Name: visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Detta arbete finansierades genom bidrag från de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet (NSERC) av Kanada, Pilot och Feasibility Study Grant av Banting & bästa Diabetes Centre (BBDC), av SickKids startfonden till H-K. S., medicinsk forskning Center Program (2015R1A5A2009124) genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT, och framtiden planerar att J-R.K.

Alla experimentella djur protokoll godkändes av Animal Care Committee of The Center för Phenogenomics (TCP) överensstämde med normerna i kanadensiska rådet om djur vård. Möss var underhålls på 12-h ljus/mörk cykler och försedd med fri tillgång till vatten och mat. 7 månad gamla C57BL/6J manliga möss användes i hela-mount färgning experimentet.
Obs: Avsnitten 1 och 2 är i kronologisk ordning, med avsnitt 3 är ett valfritt steg höger efter avsnitt 1. Avsnitt 4 kan utföras fö...

<ol>
	<li>Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+vascular+endothelial+growth+factor+regulates+metabolic+homeostasis+through+angiogenesis.">Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).</li><li>Greenberg, A. S., Obin, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+the+role+of+adipose+tissue+in+inflammation+and+metabolism.">Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).</li><li>Martinez-Santiba&#241;ez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+White+Adipose+Tissue+With+Confocal+Microscopy.">Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy.</a> Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).</li><li>Laforest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Berry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+adipose+tissue.">Imaging of adipose tissue.</a> Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).</li><li>Kim, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+fasting+promotes+adipose+thermogenesis+and+metabolic+homeostasis+via+VEGF-mediated+alternative+activation+of+macrophage.">Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage.</a> Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).</li><li>Cho, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+role+of+LYVE-1-positive+macrophages+in+adipose+tissue.">Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue.</a> Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).</li><li>Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Lineage+Tracing+Study+for+Identification+of+Adipocyte+Precursor+Cell+(APC)+Populations.">Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations.</a> Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation.</a> in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+Intra-adipose+Sympathetic+Arborizations+Are+Essential+for+Cold-Induced+Beiging+of+Mouse+White+Adipose+Tissue.">Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue.</a> Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+volume+fluorescence-imaging+of+vascular+plasticity+in+adipose+tissues.">Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues.</a> Molecular Metabolism. , (2018).</li><li>Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-tissue+3D+imaging+reveals+intra-adipose+sympathetic+plasticity+regulated+by+NGF-TrkA+signal+in+cold-induced+beiging.">Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging.</a> Protein &amp; Cell. 9 (6), 527-539 (2018).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).</li><li>Vorhagen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+mediated+by+cre-recombinase+activity.">Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>. iDISCO+ protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf">https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf</a> (2016)</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Papadopulos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+tasks+in+microscopic+and+ultrastructural+image+analysis+using+ImageJ.">Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ.</a> Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).</li><li>Stanly, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+importance+of+appropriate+fixation+conditions+for+faithful+imaging+of+receptor+microclusters.">Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters.</a> Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U&#776;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pra&#776;paraten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: U&#776;ber Knochenfa&#776;rbung. , (1914).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+Whole-Organ+Clearing+and+Imaging+Techniques+with+Single-Cell+Resolution:+Toward+Organism-Level+Systems+Biology+in+Mammals.">Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li></ol>

Även konventionella tekniker såsom histologi och cryosection erbjuda fördelar för observation av intracellulära struktur, ger hela-mount färgning ett annat perspektiv i fettvävnad forskning, vilket möjliggör 3D visualisering av cellular arkitekturen av minimalt bearbetade vävnad.
För att kunna utföra hela-mount färgning, bör följande beaktas. Olika fettvävnad depåer kan ge olika immunfärgning resultat; typ av fettvävnad depot används bör således fastställas först. Brun ...

Fettvävnad är ett viktigt organ för energilagring och kännetecknas av dynamiska ombyggnad och nästan obegränsad expansion1. Förutom energi homeostas spelar fettvävnad också en viktig roll i hormon utsöndringen av över 50 adipokines att modulera hela kroppen metabolisk funktion2. Fettvävnaden har en skiftande arkitektur bestående av olika celltyper inklusive mogen adipocyter, fibroblaster, endotelceller, immunceller och fettceller progenitor celler3. Nyare studier har visat att fetma och andra metabolisk dysfunktion kan markant ändra fettvävnad funktion och dess mikromiljö, som inkluderar men är inte begränsat till utvidgningen av adipocyter, infiltration av inflammatoriska celler (t.ex. makrofager), och vaskulär dysfunktion3.
Konventionella morfologiska tekniker såsom histologi och kryosnitt demonstrera flera begränsningar i studera fett biologi t ex långa kemisk bearbetningssteg, vilket kan leda till vävnad krympning och struktur distorsion det3, 4. Dessutom är dessa 2D tekniker otillräckliga för att följa intercellulära interaktioner utövas av olika celltyper, som de delar som erhålls är begränsad till mindre regioner av hela vävnad3. Jämfört med konventionella metoder för fluorescerande imaging, hela-mount färgning inte kräver ytterligare invasiva åtgärder, såsom inbäddning, snittning och uttorkning. således undviker detta problemet med minskande antikropp specificitet. Som sådan, är det en enkel och effektiv metod för imaging fettvävnad, med bättre bevarande av fettceller morfologi och övergripande fettvävnad struktur5. Därför, om hela-mount färgning som en snabb och billig immunolabeling teknik inrättades för att bevara fettvävnad 3D arkitektur1,6,7,8.
Men trots bevarandet av fettvävnad morfologi med användning av hela-mount färgning är denna teknik fortfarande inte att visualisera inre strukturer under lipid ytan av vävnaden. Flera senare studier9,10 har etablerat vävnad clearing tekniker kombineras med hela-mount immunolabeling1,6 som möjliggör omfattande 3D-visualisering inom fettvävnad. I synnerhet var tät neurala och kärlsystemet nät visualiseras i senaste studier9,10,11,12 med 3D-volym imaging. Studera de neurala och vaskulär plasticitet av fettvävnad under olika fysiologiska förhållanden är faktiskt nödvändigt att studera dess biologi. Immunolabeling-aktiverade tredimensionell avbildning av lösningsmedel-godkänt organ (iDISCO +) vävnad röjning är en process bestående av metanol förbehandling, immunolabeling, och clearing av vävnad svårtydd med organiska kemiska reagenser diklormetan (DCM ) och dibensyl eter (DBE)13,14. Genom att göra fettvävnaden helt transparent, kan en mer korrekt bild av anatomin i vävnaden som blodkärl och neurala fibrerna erhållas9,10. IDISCO + har fördelar i att den är kompatibel med olika antikroppar och fluorescerande reportrar11,14, och den har visat framgång i flera organ och även embryon14. Dess huvudsakliga begränsning är dock en lång inkubationstid, där 18 till 20 dagar för att slutföra hela experimentet.
En annan viktig tillämpning av hela-mount färgning är visualisering av cell öde i kombination med ett lineage tracing system. Lineage tracing är märkning av en specifik gen/markör i en cell som kan överföras till alla dotter celler och är bevarad över tid15. Som sådan, är det ett kraftfullt verktyg som kan användas för att bestämma ödet för cellens avkomma15. Sedan 1990-talet, Cre-LoxP rekombinant systemet har blivit en kraftfull metod för lineage tracing i levande organismer15. När en mus linje som uttrycker Cre, en DNA recombinase enzym, korsas med en annan mus linje uttrycker en reporter som angränsar till en loxP-STOP-loxP-sekvens, är reporter proteinet uttryckta15.
För hela-mount färgning, är användning av fluorescerande multicolor reportrar lämplig för avbildning av fett eftersom det möjliggör för minimal störning med intracellulära aktiviteter av fettceller16. Dock färga traditionella reportrar vanligtvis cytoplasman, vilket gör det svårt att spåra linjen av vita fettceller, som har begränsad cytoplasmiska innehåll17. För att lösa detta problem, är användning av membran-bundna fluorescerande tdTomato/membran andra (mT/mG) reporter markör ett idealiskt verktyg. Membran-riktade tdTomato uttrycks i Cre-negativa celler18. På Cre excision uppstår en switch för membran-riktade andra uttryck, att göra denna reporter passande för att spåra linjen av fettceller föräldraparets17,18 (Kompletterande figur 1).
Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för hela-mount färgning och visa hur det kan kombineras med andra tekniker för att studera utveckling och fysiologi av fettvävnad. Två exempel på program som beskrivs i detta protokoll är dess användning med 1) multicolor reporter mus linjer att identifiera olika ursprung av adipocyter och 2) vävnad clearing för att ytterligare visualisera den neurala arborization i vit fettvävnad (WAT).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>LipidTox</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H34477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-1 primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z(CH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152, AB1542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>564907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicroscope I</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td></td>
			<td>Light sheet image fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 488, 594 and 647 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32</td>
			<td>BioSciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl-ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A452-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>BIO BASIC CANADA INC</td>
			<td>HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>J7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin kit I, fluorescein labeled</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>FLK-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA497GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>VECTOR LABORATORIES</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal serum (goat, donkey)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of 3d white adipose tissue structure using whole-mount staining

Fettväv är ett viktigt metaboliska organ med hög plasticitet och är lyhörda för stimuli från omgivningen och näringsämnen status. Som sådan, har olika tekniker utvecklats för att studera morfologi och biologi av fettvävnad. Konventionella visualiseringsmetoder är dock begränsade till studera vävnaden i 2D sektioner, misslyckas att fånga 3D arkitekturen i hela orgeln. Här presenterar vi hela-mount färgning, en metod för immunhistokemi som bevarar intakta fettvävnad morfologi med minimal bearbetningssteg. Därför bibehålls strukturer adipocyter och andra cellulära komponenter utan distorsion, att uppnå den mest representativa 3D-visualiseringen av vävnad. Hela-mount färgning kan dessutom kombineras med lineage tracing metoder att avgöra cell öde beslut. Denna teknik har dock vissa begränsningar att tillhandahålla korrekt information om djupare delar av fettvävnad. För att kringgå den här begränsningen kan hela-mount färgning ytterligare kombineras med vävnad clearing tekniker för att ta bort svårtydd vävnad och möjliggöra komplett visualisering av hela fettvävnad anatomi med hjälp av ljus-ark fluorescerande mikroskopi. Därför kan en högre upplösning och mer exakt representation av fettvävnad strukturer fångas med kombinationen av dessa tekniker.

På grund av bräcklighet av fettvävnad, kan metoder som involverar flera behandlingssteg och snittning leda till missbildningar av fettvävnad morfologi3 (figur 1A). Dock kan hela-mount färgning bevara morfologi av adipocyter, att säkerställa korrekt tolkning av resultaten (figur 1B).
Överdriven fixering av fettvävnad leder till fixativ-inducerad autofluorescens. Som visas i figur 2A...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining at JoVE.com

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Fokus i den aktuella studien är att visa hela-mount immunfärgning och visualisering tekniken som en idealisk metod för 3D imaging av fettvävnad arkitektur och cellular komponent.

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom fettbiologi området, såsom hur intercellulära interaktioner och fettvävnad fysiologi förändras vid olika metaboliska tillstånd såsom fasta och fetma. Den största fördelen med denna teknik är att den optimalt bevarar den ursprungliga adipose 3D-strukturen och undviker långa bearbetningssteg som vanligtvis krävs för konventionella immunohistokemi. Även om denna metod kan ge insikt i fettvävnadens struktur, kan den också appliceras på andra organsystem, såsom nervsystemet, genom att hela-fästet färga hjärnan.Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa på grund av svårigheterna att få webbplatser egendom vävnad, hitta rätt fixeringsperiod, och den optimala antikroppskoncentrationer. Efter dissekering är klar, överföra skålen som innehåller vävnadsproverna i 1%paraformaldehyd från isen till rumstemperatur i en timme. Sedan överföra vävnaderna till antingen en 12 eller 24-brunn cellkultur tallrik för snabbare tvätt.Det är viktigt att komma ihåg att hela-mount färgning förfarande måste börja omedelbart efter dissekering och att det inte finns några pauspunkter mellan varje steg. Tvätta vävnaderna med PBS-0.3T på en shaker lutad i 22 grader med en hastighet mellan 20 och 25 lutningar per minut vid rumstemperatur i fem minuter. Upprepa denna tvätt två ytterligare gånger.Efter detta, tillsätt ungefär 0,5 till en milliliter blockeringsbuffert som innehåller 5%djurserum. Inkubera plattan på en skakmaskin med hjälp av de tidigare förhållandena i en timme. Aspirera den blockerande lösningen, och lägg på milliliter av primära antikroppar utspädd i PBS-0.3T med 1%djurserum till varje brunn.Inkubera plattan över natten på en shaker vid fyra grader Celsius med en lutning på 22 grader och en hastighet på 20 till 25 lutar per minut. Nästa dag, använd PBS-0.3T för att tvätta vävnaderna i rumstemperatur i fem minuter. Upprepa denna tvätt två ytterligare gånger.Tillsätt sedan mellan 0,5 och en milliliter lämpliga och utspädda sekundära antikroppslösningar till varje brunn. Linda plattan i aluminiumfolie och inkubera den på en shaker i rumstemperatur i en timme. Efter detta tvättar du plattan två gånger med PBS-0.3T i rumstemperatur i fem minuter per tvätt.Om visualisering av vätskedroppar behövs under den neutrala lipidfläcken, tvätta två gånger med 1x PBS med varje tvätt som varar i fem minuter. Tillsätt den neutrala lipidfläcken utspädd i PBS, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. För att börja bildbehandling, använd trings för att lägga vävnaden platt på en 24 av 60 millimeter glas täcka slip.Om kärnor färgning med DAPI önskas, tillsätt en till två droppar av ett monteringsmedium som innehåller DAPI att helt dränka vävnaden och förhindra att den torkar. Placera sedan bilden på ett inverterat confokallasermikroskopsystem. För att erhålla bilder av helmonterad färgad vävnad vid flera fokalplan, utför Z-stackar med 100 till 150 mikrometer på djupet med stegstorlek på fyra till sex mikrometer vid önskad förstoring.I denna studie, hela-montera färgning används för att bevara fettvävnad arkitektur. Till skillnad från metoder som innebär flera bearbetning steg och avsnittning, vilket kan leda till vanställdhet av fettvävnad morfologi, hela-montera färgning metod kan bevara morfologi av adipocyter, säkerställa noggrannhet vid tolkning av resultat. Överfixering av fettvävnad leder till fixativ-inducerad fluorescens, vilket kan indikeras av överlappande identiska regioner, såsom i tyrosinhydroxylas och PECAM-1 signaler ses här.Korrekt fixerade, hela-mount fläckprover, dock visa separata och distinkta signaler, vilket tyder på att dessa signaler inte är autofluorescens. Bildframställning hel-montera färgat fettvävnad möjliggör kvantifiering av morfologiska förändringar under olika experimentella förhållanden. I synnerhet är fettvävnad mycket vascularized, vilket är viktigt i medla metaboliska homeostas vid snabba förändringar i energinivå.Till exempel, C57 svart 6J möss, som genomgår 24 timmars fasta, visa en betydligt mindre adipocyte storlek, vilket indikerar lipolys, och en trend i förhöjda blodkärl densitet jämfört med kontinuerligt matas möss. Rensa fettvävnader med iDISCO+gör det möjligt för fettvävnader att bli optiskt transparenta. Immunolabeling av fettvävnad som har gått igenom vävnad clearing visar mycket tätare neurala arborization jämfört med den som observerats i hela berget färgning utan vävnad clearing vid samma förstoring.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att inte överfix dina prover för mer än en timme vid rumstemperatur i PFA, annars kommer detta att öka bakgrunden autofluorescens. Denna fixeringsperiod kan dock förlängas om prover är fasta vid fyra grader Celsius. Efter denna procedur, andra metoder som kvantifiering med hjälp av ImageJ, kan utföras för att svara på ytterligare frågor, som hur cellulär arkitektur, såsom adipocyte platser och blodkärl densitet, förändring som svar på olika fysiologiska förhållanden.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Immunostaining av hela berget Drosophila testiklar för 3D confocal analys av stora spermatocyter

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Exploring Adipose Tissue Structure genom Metylsalicylate Clearing och 3D-avbildning

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halvautomatisk isolering av den stromala vaskulära fraktionen från murin vit fettvävnad med användning av en vävnadsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...