Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
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作者感谢埃斯特·辛格的语言编辑。这项研究得到了欧洲研究理事会在欧洲联盟第七个框架方案 (FP/2007-2013)/erc 赠款协议编号 320473-bacnk 下的支持。规划和预算编制委员会 i-core 方案和以色列科学基金会以及基因调控中的染色质和 rna i-core、gif 基金会、lewis 家庭基金会、icrf 教授赠款提供了进一步的支持。赫尔姆霍兹以色列赠款和玫瑰信托基金 (均为 o. m.)。这项研究还得到了以色列科学基金会 (502/项赠款)、卡斯医学研究奖和以色列血液学和输血医学学会研究赠款 (至 s. e) 的支持。om 是一位皇冠分子免疫学教授。

1. 表达奇美体结构的质粒的产生
注: 目的是产生一个质粒, 表达兴趣受体的细胞外域融合到小鼠 cd3 卵链的跨膜和细胞内域 (图 2a)。
<ol><li>检索包括信号肽在内的感兴趣受体的细胞外域序列。获取有望表达此受体的 dna 材料 (例如, cdna 或质粒)。</li>
	<li>获取表达小鼠 cd3 链 (如cdna 或质粒) 的跨膜和细胞内域的 dna 材料。</li>
	<li>根据图 2a所示的一般结构设计融合蛋白的序列。确保整个序列在同一个密码子读取框架内。此序列用于设计适当的引物并验证最终产品。</li>
	<li>设计两个 pcr 反应, 分别扩增融合蛋白的每个片段 (图 2b, 2c)10。 注: pcr 反应的具体条件 (例如, 伸长时间和退火温度) 取决于引物的性质, 引物是为特定受体设计的。<ol>
<li>放大受体的细胞外段。<ol>
<li>设计一个 5 ' 的引物, 包括受体的部分信号肽、一个 kozak 共识序列和一个适当的限制位点 (图 2b)。</li>
			<li>设计一个 3 ' 底漆, 侧翼融合蛋白的两个部分 (图 2b)。例如, 对于初始设计, 此 3 ' 引物可以包括受体的细胞外段的最后20个碱基对和 cd3 段的前9个碱基对。 注: 没有必要在 3 ' 底漆中添加限制站点, 因为此引物将用于生成融合序列, 而不用于结扎。</li>
		</ol>
</li>
		<li>放大 cd3 段。<ol>
<li>设计一个 5 ' 底漆, 侧翼融合蛋白的两个部分 (图 2c)。例如, 对于初始设计, 5 ' 引物可以包括受体细胞外段的最后9个碱基对和 cd3 段的前20个碱基对。 注: 没有必要在 5 ' 底漆中添加限制站点, 因为此引物将用于生成融合序列, 而不用于结扎。</li>
			<li>设计一个 3 ' 的引物, 其中包括 cd3 序列的末端以及一个适当的限制站点 (图 2c)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>更正这两种反应中每一种反应中的引物序列, 使退火温度在每一对中都是相似的 (请注意, 引物包括融合蛋白的两个部分的序列, 只有在每个反应中的序列的一部分退火)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>执行一个额外的 pcr, 其中使用前两种反应的 pcr 产物的混合物作为 dna 模板, 其中包括细胞外受体段的 5 ' 引物 (步骤 1.4.1.1) 和 cd3 段的 3 ' (步骤 1.4.2.2) (图 2d)10.这种反应应该会产生最终的融合序列。</li>
	<li>像往常一样进行克隆。<ol>
<li>将最终 pcr 产物与目标切割载体 (目标载体通常是 pcdna3, 表达 g418 和氨匹西林的耐受性)。</li>
		<li>将结扎的载体转化为合格的细菌11。<ol>
<li>在冰上解冻50μl 的有能力的细菌。</li>
			<li>将结扎载体添加到细菌中, 在冰上孵育20分钟。</li>
			<li>在42°c 下孵化45秒。</li>
			<li>在没有抗生素的情况下加入200μl 的 lb。</li>
			<li>在37°c 下连续晃动, 孵化1小时。</li>
			<li>具有适当抗生素的 lb 板上的种子 (例如, 最终浓度为 0.1 mg/ml 的氨匹西林溶液)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>在 lb 的5毫升 (15 毫升管中) 中收集和生长多个细菌菌落。</li>
		<li>第二天, 用迷你准备试剂盒提取质粒。</li>
		<li>用限制性酶分析基因插入物。</li>
		<li>对相关的菌落进行排序, 并验证序列和读取帧是否正确 (如步骤1.3 中所示)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将已验证的质粒转化为有能力的细菌11。<ol>
<li>在冰上解冻20μl 的有能力的细菌。</li>
		<li>将1μl 的质粒加入细菌, 在冰上孵育20分钟。</li>
		<li>在42°c 下孵化45秒。</li>
		<li>在没有抗生素的情况下加入200μl 的 lb。</li>
		<li>在37°c 下连续晃动, 孵化1小时。</li>
		<li>具有适当抗生素的细菌生长板上的种子 (例如, 最终浓度为 0.1 mg/ml 的氨匹西林溶液)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>第二天, 在一个大的 lb 容器中种植细菌菌落, 容器中含有 0.1 mgml 安培 (~ 250 毫升)。</li>
	<li>第二天, 根据套件提供的具体说明进行最大准备。 注: 对于电穿孔程序, 需要大量质粒, 详情如下。</li>
</ol>2. 表达壳蛋白的质粒转染 bw 细胞
注: 转染也可采用不同的方法 (例如, 通过慢病毒感染)。在电穿孔之前, 执行 dna 的乙醇沉淀, 如下所述。接下来的步骤需要无菌条件。
<ol><li>前天, 准备 bw5147 细胞 ("bw 细胞") 进行电穿孔。板10板 (10 厘米) 与10毫升的 100, 000 bw5147 cellsl (即总共 10 x10 6 细胞) 与 rpmi 补充10% 胎儿小牛血清 (fcs), 1% 丙酮酸钠, 1% l-谷氨酰胺, 1% 非必要氨基酸和1%青霉素链霉素 ("完整培养基")。</li>
	<li>将表达融合蛋白的 pcdna3 质粒100微克放入 1.5-2ml 管中, 并在 ph 值5.3-5.5 处加入 3 m 醋酸钠。醋酸钠的体积应相当于100微克质粒体积的 0.1 (10%); 通过添加 naoh 或 hcl, 用 ph 计滴定醋酸钠的 ph 值。</li>
	<li>如步骤2.2 所述 (质粒和醋酸钠总量的 2.5倍), 在质粒和醋酸钠的混合物中加入2.5 体积的100% 乙醇。在-20°c 下过夜或在70°c 下过夜2小时。</li>
	<li>2.4. 在 bw 细胞镀膜24小时后, 将所有 bw 细胞 (~ 100 ml) 收集到 2 50 ml 管中。在 515 x 克离心细胞5分钟, 并丢弃上清液。</li>
	<li>在一个50毫升的管中, 将两个管中的颗粒重新悬浮在一个50毫升的管中, 从25毫升的 rpmi 中重新悬浮。例如, 重新悬浮一个管的颗粒与25毫升的 rpmi-, 然后使用这种液体重新悬浮在另一个50毫升管的液体, 使 bw 细胞的总颗粒重新悬浮在25毫升的介质在一个单一的管。 注: 介质应不添加, 因为血清可能会干扰电穿孔。</li>
	<li>在 515 x克的情况下再次离心细胞5分钟。将颗粒重新悬浮在 rpmi 的1毫升中, 并将其转移到冰上0.4 厘米的立方。</li>
	<li>在 16, 000 x g 和4°c 条件下, 将经过乙醇沉淀的质粒 ( 步骤 2.3) 离心30分钟。</li>
	<li>用1毫升的70% 乙醇和离心机清洗一次, 在 16, 000 x g和4°c 的温度下再清洗 20分钟 (将盐洗掉)。</li>
	<li>取出所有乙醇, 让颗粒稍微干燥 (即, 在组织培养罩中的一个开放的管)。用以前加热到60°c 的100μl 的 rpmi 重新悬浮颗粒。</li>
	<li>将重新悬浮的质粒 (步骤 2.8) 加入幼杯中的细胞, 在冰上孵育5分钟。</li>
	<li>将电池以 0.23 kv, 250 电容进行电穿孔。这应该需要 ~ 4 毫秒。</li>
	<li>将电穿孔细胞转移到50毫升管中, 在 515 x 克处加入50毫升的完整介质和离心机5分钟.
</li>
	<li>丢弃上清液, 用50毫升的完整培养基重新悬浮细胞。</li>
	<li>将电穿孔细胞放入24井培养盘中 (每口1毫升, 共 ~ 50 口井), 在37°c 和 5% co 2 下孵育 48小时.</li>
	<li>用抗生素选择转染的细胞。在48小时后添加1毫升的完整介质, 加上 10 mgl g418 对每口井 (在现阶段, 每口井的最终体积为2毫升, 每口井的 g418 的最终浓度为 5 mg/ml)。 注: 如果质粒含有不同的抗生素耐药性, 请在此步骤之前确定杀死未转染的 bw 细胞所需的抗生素浓度。</li>
	<li>每 48小时, 小心地丢弃每口井的上体积1毫升, 而不搅拌井中的介质 (bw 细胞往往位于井底)。在每口井上加入完整的介质, 加上 5 mg/gl g418, 使每口井的最终体积再增加2毫升。</li>
	<li>定期检查所有油井的培养板的细胞生长情况。 注: 介质颜色变化为黄色可能有助于识别生长细胞;然而, 在开始的媒介将是黄色的, 因为 g418 本身。识别正井 (有生长细胞的井)。这些井具有 g418 耐药性, 因此有望表达融合蛋白。这个过程通常需要 ~ 3周。</li>
</ol>3. 验证转化受体在阳性井细胞中的表达。
<ol><li>用对转染受体的特定抗体染色转染 bw 细胞。</li>
	<li>将流式细胞术表达受体与对照细胞 (未转染的 bw 细胞) 的表达进行比较。</li>
	<li>在验证了一个或多个井之后, 立即将细胞用于实验目的, 在培养中生长, 或在将来的应用中冻结。</li>
	<li>在进行新实验之前, 验证转染受体的表达。经过几个星期的生长, 具有稳定受体表达的 g418 细胞 g418 可以从培养基中省略。</li>
</ol>4. 带目标的转染 bw 细胞的孵化
注: 首次使用转染的 bw 细胞时, 最好在表达感兴趣受体的已知配体的目标上或专门针对感兴趣的受体的板状抗体上进行测试 (交联)实验;见下文4.2.1.3 节)。
<ol><li>优选地在实验前24小时分裂 bw 细胞 (例如, 在新的10厘米培养基中添加10毫升的完整培养基至2毫升细胞)。</li>
	<li>用转染的 bw 细胞的目标进行培养。在表示空向量 (或亲本 bw 单元) 的控制 bw 单元上同时执行实验。96f 板更可取 (但也可以使用96F 板)。把实验做一式三份。挂起完整介质中的所有单元格。<ol>
<li>准备好目标目标的类型随目标的函数而变化, 可以是细胞、用抗体预先培养的细胞, 也可以是单独的抗体。该系统还以细菌为靶点5使用。<ol>
<li>如果目标是分裂细胞 (即细胞系), 在检测前将其照射在 6000 rad 处。将 50, 000个靶细胞放入96板的单井中 (体积为 100μl)。</li>
			<li>对于表达人 fcγr 的抗体和 bw 细胞的实验, 在96孔板 (例如, 目标细胞50μl 和抗体 50μl; 可以测试不同的抗体剂量) 中的冰上培养目标细胞。</li>
			<li>如果单独使用抗体作为靶点 (交联实验), 就应该对其进行平台约束。为此, 首先在37°c 和 5% co 2 的9十二f 板中的一个完整培养基中培养抗体, 时间为 2小时 (在 50μl 条件下, 典型的起始剂量为特定抗体的0.5 微克)。清洗盘子, 去除未绑定的抗体。 注: 在这种情况下, 96f 板将使抗体结合到板, 这之后转染的 bw 细胞将导致转染受体的激活。</li>
		</ol>
</li>
		<li>添加 bw 单元格 (效应单元格)。将 50, 000个 bw 电池放入96板的一口井中 (体积为 100μl)。</li>
		<li>如有必要, 将每口井中的体积完成200μl。</li>
		<li>在37°c 和 5% co2 下将板材培养 48小时 (这段时间可以校准)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>48小时后, 将板冻结在-20°C, 并在 elisa 之前解冻, 或立即用于 elisa (请参阅后续步骤)。</li>
</ol>5. 酶联免疫吸附
<ol><li>用抗小鼠 il-2 抗体 (抗 mil-2) 涂上 elisa 板。将0.05μg 的抗 mil-2 放入50μl 的体积中, 每口 1 x pbs。在4°c 或37°c 时, 用抗 mil-2 抗体将涂层 elisa 板隔夜培养2小时。 注: 要在潜伏期后直接进行 elisa, elisa 板应在 bw 细胞潜伏期结束前24小时涂覆。</li>
	<li>丢弃 elisa 板中的液体, 加入由 1x pbs 和1% 牛血清白蛋白 (bsa) 组成的阻滞溶液 (每口井 200μl)。在室温下将 elisa 板培养2小时。</li>
	<li>用0.05% 的 pbs tween 溶液 (即在1 升1升 pbs 中的 tewen-20 0.5 ml) 清洗 elisa 板三次。</li>
	<li>以96片为例, 其中有与目标孵育的 bw 细胞 (4.3)。如果盘子被冷冻, 完全解冻 (例如, 在37°c 下进行短距离孵育)。离心96板 (5分钟, 515 x g), 并小心地将每口井中的100微克上清液转移到预涂布和堵塞的 elisa 板上。 注: 上清液应从每口井的两侧收集, 以避免取细胞。</li>
	<li>如果需要, 将具有定义浓度的重组 mil-2 添加到涂层 elisa 板的空行中, 以生成 mil-2 的标准曲线。例如, 从 mil-2 浓度 2, 500 pgml 开始, 然后在以后的每口井中减少 50%;不要在最后一口井中添加 mil-2。</li>
	<li>在4°c 下隔夜或37°c 时将 elisa 板培养2小时。</li>
	<li>用 pbs 补间清洗弹性免疫板四次。</li>
	<li>在 elisa 板中加入生物素抗小鼠白细胞介素-2。在1毫升的 1x pbs 中使用1μg 抗体的浓度, bsa 为 1%, 并分为 100μl/口。</li>
	<li>在室温下孵化1小时。</li>
	<li>用 pbs 补间清洗弹性免疫板六次。</li>
	<li>添加 hrp 共轭链霉素。在 1 毫升的 pbsx1 中使用1μl链霉素的浓度和 1% 的 bsa , 并将其分为100μl / 。</li>
	<li>在室温下孵化30分钟。</li>
	<li>用 pbs 补间清洗弹性免疫板六次。</li>
	<li>每井添加100μl 的 tmb 基板溶液。快速完成此阶段, 以最大限度地减少添加 tmb 时由于时滞而导致的油井之间的差异。</li>
	<li>阅读 elisa 板与 elisa 板读取器在 650 nm (读取可以重复, 如果信号弱)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. 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提交人声明没有相互竞争的经济利益。

在这里, 我们提出了一个用于生成记者系统来调查受体配体相互作用的协议 (见1中该协议的缩写形式)。该协议由三个主要部分组成: 克隆嵌合蛋白, 其中包括融合到 cd3 细胞内域的特定受体的细胞外域, 表达融合蛋白的质粒转染到 bw 细胞 (例如。电穿孔), 并通过 elisa 定量检测小鼠白细胞介素-2。每个部分的最终产品都应独立验证: 克隆过程应通过对目标质粒中融合蛋白的完整测序进行验证, bw 细胞的转染应通过检查bw 细胞中感兴趣的受体 (例如流式细胞仪) 和 elisa 过程应通过一般阳性对照 (例如重组 mil-2) 以及转染 bw 细胞的特定控制进行验证;即表达感兴趣受体的已知配体的目标 (例如, 表达 cd48 的细胞可用作表达 nk 细胞受体2b4 的 bw 细胞的阳性对照)。例如, 克隆过程可能是成功的, 但融合蛋白不是由 bw 细胞表达的。在这种情况下, 应重复电穿孔。或者, 如果 elisa 板的背景水平以上没有信号 (特别是对于正控制), 转染的 bw 细胞可能无法表达受体 (或表达式丢失) 或技术问题可能发生在酶联免疫吸附法过程。
在保留该程序的一般原则的同时, 可以对该议定书进行一些修改。这些修改包括用于表达融合蛋白的载体、将质粒转染 bw 细胞的方法以及与培养和 elisa 相关的特定参数, 如目标类型 (如细胞、抗体等). , 目标细胞的数量或抗体浓度 (我们使用 50, 000 细胞每口井和抗体起始剂量 0.5μg/well), 孵化时间 (我们使用48小时的孵化时间) 和转移到 elisa 板的上清液体积。
这种方法是敏感的, 具体的, 可以很容易地量化。它是筛选特定受体配体存在的理想选择 (特别是在配体本身尚未被识别的情况下)。在准备了表达特定受体的转染 bw 细胞后, 这些细胞可以被冷冻并在需要时用于额外的实验。我们和其他人在以前的研究中成功地利用了这一系统来探索受体配体相互作用 (例如2、3、5、12、13、14 15、16) 并通过其他技术验证了该系统的结果。该方法也可用于研究不同人体 fcγr 受体的抗体激活, 如已做的抗病毒抗体在血清6,7,8或单克隆抗体对 cd209个。
由于这是一个只表达受体细胞外段的记者系统, 因此该系统获得的结果应得到与内源受体的额外实验的补充, 如自然的细胞毒性检测杀手 (nk) 细胞, 用于研究与 nk 细胞受体的相互作用。此外, 某些 ligand/受体相互作用可能不会导致胶片-2 分泌由记者系统, 因此可能会被忽视。此外, 与任何实验设置一样, 应验证上述各种参数的结果。这在需要比较两个条件 (例如, 通过不同的抗体激活相同的 fc 受体) 的情况下尤其重要。同样重要的是要验证特定配体受体相互作用的敏感性是在系统的线性范围内。否则, 这可能会导致饱和值, 从而排除跨条件进行有效比较的可能性。这可以通过使用 mil-2 标准曲线以及使用测试配体生成剂量-响应曲线来实现 (在饱和值的情况下, 应修改实验参数;例如, 应通过 elisa 分析较小体积的上清液)。该系统的另一个可能的限制是使用内源性 mil-2 分泌物的靶细胞 (例如, 小鼠 t 细胞), 这将掩盖 bw 细胞的 il-2 分泌。为了克服这些局限于老鼠细胞的极不寻常的事件, 可以使用目标细胞不表达的不同的记者 (如gfp) 来改进记者系统。

bw 记者系统是研究受体配体相互作用的一种技术1。该系统是特别有利的, 当一个特定受体的配体是未知的或实验与内源性配体是技术上困难的。它也可用于研究单克隆抗体与人 fcγr 的结合。该方法是基于在小鼠 bw 细胞中表达嵌合蛋白。这种嵌合蛋白是由融合到小鼠的跨膜和细胞内的细胞内域的感兴趣的受体的细胞外域组成的。受体适当配体的结合会导致小鼠白细胞介素-2 的分泌, elisa 可以很容易地检测到, 如图 1所示。这种方法是敏感的, 特定于个人受体, 易于操作, 并具有高度的重现性。因此, 它可以补充研究受体配体相互作用的其他工具。例如, 它可以用来筛选几个细胞系, 以确定特定受体是否存在配体 (即使配体本身尚未确定), 也可以检测人类 fcγr 通过单克隆抗体或含有抗病毒的人血清的激活情况抗体。虽然原代免疫细胞表达内源性 fcγr, 但它们一般难以处理, 通常表达几种 fc 受体。
我们在许多研究中成功地使用了这一系统来描述受体-配体相互作用。这些措施包括确定血尿苷作为 nk 细胞受体 nkp462 的配体, 鉴定 pvr 和果胶-2 作为人类和小鼠 tigit3,4 的配体, 并表明 figobi 细胞核细菌结合和激活人类 tigit5。此外, 表达 fc 受体的 bw 细胞已被成功地用于检测患者血清6、7、8 中的抗病毒抗体。具体而言, 我们最近建立了表达人 fcγr 的 bw 细胞, 以检测用于治疗慢性淋巴细胞白血病 (cll) 的抗 cd20 抗体的差异 fcr 激活.重要的是, bw 记者系统的结果已在互补实验中得到验证。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

受体和配体之间的相互作用是一个基本的生物过程。然而, 直接实验细胞, 表达本机受体和配体是具有挑战性的, 因为一个特定受体的配体可能是未知的, 实验程序与本机配体可能是技术上复杂的。为了解决这些障碍, 我们描述了一个记者系统, 以检测结合和激活的特定受体的配体感兴趣。在本报告系统中, 特定受体的细胞外域与小鼠 cd3 结合, 然后在小鼠 bw 细胞中表达这种嵌合蛋白。然后, 这些转染的 bw 细胞可以用不同的靶点 (如细胞或抗体) 孵育。转染受体的激活会导致小鼠白细胞介素-2 (mil-2) 的分泌, 酶联免疫吸附法 (elisa) 可以检测到这种情况。本报告系统具有对单个受体敏感和特异的优点。此外, 特定受体的激活水平可以很容易地量化, 甚至可以在受体的配体未知的情况下使用。该系统已在我们的许多研究中成功实施, 以表征受体-配体相互作用。我们最近使用该系统研究了人体 fcγ受体 (fcγ. r) 在临床上的激活不同单克隆抗 cd20 抗体。

图 3说明了 bw 报告系统的实验结果。在本实验中, cll 细胞用不同的抗 cd20 抗体 (利妥昔单抗和 obinutuzumab) 进行预培养, 然后与表达 cd16a-cd3 的转染 bw 细胞共同培养。我们的研究也进行了类似的实验.图 3a显示了原始 elisa 板的图像, 其中颜色强度与 mil-2 的浓度相对应。实验一式三份。本实验包括几种对照: 用父母未转染的 bw 细胞 (上排) 培养的 cll 细胞和用 bw 细胞培养的 cll 细胞, 这些细胞表达 cd16a-cd3 细胞, 这些细胞表达 cc16a-cd3, 但没有抗体, 但没有抗体, 也没有对照抗体 (左边第二排有六口井).用抗 cd20 抗体预先培养的 cll 细胞培养 cd16 的 bw 细胞, 与 mil-2 水平的对照井相比, 诱导了 mil-2 的显著分泌。重要的是, 与抗 cd20 obinutzumab 的 cll 细胞的预培养比利妥昔单抗更强烈地激活了 cd16, 我们的系统对这一已知的发现进行了重述。最后一行显示重组 mil-2 的预定义浓度下降 (不添加细胞)。最后一行中的右井没有 mil-2, 表示背景读数, 看起来类似于控制井。图 3b显示了 elisa 板结果的量化, 如图 3B所示。根据重组 mil-2 的标准曲线, 将光学密度 (od) 水平转化为 mil-2 浓度。图 3c给出了一个剂量反应实验, 用 cll 细胞预先培养不同剂量的抗体, 然后用表达 cd16 的 bw 细胞孵育。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> 图 1: bw 报告系统的原理图表示.bw5147 细胞可稳定地转染不同受体的细胞外部分融合到小鼠 cd3 链的跨膜和细胞质域 (嵌合式直肠-cd3)。通过配体激活特定受体-cd3, 导致 mil-2 分泌物, 可通过 elisa 检测到。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> 图 2: 嵌合体受体的结构和 pcr 引物的设计.(a) 细胞外受体融合到小鼠 cd3 的跨膜和细胞内域的一般结构。(b) 受体的细胞外域被扩增 3 ' 引物, 其中也包括 cd3 的核苷酸。(c) cd3 的细胞内和跨膜域被扩增为 5 ' 引物, 其中也包括受体核苷酸。(d) 在最后的 pcr 反应中, 两个具有重叠序列的片段都被用作 dna 模板。在所有的图形面板中, 不同的蛋白质域都是彩色编码和盒装的蓝色矩形 (cd3 序列) 和红色矩形 (受体序列)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> 图 3: bw 报告系统最终产品的示意图.(A、B、C)cll 细胞是预先培养的, 有或没有两种抗 cd20 抗体 (利妥昔单抗和奥布苏珠单抗) 或对照抗体。随后, 用亲本 bw 细胞或表达 cd16a-cd3 的 bw 细胞培养抗体结合细胞。采用 elisa 法测定上清液中 mil-2 的含量。(a) 原始 elisa 板的图像。颜色强度表示上清液中 mil-2 的浓度。实验一式三份。下一排显示 elisa 读数在降低浓度的重组 mil-2, 并在同一板块中进行分析。(b) (b) (a) 所示 elisa 读数的量化。mil-2 水平是使用 mil-2 的标准曲线计算的。(c) 剂量反应实验, 用 cll 细胞预先培养不同剂量的抗体, 然后用表达 cd16a-cd3 的 bw 细胞孵育。, p < 0.001;学生 t 测试 (b) 或方差分析与多个比较 (c)。在 (c) 中, 唯一没有显著差异的比较是利妥昔单抗和控制 ab 在第一浓度 (0.01μg/ml)。误差线表示三重奏的标准偏差。作为我们最近研究的一部分, 也进行了类似的实验.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

该协议描述了如何建立一个可用于识别和量化受体配体相互作用的记者系统。

一种研究受体配体相互作用的 bw 报告系统

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.BW 报告器系统能够研究受体配体相互作用。在特定受体的配体未知的情况下，或在内源配体实验在技术上困难的情况下，它非常有用。这种方法是敏感和特定于单个受体，易于操作和重复。演示程序将是希拉卡隆，我的实验室博士后。转染前一天，10个板与10毫升10万BW5147细胞，并补充RPMI。然后将100微克的PCDNA3质粒放在管子中。在pH 5.3下加入醋酸钠到管子中。在此之后，在质粒混合物中加入2.5卷100%乙醇。然后在零下20摄氏度下孵育质粒混合物过夜。电镀BW细胞24小时后，将细胞收集在两个50毫升的管子中。然后在515g的离心5分钟，并丢弃上一代。在不添加任何添加的情况下重新发送 peloton RPMI 并重复离心。将产生的颗粒重新用 1 毫升的 RPMI 中重新暂停，无需添加。将重新暂停的颗粒转移到冰上 4 厘米的冰块中。离心接受乙醇沉淀的质粒。然后用一毫升70%乙醇清洗质粒。再重复离心20分钟取出所有乙醇，让颗粒部分干燥。然后将颗粒重新在 100 微升预热 RPMI 中，无需添加。在此之后，将重新暂停的质粒添加到细胞中。在冰上孵化细胞五分钟。接下来，电分电池。然后将电分电池转移到50毫升管中。在管中加入50毫升完整介质，在515克的离心机中加热5分钟。丢弃上一个重物，在50毫升的完整介质中重新暂停细胞。然后在24井培养皿中盘制细胞，并孵育细胞48小时。在此之后，添加一毫升的完整介质，每毫升G41810补充10毫克到每一个井。48小时后，丢弃每井上部一毫升的上体积。然后添加一毫升完整的介质，每毫升G418补充5毫克到每一个井。在96井板的单一井中，使用5万个转染BW细胞及其所需的靶点。孵育板48小时。然后在零下20摄氏度时将盘子冻结。涂上具有抗小鼠IL-2抗体的ELISA板。将05微克的防鼠IL-2，在每井中放置50微升PBS。在摄氏四度下孵育涂层板过夜。使用37摄氏度的短暂孵育期，解冻以前用目标孵育的冷冻BW细胞。然后将板离心，将 100 微升的上一液从每个井转移到预涂层的 ELISA 板。并在37摄氏度下孵育两小时。在此之后，将生物素抗小鼠IL-2添加到ELISA板中。然后孵育和洗涤后，将HRP结合的链球菌素加入到盘子中。孵育和洗涤后，在ELISA板的每个井中加入100微升的TMB基板溶液。最后读取 650 纳米的 ELISA 板。在此示例中，CLL 细胞用不同的抗 CD20 抗体进行预孵化。然后与表达Fc受体CD16的转染BW细胞共同孵育，然后用ELISA进行分析。使用 ELISA 分析后，结果进行了量化。光学密度水平，根据标准曲线转换为小鼠IL-2浓度。在另外一项实验中，不同剂量的抗CD20抗体与CLL细胞进行预孵化。然后用转染的BW细胞孵育。该粒子包含四个主要部分。BW 细胞的克隆、转染、活化和 ELISA。每个部件都应独立验证。按照这个程序，可以对表达内源受体的细胞进行额外的实验，例如用NK细胞杀死酸，以研究与NK细胞受体的相互作用。我们利用这个系统发现了NK细胞受体的新配体。例如，下凝蛋白是 NKp46 的配体，PVL 是 TG 的配体。

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Biology

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