны соблюдать межклеточных взаимодействий, оказываемое различных типов клеток, так как полученные разделы ограничены для небольших участков всей ткани3. По сравнению с обычными методами флуоресцентных изображений, окрашивание всей гора не требуют дополнительных инвазивных шаги, такие как встраивание, секционирование и обезвоживания; Таким образом это позволяет избежать проблемы уменьшения специфичность антитела. Таким образом это простой и эффективный метод для визуализации жировой ткани, с лучшей сохранности Адипоцит морфологии и структуре общей жировой ткани5. Таким образом всего гора окрашивание как метод быстрый и недорогой immunolabeling был создан для сохранения жировой ткани 3D архитектура1,6,,78.
Однако несмотря на сохранение жировой ткани морфологии с использованием всего гора окрашивание, этот метод все еще не удается визуализировать внутренней структуры под поверхностью липидов в ткани. Несколько недавних исследований9,10 установили очистка методов в сочетании с целом гора immunolabeling1,6 для всеобъемлющей 3D визуализации в жировой ткани. В частности плотной сети нервных и сосудистую были подробно освещены в последние исследования9,10,11,12 с визуализации 3D-объем. Действительно изучая пластичности нервной и сосудистой жировой ткани в различных физиологических условиях имеет важное значение для изучения его биологии. Immunolabeling с поддержкой трехмерных изображений очистки ткани растворителя очищены органов (iDISCO +) представляет собой процесс состоит из метанола предварительной обработки, immunolabeling и очистка непрозрачность ткани с органические химические реагенты Дихлорметан (DCM ) и dibenzyl эфира (DBE)13,14. Делая жировой ткани полностью прозрачным,9,10можно получить более точное представление об анатомии в ткани, такие как кровеносных сосудов и нервных волокон. IDISCO + имеет преимущества в том, что он совместим с различными антител и флуоресцентные журналистам11,14, и он продемонстрировал успех в различных органах и даже embryoes14. Однако его основным ограничением является длительный инкубационный время, в котором 18-20 дней, необходимых для завершения всего эксперимента.
Другое важное применение всего гора окрашивания является визуализация судьбы клеток в сочетании с системой трассировки линии. Родословная трассировки является маркировка конкретных генов/маркера в ячейке, может быть передан все клетки дочи и сохраняется в течение времени15. Таким образом он является мощным инструментом, который может использоваться для определения судьбы клетки потомства15. Начиная с 90-х годов, КРР-LoxP Рекомбинатные системы стало мощный подход для трассировки линии в живых организмов15. Когда мышь линию, которая выражает Cre, рекомбиназа фермента ДНК, пересекается с другой мыши линии, выражая репортером, которая примыкает к loxP стоп loxP последовательность, репортер белок является выраженным15.
Для окрашивания целом гора, использование флуоресцентных многоцветной Репортеры подходит для изображений из жировой ткани, потому что она позволяет для минимального вмешательства с внутриклеточной деятельности Адипоцит16. Однако традиционные репортерам обычно пятно цитоплазме, что делает его трудно проследить родословную белых адипоциты, которые имеют ограниченный цитоплазматических содержание17. Для преодоления этой проблемы, использование мембранных привязкой флуоресцентный tdTomato/мембраны eGFP (mT/мг) репортер маркер является идеальным инструментом. Ориентированные на мембране tdTomato выражается в Cre отрицательные клетки18. После иссечения Cre происходит переключение на выражение мембраны целевой eGFP, что делает этот репортер подходит для отслеживания lineage Адипоцит прародителями17,18 (Дополнительный рис . 1).
Цель этого документа должна предоставить подробный протокол для окрашивания целом гора и показать, каким образом оно может сочетаться с другими методами для изучения развития и физиологии жировой ткани. Двумя примерами приложений, описанных в настоящем Протоколе являются его использования с 1) многоцветная репортер мыши линий для выявления различного происхождения адипоциты и 2) ткани, очистка далее визуализировать нейронные арборизация в белой жировой ткани (Ват).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Жировой ткани является важным органом метаболизма с высокой пластичностью и реагировать на экологические стимулы и питательный статус. Таким образом были разработаны различные методы для изучения морфологии и биологии жировой ткани. Однако обычные визуализации методы ограничены к изучению ткани в 2D разрезах, сумев захватить 3D архитектура весь орган. Здесь мы представляем в целом гора окрашивание, иммуногистохимия метод, который сохраняет нетронутыми жировой ткани морфология с минимальной обработки шагов. Следовательно без искажений, достижение наиболее представительных 3D визуализации тканей поддерживаются структуры адипоциты и других клеточных компонентов. Кроме того всего гора пятнать может сочетаться с линии методы трассировки для определения решения судьбы клетки. Однако этот метод имеет некоторые ограничения для предоставления точной информации в отношении более глубоких частях жировой ткани. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивание всей гора далее комбинируется с ткани, очистка методов для удаления непрозрачность ткани и полная визуализация анатомии всей жировой ткани с помощью флуоресцентной микроскопии свет лист. Таким образом более высокое разрешение и более точное представление о жировой ткани структуры могут быть захвачены с сочетанием этих методов.

Из-за хрупкости жировой ткани методы с участием нескольких шагов обработки и секционирование может привести к disfigurement жировой ткани морфология3 (рис. 1A). Однако всего гора пятнать может сохранить морфология адипоциты, обеспечение точной интерпретации резул...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области жировой биологии, такие как, как межклеточные взаимодействия и физиология жировой ткани меняются при различных метаболических условиях, таких как пост и ожирение. Основным преимуществом этого метода является то, что он оптимально сохраняет оригинальную жировую 3D структуру и избегает длительных этапов обработки, которые обычно необходимы для обычной иммуногистохимии. Хотя этот метод может обеспечить понимание структуры жировой ткани, он также может быть применен к другим системам органов, таких как нервная система, путем цельного монтажа окрашивания мозга.Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за трудностей в получении свойств тканей сайтов, найти надлежащий период фиксации, и оптимальные концентрации антител. После того, как вскрытие завершено, перенесите блюдо, содержащее образцы тканей в 1%paraformaldehyde от льда к комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите ткани либо в 12 или 24-хорошо клеточной культуры пластины для более быстрого мытья.Важно помнить, что процедура окрашивания вся должна начинаться сразу после вскрытия и что между каждым шагом нет точек паузы. Вымойте ткани с PBS-0.3T на шейкер наклонен на 22 градусов со скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.После этого добавьте примерно 0,5 к одному миллилитру блокирующего буфера, содержащего 5%животной сыворотки. Инкубировать пластину на шейкере, используя предыдущие условия в течение одного часа. Аспирировать блокирующий раствор, и добавить на миллилитр первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1%животной сыворотки к каждому хорошо.Инкубировать пластину на ночь на шейкере при четырех градусах по Цельсию с наклоном 22 градусов и скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту. На следующий день используйте PBS-0.3T для мытья тканей при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра соответствующих и разбавленных вторичных антител решений для каждой хорошо. Оберните пластину в алюминиевую фольгу и инкубировать его на шейкер при комнатной температуре в течение одного часа. После этого, мыть пластину дважды с PBS-0.3T при комнатной температуре в течение пяти минут за стирку.Если визуализация жидких капель необходима во время нейтрального липидного пятна, мыть дважды с 1x PBS с каждой стирки продолжительностью пять минут. Добавить нейтральное липидное пятно, разбавленное в PBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы начать визуализацию, используйте типсы, чтобы заложить ткань плоской на 24 на 60 миллиметров стеклянной крышкой скольжения.Если необходимо окрашивание ядер DAPI, добавьте одну-две капли монтажной среды, которая содержит DAPI, чтобы полностью погрузить ткань и предотвратить ее высыхание. Затем поместите слайд на перевернутую систему конфокального лазерного микроскопа. Для получения изображений цельно-монтируемых окрашенных тканей на нескольких фокусных плоскостях выполните стеки от 100 до 150 микрометров в глубину с размером шага от четырех до шести микрометров при желаемом увеличении.В этом исследовании, цельно-монтажное окрашивание используется для сохранения архитектуры жировой ткани. В отличие от методов, которые включают в себя несколько этапов обработки и секций, которые могут привести к обезображиванию морфологии жировой ткани, цельно-монтажный метод окрашивания может сохранить морфологию адипоцитов, обеспечивая точность при интерпретации результатов. Перефиксация жировой ткани приводит к фиксации индуцированной флуоресценции, которая может быть указана перекрывающихся идентичных регионах, таких как гидроксилазы тирозина и PECAM-1 сигналы видели здесь.Правильно фиксированные, цельно-монтажные образцы пятен, однако, показывают отдельные и четкие сигналы, указывающие на то, что эти сигналы не являются аутофторесценцией. Изображение цельно-монтажной жировой ткани позволяет количественно оценить морфологические изменения в различных экспериментальных условиях. В частности, жировая ткань высоко васкуляризирована, что важно при посредничестве метаболического гомеостаза при быстрых изменениях энергетического уровня.Например, C57 черные мыши 6J, которые проходят 24 часов поста, отображают значительно меньший размер адипоцитов, что указывает на липолиз, и тенденция в повышенной плотности кровеносных сосудов по сравнению с постоянно кормили мышей. Очистка жировых тканей с помощью iDISCO позволяет жировой ткани стать оптически прозрачными. Иммунолабелирование жировой ткани, которая прошла через очистку тканей показывает гораздо плотнее нейронной арборизации по сравнению с тем, что наблюдается в цельно-монтажного окрашивания без очистки тканей при том же увеличении.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы не перефиксированы образцы в течение более часа при комнатной температуре в PFA, в противном случае, это увеличит фон аутофторесценции. Однако этот период фиксации может быть продлен, если образцы фиксируются при четырех градусах Цельсия. После этой процедуры, другие методы, такие как количественная оценка с помощью ImageJ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как, например, клеточной архитектуры, такие как адипоциты сайтов и плотность кровеносных сосудов, изменения в ответ на различные физиологические условия.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Метод полного окрашивания антител горе в Чик

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Изучение структуры жировой ткани путем очистки метилсалицилата и 3D-изображения

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...