Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
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Este trabajo fue financiado por subvenciones de las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) de Canadá, piloto y beca de estudio de viabilidad de Banting y Best Diabetes centro (BBDC), el fondo inicial de SickKids a H-K. S., médica centro de programa de investigación (2015R1A5A2009124) a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro planea J r

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal del centro para Phenogenomics (TCP) se ajustó a las normas del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. Ratones fueron mantenidos en ciclos de luz/oscuridad de 12-h y con libre acceso a agua y alimentos. 7 meses viejos ratones machos C57BL/6J se utilizaron en el experimento de tinción montaje en conjunto.
Nota: Las secciones 1 y 2 están en orden cronológico, con la sección 3 es un paso opc...

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Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.
Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo ...

Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada1. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo2. El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células3. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular3.
Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión3, 4. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero3. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total5. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D1,6,7,8.
Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta14. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.
Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo15. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula15. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos15. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado15.
Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito16. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico17. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células18. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores17,18 (Complementario de la figura 1).
El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.

Debido a la fragilidad del tejido adiposo, métodos que implican varios pasos de procesamiento y seccionamiento pueden llevar a la desfiguración de tejido adiposo morfología3 (figura 1A). Sin embargo, el conjunto montaje coloración puede conservar la morfología de los adipocitos, garantizar la precisa interpretación de los resultados (figura 1B).
Fijación excesiva de tejido adiposo lleva a autofluorescenc...

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Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.

Visualización de estructura del tejido adiposo blanco 3D utilizando tinción de Whole-mount

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología adiposa, como cómo las interacciones intercelulares y la fisiología del tejido adiposo cambian en diferentes condiciones metabólicas como el ayuno y la obesidad. La principal ventaja de esta técnica es que conserva de forma óptima la estructura 3D adiposa original y evita largos pasos de procesamiento que suelen ser necesarios para la inmunohistoquímica convencional. Aunque este método puede proporcionar información sobre la estructura del tejido adiposo, también se puede aplicar a otros sistemas de órganos, como el sistema nervioso, mediante la tinción de montaje completo del cerebro.Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán debido a las dificultades para obtener sitios de tejido de la propiedad, encontrar el período de fijación adecuado, y las concentraciones óptimas de anticuerpos. Una vez completada la disección, transfiera el plato que contiene las muestras de tejido en 1%paraformaldehído del hielo a temperatura ambiente durante una hora. Luego transfiera los tejidos a una placa de cultivo celular de 12 o 24 pozos para un lavado más rápido.Es importante recordar que el procedimiento de tinción de montaje completo debe comenzar inmediatamente después de la disección y que no hay puntos de pausa entre cada paso. Lave los tejidos con PBS-0.3T en una coctelera inclinada a 22 grados con una velocidad entre 20 y 25 inclinaciones por minuto a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.Después de esto, añadir aproximadamente 0,5 a un mililitro de tampón de bloqueo que contiene 5%suero animal. Incubar la placa en una coctelera utilizando las condiciones anteriores durante una hora. Aspirar la solución de bloqueo y añadir mililitros de anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1%de suero animal a cada pozo.Incubar la placa durante la noche en una coctelera a cuatro grados Centígrados con una inclinación de 22 grados y una velocidad de 20 a 25 inclinaciones por minuto. Al día siguiente, utilice PBS-0.3T para lavar los tejidos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces más.A continuación, agregue entre 0,5 y un mililitro de soluciones de anticuerpos secundarios adecuadas y diluidas a cada pozo. Envuelva la placa en papel de aluminio e incubarlo en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Después de esto, lave la placa dos veces con PBS-0.3T a temperatura ambiente durante cinco minutos por lavado.Si se necesita la visualización de gotas líquidas durante la mancha de lípidos neutros, lave dos veces con 1 pbS PBS con cada lavado que dure cinco minutos. Añadir la mancha de lípidos neutros diluido en PBS, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para comenzar la toma de imágenes, utilice fórceps para poner el tejido plano sobre un resbalón de cubierta de vidrio de 24 por 60 milímetros.Si se desea la tinción de núcleos con DAPI, agregue de una a dos gotas de un medio de montaje que contenga DAPI para sumergir completamente el tejido y evitar que se seque. A continuación, coloque la diapositiva en un sistema de microscopio láser confocal invertido. Para obtener imágenes de tejido teñido de montaje completo en múltiples planos focales, realice pilas Z de 100 a 150 micrómetros en profundidad con un tamaño de paso de cuatro a seis micrómetros con el aumento deseado.En este estudio, la tinción de montaje integral se utiliza para preservar la arquitectura del tejido adiposo. A diferencia de los métodos que implican múltiples pasos de procesamiento y sección, lo que puede conducir a la desfiguración de la morfología del tejido adiposo, el método de tinción de montaje completo puede preservar la morfología de los adipocitos, asegurando la precisión al interpretar los resultados. La sobrefija del tejido adiposo conduce a la fluorescencia inducida por reparadores, que puede ser indicada por regiones idénticas superpuestas, como en las señales tirosina hidroxilasa y PECAM-1 que se ven aquí.Sin embargo, las muestras de manchas de montaje integral correctamente fijadas muestran señales separadas y distintas, lo que indica que estas señales no son autofluorescencia. La imagen de tejido adiposo teñido de montaje integral permite la cuantificación de cambios morfológicos en diferentes condiciones experimentales. En particular, el tejido adiposo es altamente vascularizado, lo que es importante en la mediación de la homeostasis metabólica sobre los cambios rápidos en el nivel de energía.Por ejemplo, los ratones C57 negros 6J, que se someten a 24 horas de ayuno, muestran un tamaño de adipocitos significativamente más pequeño, lo que indica lipólisis, y una tendencia en la densidad elevada de los vasos sanguíneos en comparación con ratones alimentados continuamente. La limpieza de los tejidos adiposos con iDISCO+permite que los tejidos adiposos se vuelvan ópticamente transparentes. El inmunoetiquetado del tejido adiposo que ha pasado por la limpieza de tejidos muestra una arborización neuronal mucho más densa en comparación con la observada en la tinción de montaje integral sin limpiar tejido en la misma ampliación.Al intentar este procedimiento, es importante recordar no sobrefijar las muestras durante más de una hora a temperatura ambiente en PFA, de lo contrario, esto aumentará la autofluorescencia de fondo. Sin embargo, este período de fijación puede prolongarse si las muestras se fijan en cuatro grados centígrados. Siguiendo este procedimiento, otros métodos como la cuantificación usando ImageJ, se pueden realizar con el fin de responder a preguntas adicionales, como cómo la arquitectura celular, como los sitios de adipocitos y la densidad de los vasos sanguíneos, cambian en respuesta a diversas condiciones fisiológicas.

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

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Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

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