Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Les auteurs remercient Esther Singer pour l’édition de langue. Cette étude a été financée par le Conseil européen de la recherche au titre du septième Programme-cadre de l’Union européenne (FP/2007-2013) / numéro de convention de subvention ERC 320473-BacNK. A été confortée par le je-CORE programme du Comité budgétisation et de la planification et de l’Israel Science Foundation et le je-Core sur la chromatine et l’ARN dans la régulation des gènes, de la fondation de GIF, de la fondation de la famille Lewis, la subvention de professorat ICRF, le Helmholtz Israël grant et la confiance de Rosetrees (tous à O.M.). Cette étude a été également soutenue par la fondation de sciences d’Israël (subvention 502/15), le Kass Medical Research Award et une bourse de recherche de l’Israël société d’hématologie et de la médecine transfusionnelle (au sager). Occre enseigne couronne d’immunologie moléculaire.

1. génération d’un plasmide qui exprime la chimère pour construire
Remarque : Le but est de générer un plasmide qui exprime le domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt fusionné vers les domaines transmembranaires et intracellulaires de la souris CD3ζ chaîne (Figure 2 a).
<ol><li>Récupérer la séquence du domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt comme le peptide signal. Obtenir du matériel d’ADN qui est censée exprimer ce récepteur (par exemple, de cDNA ou un plasmide).</li>
	<li>Obtenir le matériel ADN qui exprime la transmembranaire et les domaines intracellulaires de la souris CD3ζ chaîne (e.g., cDNA ou un plasmide).</li>
	<li>Concevoir la séquence de la protéine de fusion basée sur la structure générale illustrée dans la Figure 2 a. S’assurer que la séquence entière est dans le même cadre de lecture codon. Cette séquence est utilisée pour concevoir des amorces appropriées et vérifier le produit final.</li>
	<li>Concevoir des deux réactions de PCR pour amplifier chacun des fragments des protéines fusion séparément (Figure 2 b, 2C)10. Remarque : Les conditions spécifiques pour les réactions de PCR (e.g., temps de l’élongation et la température de recuit) dépendent de la nature des amorces, qui sont conçus pour un récepteur spécifique.<ol>
<li>Amplifier le segment extracellulaire du récepteur.<ol>
<li>Concevoir un apprêt 5' qui comprend une partie du peptide signal du récepteur, une séquence consensus de Kozak et un site de restriction appropriée (Figure 2 b).</li>
			<li>Concevoir un apprêt 3' qui borde les deux parties de la protéine de fusion (Figure 2 b). Par exemple, pour la conception initiale, cette amorce 3' peut inclure les 20 dernières paires de bases du segment extracellulaire du récepteur et les 9 premiers paires de bases du segment CD3ζ. Remarque : Il est inutile d’ajouter un site de restriction à l’amorce de 3', puisque cette amorce sera utilisée pour générer la séquence fusionnée et n’est pas utilisée pour la ligature.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplifier le segment CD3ζ.<ol>
<li>Concevoir une amorce 5' qui borde les deux parties de la protéine de fusion (Figure 2). Par exemple, pour la conception initiale, l’apprêt 5' peut inclure les 9 dernières paires de bases du segment extracellulaire du récepteur et les 20 premières paires de bases du segment CD3ζ. Remarque : Il est inutile d’ajouter un site de restriction à l’amorce de 5', puisque cette amorce sera utilisée pour générer la séquence fusionnée et n’est pas utilisée pour la ligature.</li>
			<li>Concevoir une amorce 3' qui comprend la fin de la séquence de CD3ζ, mais aussi un site de restriction appropriée (Figure 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Corriger les séquences des amorces dans chacune de ces deux réactions afin que la température de recuit est similaire dans chaque paire (Notez que l’amorce, qui comprend des séquences des deux parties de la protéine de fusion, recuits uniquement avec la partie de la séquence dans chaque réaction).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une PCR supplémentaire dans lequel un mélange des produits des deux premières réactions PCR est utilisé comme la matrice d’ADN avec l’apprêt 5' du segment des récepteurs extracellulaires (étape 1.4.1.1) et la 3' du segment CD3ζ (étape 1.4.2.2) (Figure 2D)10 . Cette réaction doit générer la séquence fusionnée finale.</li>
	<li>Procéder comme d’habitude pour le clonage.<ol>
<li>Ligaturer le produit final de PCR à la cible couper le vecteur (le vecteur de la cible est habituellement pcDNA3 qui exprime la résistance G418 et ampicilline).</li>
		<li>Transformer le vecteur ligaturé en bactéries compétentes11.<ol>
<li>Décongelez les 50 µL des bactéries compétentes sur la glace.</li>
			<li>Ajouter le vecteur ligaturé aux bactéries et incuber sur la glace pendant 20 min.</li>
			<li>Incuber à 42 ° C pendant 45 s.</li>
			<li>Ajouter 200 µL de LB sans antibiotiques.</li>
			<li>Incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation continue.</li>
			<li>Graine sur un plat de livre avec les antibiotiques appropriés (par exemple, ampicilline solution avec une concentration finale de 0,1 mg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Recueillir et poussent plusieurs colonies bactériennes dans 5 mL de LB (en tubes de 15 mL).</li>
		<li>Le lendemain, extraire les plasmides avec un mini kit de préparation.</li>
		<li>Analyser l’insertion de gènes avec des enzymes de restriction.</li>
		<li>Séquencer les colonies concernées et vérifiez que la séquence et la trame de lecture sont corrects (comme indiqué dans l’étape 1.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformer le plasmide vérifié en bactéries compétentes11.<ol>
<li>Décongelez les 20 µL des bactéries compétentes sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 1 µL du plasmide dans les bactéries et incuber sur la glace pendant 20 min.</li>
		<li>Incuber à 42 ° C pendant 45 s.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de LB sans antibiotiques.</li>
		<li>Incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation continue.</li>
		<li>Graine sur une plaque de croissance bactérienne avec des antibiotiques appropriés (par exemple, ampicilline solution avec une concentration finale de 0,1 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le lendemain, poussent une colonie bactérienne dans un grand conteneur LB avec l’ampicilline 0,1 mg/mL (~ 250 mL).</li>
	<li>Le lendemain, effectuer la préparation Maxie selon les instructions spécifiques fournis par le kit. Remarque : Pour la procédure de l’électroporation, une grande quantité de plasmide est requise, tel que décrit ci-après.</li>
</ol>2. la transfection du plasmide qui exprime la protéine chimérique dans les cellules de BW
NOTE : Différentes méthodes peuvent également servir pour la transfection (e.g., par infection des gènes). Avant l’électroporation, effectuer la précipitation d’éthanol de l’ADN comme décrit ci-dessous. Les étapes suivantes nécessitent des conditions stériles.
<ol><li>La veille, préparer les BW5147 des cellules (« BW ») pour l’électroporation. RPMI additionné de sérum de veau foetal de 10 % (FCS), le pyruvate de sodium 1 %, 1 % L-glutamine, 1 % des acides aminés non essentiels et 1 % la plaque 10 plaques (de 10 cm) avec 10 mL de-BW5147 100 000 cellules/mL (c'est-à-dire, un total de 10 x 106 cellules) pénicilline-streptomycine (« milieu complet »).</li>
	<li>Placer 100 µg du plasmide pcDNA3 qui exprime la protéine de fusion dans un tube de 1,5 à 2 mL et ajouter l’acétate de sodium 3M à un pH de 5,3 à 5,5. Le volume de l’acétate de sodium doit correspondre à 0,1 (10 %) du volume du plasmide µg 100 ; titrer le pH de l’acétate de sodium avec un pH-mètre en ajoutant NaOH ou HCl.</li>
	<li>Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 100 % à la mêlée le plasmide de l’acétate de sodium comme décrit dans l’étape 2.2 (2,5 fois le volume total d’acétate de sodium et de plasmide). Incuber une nuit à-20 ° C ou pendant 2 h à 70 ° C.</li>
	<li>2.4. 24h après que les cellules BW ont été plaqués, recueillir toutes les cellules de BW (~ 100 mL) dans des tubes de 2 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 515 x g et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans les deux tubes de 25 mL de RPMI - dans un tube unique de 50 mL. Resuspendre le culot d’un tube de 25 mL de RPMI - ainsi, puis utilisez ce liquide pour remettre en suspension le liquide dans l’autre tube de 50 mL pour que le diabolo total des cellules BW est remis en suspension dans 25 mL de milieu dans un tube unique. Remarque : Le support doit être sans ajouts, étant donné que le sérum puisse gêner d’électroporation.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 515 x g. Resuspendre le culot dans 1 mL de RPMI et verser le contenu dans une cuvette de 0,4 cm sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger le plasmide qui subit la précipitation d’éthanol (étape 2.3) pendant 30 min à 16 000 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Laver une fois avec 1 mL d’éthanol à 70 % et centrifuger pendant 20 min à 16 000 x g et 4 ° C (pour rincer le sel).</li>
	<li>Retirer tout l’éthanol et de sécher le culot légèrement (c'est-à-dire, dans un tube ouvert dans la hotte de la culture de tissus). Resuspendre le culot avec 100 µL de milieu RPMI-préalablement chauffée à 60 ° C.</li>
	<li>Ajouter le plasmide remises en suspension (étape 2,8) pour les cellules dans la cuve et laisser incuber 5 min sur glace.</li>
	<li>Electroporate les cellules à 0,23 kV, 250 capacitation. Cela devrait prendre environ 4 ms.</li>
	<li>Transférer l’électroporation des cellules dans un tube de 50 mL, ajouter 50 mL de milieu complet et centrifuger pendant 5 min à 515 x g.
</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 50 mL de milieu complet.</li>
	<li>Les cellules d’électroporation de pétri 24 puits (1 mL par puits, pour un total de ~ 50 puits) sur plaque et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 48 h.</li>
	<li>Sélectionnez les cellules transfectées avec des antibiotiques. Après 48 h, ajouter 1 mL de milieu complet additionné de 10 mg/mL G418 dans chaque puits (à ce stade le volume final de chacun est bien 2 mL et la concentration finale de G418 chacune est bien 5 mg/mL). Remarque : Si le plasmide contient une résistance aux antibiotiques différente, déterminer la concentration d’antibiotique requise pour tuer les cellules BW celllulaire avant cette étape.</li>
	<li>Toutes les 48 h, jeter avec précaution 1 mL du volume supérieur de chaque puits sans remuer le milieu dans le puits (les cellules BW ont tendance à être au fond du puits). Ajouter complet additionné de 5 mg/mL G418 dans chaque puits, alors que le volume final de chaque puits est de nouveau 2 mL.</li>
	<li>Examiner régulièrement les plaques de culture pour la croissance cellulaire dans tous les puits. Remarque : Un changement de la couleur du milieu au jaune peut aider à identifier les cellules en croissance ; Cependant, au début le milieu apparaît en jaune à cause de la G418 lui-même. Identifier les puits positifs (puits avec les cellules en croissance). Ces puits sont G418 résistants et par conséquent sont attendus pour exprimer la protéine de fusion. Ce processus prend habituellement environ 3 semaines.</li>
</ol>3. vérification de l’Expression du récepteur Transfecté dans des cellules dans les puits positifs.
<ol><li>Colorer les cellules transfectées de BW avec un anticorps spécifique contre le récepteur qui a été transfecté.</li>
	<li>Comparez le niveau d’expression du récepteur par cytométrie de flux pour l’expression des commande (cellules celllulaire BW).</li>
	<li>Après vérification d’un ou plusieurs puits, utiliser immédiatement des cellules à des fins expérimentales, poussent en culture ou congeler pour de futures applications.</li>
	<li>Vérifier l’expression du récepteur transfectée avant de procéder à une nouvelle expérience. Après quelques semaines de croissance, les cellules avec G418 avec une expression de récepteurs stable, G418 peut être omis dans le milieu de culture.</li>
</ol>4. l’incubation des cellules transfectées BW avec cibles
Remarque : Lorsque vous utilisez les cellules transfectées de BW pour la première fois, il est préférable de les tester sur des cibles qui expriment un ligand connu du récepteur d’intérêt ou sur plaque lié aux anticorps spécifiquement dirigés contre le récepteur d’intérêt (réticulation expériences ; voir ci-dessous, section 4.2.1.3).
<ol><li>De préférence, séparer les cellules BW 24h avant l’expérience (par exemple, en ajoutant 10 mL de milieu complet à 2 mL de cellules en culture dans une nouvelle plaque de culture de 10 cm).</li>
	<li>Incuber les cellules transfectées de BW avec leurs cibles. Réaliser l’expérience en même temps sur les cellules de contrôle BW qui expriment un vecteur vide (ou cellules parentales de BW). 96F plaques sont préférables (mais 96U plaques peuvent également être utilisés). Réaliser l’expérience en triple exemplaire. Suspendre toutes les cellules dans le milieu complet.<ol>
<li>Préparer les cibles. Le type de cible varie en fonction de l’objectif et peut être des cellules, des cellules qui ont été préalablement incubées avec l’anticorps, ou seul. Ce système a également servi avec des bactéries cibles5.<ol>
<li>Si les cibles sont divisant les cellules (c.-à-d., les lignées de cellules), elles irradient à 6 000 rad avant le dosage. Place 50 000 des cellules cibles dans un seul puits d’une plaque de 96 (dans un volume de 100 µL).</li>
			<li>Des expériences avec des anticorps et des cellules de BW qui expriment la FcγRs humaine, incuber les cellules cibles avec un anticorps sur la glace dans une plaque 96 puits (par exemple, 50 µL de cellules cibles et 50 µL de l’anticorps ; doses d’anticorps différents peuvent être testés).</li>
			<li>Si vous utilisez des anticorps seuls comme cibles (des expériences de réticulation), ils devraient être lié aux plaques. À cet effet, tout d’abord incuber les anticorps dans un milieu complet dans une plaque 96F pendant 1-2 h à 37 ° C et 5 % de CO2 (une dose initiale typique est de 0,5 μg d’un anticorps spécifique dans 50 μL). Laver la plaque pour retirer les anticorps non fixés. Remarque : dans ce cas, une plaque 96F permettra la liaison de l’anticorps à la plaque, qui, après addition des cellules transfectées BW, conduira à l’activation du récepteur transfectée.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ajouter les cellules BW (cellules effectrices). Cellules de lieu 50 000 P.C. dans un seul puits d’une plaque de 96 (dans un volume de 100 µL).</li>
		<li>Compléter le volume à chaque puits à 200 µL si nécessaire.</li>
		<li>Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 48 h (ce délai peut être calibré).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après 48 h, geler les plaques à-20 ° C et décongélation avant ELISA, ou utiliser immédiatement pour ELISA (voir prochaines étapes).</li>
</ol>5. ELISA
<ol><li>Recouvrir une plaque ELISA avec anticorps anti-souris IL-2 (anti-mIL-2). Placez 0,05 µg / mIL-2 dans un volume de 50 µL de PBS 1 x / puits. Incuber la plaque ELISA couchée avec l’anticorps anti-mIL-2 à 4 ° C durant la nuit ou à 37 ° C pendant 2 h. Remarque : Pour exécuter ELISA directement après l’étape d’incubation, la plaque ELISA devrait être enduite 24h avant la fin de la période d’incubation des cellules BW.</li>
	<li>Jeter le liquide dans la plaque ELISA et ajouter une solution de saturation (200 µL / puits) qui est composée de 1 x PBS et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber les plaques ELISA pendant 2 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver la plaque ELISA trois fois avec 0,05 % solution de PBS Tween (c.-à-d., 0,5 mL de Tween-20 dans 1 litre de PBS 1 x).</li>
	<li>Prendre la plaque 96 qui a les cellules BW qui ont été incubées avec leurs cibles (4.3). Si la plaque a été gelée, complètement décongelez-le (e.g., par courte incubation à 37 ° C). Centrifuger la plaque 96 (5 min, 515 x g) et soigneusement transférer 100 µL de surnageant de chaque puit la plaque ELISA revêtus et bloqués. Remarque : Le liquide surnageant doit être prélevé sur les côtés de chaque puits pour éviter de prendre des cellules.</li>
	<li>Si désiré, ajouter recombinant mIL-2 avec des concentrations déterminées à l’une des lignes vides de la plaque ELISA enduite pour générer la courbe d’étalonnage du mIL-2. Par exemple, commencer mIL-2 concentration de 2 500 pg/mL et ensuite diminuer de 50 % dans chaque puits ultérieures ; ne pas ajouter mIL-2 du dernier bien.</li>
	<li>Incuber les plaques ELISA à 4 ° C durant la nuit ou à 37 ° C pendant 2 h.</li>
	<li>Laver la plaque ELISA quatre fois avec PBS Tween.</li>
	<li>Ajouter biotine anti-souris IL-2 à la plaque ELISA. Utiliser une concentration de 1 µg anticorps dans 1 mL de PBS 1 x avec 1 % de BSA et divisez en 100 µL / puits.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Laver la plaque ELISA six fois avec PBS Tween.</li>
	<li>Ajouter HRP conjugué streptavidine. Utiliser une concentration de 1 µL streptavidine dans 1 mL de PBSX1 avec 1 % de BSA et divisez-le en 100 µL / puits.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Laver la plaque ELISA six fois avec PBS Tween.</li>
	<li>Ajouter 100 µL / puits de substrat TMB. Terminer cette étape rapidement afin de minimiser les différences entre les puits en raison des décalages dans le temps lorsque vous ajoutez le TMB.</li>
	<li>Lire la plaque ELISA avec un lecteur de plaque ELISA à 650 nm (la lecture peut être répété si le signal est faible).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. 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Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Nous présentons ici un protocole permettant de générer un système rapporteur pour étudier les interactions ligand-récepteur (voir la forme abrégée du présent protocole à1). Le protocole est composé de trois parties principales : clonage d’une protéine chimérique, ce qui inclut le domaine extracellulaire d’un récepteur spécifique fondue au domaine intracellulaire de CD3ζ, transfection d’un plasmide qui exprime la protéine de fusion de cellules de BW (par exemple , par électroporation) et détection quantitative de souris IL-2 par ELISA. Le produit final de chacune de ces pièces doit être vérifié indépendamment : le processus de clonage devraient être vérifié par un séquençage complet de la protéine de fusion dans le plasmide de cible, la transfection des cellules BW doit être vérifiée en examinant l’expression de la récepteur d’intérêt dans les cellules de BW (p. ex., par cytométrie en flux) et le processus d’ELISA doit être vérifiée par des contrôles positifs générales (p. ex., recombinant mIL-2), ainsi qu’avec des contrôles spécifiques pour les cellules transfectées de BW ; par exemple, les cibles qui expriment un ligand connu du récepteur d’intérêt (par exemple, les cellules que CD48 express peut être utilisé comme témoin positif pour les cellules de BW qui expriment le NK cell receptor 2 b 4). Par exemple, le processus de clonage peut réussir, mais la protéine de fusion n’est pas exprimée par les cellules de BW. Dans ce cas, l’électroporation doit être répétée. Ou bien, si il n’y a aucun signal au-dessus du niveau de fond de la plaque ELISA (en particulier pour les contrôles positifs) les cellules transfectées de BW semble ne pas avoir expriment le récepteur (ou l’expression a été perdue) ou un problème technique est survenu au cours de le processus d’ELISA.
Plusieurs modifications peuvent être effectuées, au présent protocole, tout en préservant les principes généraux de la procédure. Ces modifications incluent le vecteur utilisé pour exprimer la protéine de fusion, la méthode pour transfectants le plasmide aux cellules de BW et de paramètres spécifiques liés à l’incubation et ELISA comme le type de cible (par exemple, cellules, anticorps, etc.) , nombre de cellules cibles ou la concentration d’anticorps si nécessaire (nous utilisons 50 000 cellules par puits et d’un anticorps à partir de la dose de 0,5 µg/puits), temps d’incubation (nous utilisons un temps d’incubation de 48 h) et le volume de surnageant qui est transféré à la plaque ELISA.
Cette méthode est sensible, spécifique et peut être facilement quantifié. Il est idéal pour le dépistage de la présence de ligands des récepteurs spécifiques (surtout si le ligand lui-même n’a pas été reconnu). Après avoir préparé les cellules transfectées de BW qui expriment un récepteur spécifique, ces cellules peuvent être congelés et utilisées au besoin pour d’autres expériences. Nous et autres avons utilisé ce système avec succès dans des études antérieures d’explorer les interactions ligand-récepteur (par exemple2,3,5,12,13,,14 15,16) et les résultats obtenus par ce système ont été vérifiés par d’autres techniques. Cette méthode peut aussi servir à étudier l’activation des différents récepteurs FcγR humains par des anticorps, comme a été fait pour des anti-viraux anticorps dans le sérum6,7,8 , ou avec des anticorps monoclonaux contre CD20 9.
Puisqu’il s’agit d’un système dans lequel seul le segment extracellulaire du récepteur s’exprime, les résultats obtenus par ce système devraient être complétées par des expériences additionnelles avec les récepteurs endogènes, telles que les analyses de cytotoxicité naturelle récepteurs de cellules des cellules tueuses (NK) pour étudier les interactions avec le NK. En outre, certaines interactions ligand/récepteur ne peuvent aboutir à une sécrétion de mIL-2 par le système de journaliste et pourraient donc être négligées. En outre, comme dans n’importe quelle installation expérimentale, les résultats doivent être vérifiées pour différents paramètres tel que décrit ci-dessus. Ceci est particulièrement important dans les cas où une comparaison des deux conditions est requis (par exemple, l’activation d’un même récepteur de Fc par types d’anticorps). Il est également important de vérifier que la sensibilité d’une interaction ligand-récepteur spécifique est dans la gamme linéaire du système. Dans le cas contraire, cela pourrait conduire à des valeurs de saturation qui peuvent s’opposer à une comparaison valable dans l’ensemble des conditions. Ceci peut être réalisé en utilisant une courbe standard mIL-2 et en générant une courbe dose-réponse avec le ligand testé (dans le cas de saturer les valeurs, les paramètres expérimentaux devraient être modifiées ; par exemple, un plus petit volume de liquide surnageant doit être analysé par ELISA). Une autre limitation possible de ce système est l’utilisation de cellules cibles avec des sécrétions endogènes de mIL-2 (par exemple, les cellules de souris T) qui masquerait la sécrétion IL-2 de cellules de BW. Pour surmonter ces occurrences très inhabituels qui se limitent à des cellules de souris, ce système pourrait être amélioré en utilisant un journaliste différent (p. ex., GFP) qui n’est pas exprimé par les cellules cibles.

Le système de journaliste BW est une technique pour l’étude des interactions de récepteur-ligand1. Ce système est particulièrement avantageux lorsque le ligand d’un récepteur spécifique est inconnu ou expériences avec le ligand endogène sont techniquement difficiles. Il peut être également utilisé pour l’étude de la liaison des anticorps monoclonaux pour FcγRs humaine. La méthode est basée sur exprimant une protéine chimérique dans les cellules de souris BW. Cette protéine chimérique se compose du domaine extracellulaire du récepteur d’intérêt fusionné vers les domaines transmembranaires et intracellulaires de la chaîne ζ de souris. Liaison des ligands appropriés du récepteur entraîne la sécrétion d’il-2 de la souris, qui peut être facilement détecté par ELISA, comme illustré à la Figure 1. Cette méthode est sensible et spécifique à un récepteur individuel, facile à utiliser et très reproductible. Il peut donc compléter des outils supplémentaires pour l’étude des interactions de récepteur-ligand. Par exemple, il peut être utilisé pour plusieurs lignées cellulaires pour la présence d’un ligand pour un récepteur spécifique de l’écran (même si le ligand lui-même n’a pas été identifié) ou pour détecter l’activation de la FcγRs humaine par anticorps monoclonaux ou de sérum humain contenant des anti-viraux anticorps. Bien que les cellules immunitaires primaires expriment FcγRs endogène, ils sont généralement difficiles à manipuler et exprimer habituellement plusieurs récepteurs de Fc.
Nous avons utilisé ce système avec succès dans bon nombre de nos études pour caractériser les interactions ligand-récepteur. Ceux-ci incluent identifiant hémagglutinine comme le ligand du récepteur cellulaire NK NKp462, identifiant PVR et nectin-2 comme ligands pour l’homme et de la souris TIGIT3,4, et montrant que le fusobacterium nucleatum bactérie lie et active humaine TIGIT5. En outre, les cellules de BW qui expriment les récepteurs Fc ont été utilisés avec succès pour détecter les anticorps antivirales dans les sérums de patients'6,7,8. Plus précisément, nous récemment mis en place des cellules de BW qui expriment FcγRs humain pour détecter les différentiels d’activation FcR des anticorps anti-CD20, utilisé pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique (LLC)9. Ce qui est important, les résultats du système BW journaliste ont été validés lors d’expériences complémentaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

Interactions entre les récepteurs et ligands constituent un processus biologique fondamentaux. Cependant, diriger des expériences avec des cellules qui expriment le récepteur natif et le ligand sont difficiles car le ligand d’un récepteur spécifique peut être inconnu et procédures expérimentales avec le ligand natif peuvent être techniquement compliqués. Pour remédier à ces obstacles, les auteurs décrivent un système pour détecter les liaisons et l’activation d’un récepteur spécifique par un ligand d’intérêt. Dans ce système de journaliste, le domaine extracellulaire d’un récepteur spécifique est conjugué à la souris CD3ζ et cette protéine chimérique est alors exprimée dans les cellules de souris BW. Ces cellules transfectées de BW peuvent ensuite être incubées avec des objectifs différents (par exemple, des cellules ou des anticorps). Activation d’un récepteur transfectée entraîne la sécrétion d’interleukine-2 de la souris (mIL-2) qui peut être détectée par dosage immunoenzymatique (ELISA). Ce système a l’avantage d’être sensible et spécifique à un récepteur unique. En outre, le niveau d’activation d’un récepteur spécifique facilement quantifiable et peut être utilisé même dans les cas où le ligand du récepteur est inconnu. Ce système a été implanté avec succès dans bon nombre de nos études pour caractériser les interactions ligand-récepteur. Nous avons récemment utilisé ce système pour étudier l’activation des récepteurs Fcγ humains (FcγRs) par les anticorps différents anticorps monoclonal anti-CD20 en usage clinique.

La figure 3 illustre les résultats d’une expérience avec un système de journaliste BW. Dans cette expérience, cellules CLL étaient préalablement incubées avec l’anticorps différents anti-CD20 (rituximab et obinutuzumab) et puis a incubé avec les cellules transfectées de BW qui expriment des CD16a-CD3ζ. Des expériences similaires ont été menées dans notre étude9. Figure 3 présente l’image d’une plaque ELISA brute où l’intensité de la couleur correspond à une concentration de mIL-2. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. Cette expérience comportait plusieurs contrôles : CLL cellules incubées en présence de cellules parentales de BW celllulaire (ligne supérieure) et les cellules CLL incubées avec cellules BW qui expriment des CD16a-CD3ζ, mais sans un anticorps ou un anticorps de contrôle (six puits dans la deuxième rangée à gauche) . L’incubation des cellules BW qui expriment CD16 avec cellules CLL qui ont été préalablement incubées avec l’anticorps anti-CD20 induit une sécrétion importante de mIL-2 par rapport au niveau des puits de contrôle mIL-2. Ce qui est important, la pré-incubation des cellules CLL avec l’anti-CD20 obinutuzumab activé CD16 plus fortement que le rituximab, un appelé trouver qui a été récapitulée par notre système. La dernière ligne montre décroissant des concentrations prédéfinies de recombinant mIL-2 (sans l’ajout de cellules). Puits dans la dernière ligne droit n’a pas de mIL-2 et représente la lecture de fond, qui semble similaire dans les puits de contrôle. Figure 3 b présente la quantification des résultats de la plaque ELISA illustré à la Figure 3 a. Les niveaux de densité optique (Do) ont été converties en concentrations de mIL-2 basées sur la courbe d’étalonnage avec recombinant mIL-2. La figure 3 présente une expérience de réponse dose où différentes doses d’anticorps ont été préalablement incubées avec des cellules CLL et puis incubés avec cellules de BW exprimant CD16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> Figure 1 : représentation schématique du système journaliste BW. BW5147 cellules transfected stablement avec la portion extracellulaire des différents récepteurs fusionnés vers les domaines transmembranaires et cytoplasmiques de la souris CD3ζ chaîne (chimérique recptor-CD3ζ). Activation d’un récepteur spécifique-CD3ζ par un ligand provoque une sécrétion de mIL-2 qui peut être détectés par ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> Figure 2 : la structure de la chimère du récepteur-CD3ζ et le design d’amorces PCR. (A) structure générale d’un récepteur extracellulaire fondue vers les domaines transmembranaires et intracellulaires de souris CD3ζ. (B) le domaine extracellulaire du récepteur a été amplifié avec un primer 3' qui comprenait également des nucléotides de le CD3ζ. (C) les domaines transmembranaires et intracellulaires de CD3ζ ont été amplifiés avec un apprêt 5' qui comprenait également des nucléotides du récepteur. (D) dans la réaction de PCR finale, les deux segments qui sont chevauchent des séquences, servaient de la matrice d’ADN. Dans tous les panneaux de la figure, domaines protéiques différentes sont à codes de couleur et mis en boîte en bleu (séquence de CD3ζ) et les rectangles rouges (la séquence du récepteur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> Figure 3 : Illustration du produit final du système journaliste BW. (A, B, C) Les cellules CLL étaient préalablement incubées avec ou sans deux anticorps anti-CD20 (rituximab et obinutuzumab) ou un anticorps de contrôle. Par la suite, les anticorps lié aux cellules ont été incubées avec cellules parentales de BW ou cellules BW qui expriment des CD16a-CD3ζ. Le niveau du mIL-2 dans le surnageant a été déterminé par ELISA. (A) une image d’une plaque ELISA brute. Intensité de couleur indique la concentration du mIL-2 dans le surnageant. L’expérience a été réalisée en trois exemplaires. La rangée inférieure montre la lecture ELISA en diminuant les concentrations de recombinant mIL-2 qui ont été analysées dans la même assiette. (B) quantification du test ELISA lecture indiquée au point A. Les niveaux de mIL-2 ont été calculées à l’aide d’une courbe d’étalonnage du mil-2. (C) une dose réponse expérience où différentes doses d’anticorps ont été préalablement incubées avec des cellules CLL et puis incubés avec cellules de BW exprimant CD16a-CD3ζ. , P < 0,001 ; Test de t de Student (B) ou ANOVA avec comparaisons multiples (C). La seule comparaison au point C, qui n’était pas significativement différente a été pour le rituximab et le contrôle Ab dans la première concentration (0,01 µg/mL). Barres d’erreur représentent l’écart-type de la géométrie. Des expériences similaires ont été menées dans le cadre de l’une de nos récentes études9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Ce protocole décrit comment établir un système qui permet d’identifier et de quantifier les interactions ligand-récepteur.

Un système de BW rapporteur pour étudier les Interactions Ligand-récepteur

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.The BW Reporter System permet d’étudier les interactions récepteur-ligand. Il est extrêmement utile dans les cas où le ligand d’un récepteur spécifique est inconnu ou dans les cas où les expériences avec le ligand endogène sont techniquement difficiles. Cette méthode est sensible et spécifique à un récepteur individuel, facile à utiliser et reproductible.Shira Kahlon, postdoc pour mon laboratoire, démontrera la procédure. La veille de la transfection, plaquez 10 plaques avec 10 millilitres de 100 000 cellules BW5147, et complétons un RPMI. Ensuite, placez 100 microgrammes du plasmide pcDNA3 dans un tube.Ajouter l’acétate de sodium au pH 5.3 au tube. Après cela, ajouter 2,5 volumes de 100% d’éthanol au mélange de plasmides. Puis incuber le mélange de plasmides pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.24 heures après le placage des cellules BW, recueillir les cellules dans deux tubes de 50 millilitres. Puis centrifuger les cellules à 515 g pendant cinq minutes, et jeter le supernatant. Resuspendez le peloton RPMI sans ajouts et répétez la centrifugation.Resuspendez la pastille résultante dans 1 millilitre de RPMI sans ajouts. Transférer la pastille résuspendée sur une couette de 4 centimètres sur la glace. Centrifugeuse du plasmide qui a subi des précipitations d’éthanol.Ensuite, lavez le plasmide avec un millilitre de 70% d’éthanol. Et répéter la centrifugation pendant encore 20 minutes. Retirer tout l’éthanol et laisser sécher partiellement la pastille.Puis résuspendez la pastille en 100 microlitres de RPMI préchauffé, sans ajouts. Après cela, ajouter le plasmide résuspendé aux cellules dans cuvet. Incuber les cellules sur la glace pendant cinq minutes.Ensuite, électroporer les cellules. Transférer ensuite les cellules électroporées dans un tube de 50 millilitres. Ajouter 50 millilitres de milieu complet au tube et à la centrifugeuse pendant cinq minutes, à 515 g.Jetez le supernatant, et resuspendez les cellules dans 50 millilitres de milieu complet. Ensuite, plaquez les cellules dans des plats de culture de 24 puits, et couvez les cellules pendant 48 heures. Après cela, ajouter un millilitre de milieu complet, complété par 10 milligrammes par millilitre de G418 à chaque puits.48 heures plus tard, jeter un millilitre du volume supérieur de chaque puits. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu complet complété par cinq milligrammes par millilitre de G418 à chaque puits. Utilisez 50 000 cellules BW transfectées avec leurs cibles désirées, dans un seul puits d’une plaque de 96 puits.Incuber la plaque pendant 48 heures. Congelez ensuite la plaque à moins 20 degrés Celsius. Enduire une plaque ELISA d’anticorps ANTI-souris IL-2.Placer 05 microgrammes d’anti-souris IL-2, dans un volume de 50 microlitres de PBS dans chaque puits. Incuber la plaque enduite pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Utilisez une brève période d’incubation à 37 degrés Celsius, pour décongeler les cellules BW congelées, qui étaient auparavant incubées avec leurs cibles.Ensuite, centrifugez la plaque, et transférez 100 microlitres du supernatant de chaque puits à la plaque ELISA pré-enduite. Et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après cela ajouter biotine anti-souris IL-2 à la plaque ELISA.Ensuite, après l’incubation et le lavage, ajouter la streptavidine conjuguée HRP à la plaque. Après incubation et lavage, ajouter 100 microlitres de la solution de substrat TMB à chaque puits de la plaque ELISA. Enfin lire la plaque ELISA à 650 nanomètres.Dans cet exemple, les cellules CLL ont été pré-incubées avec différents anticorps anti-CD20. Et puis co-incubé avec des cellules BW transfected qui expriment les récepteurs Fc CD16, avant d’être analysé avec ELISA. Après analyse avec ELISA, les résultats ont été quantifiés.Les niveaux de densité optique ont été convertis en concentrations de souris IL-2, basées sur la courbe standard. Dans une expérience supplémentaire, différentes doses d’anticorps anti-CD20 ont été pré-incubées avec des cellules CLL. Et puis incubé avec les cellules BW transfectées.La particule contient quatre parties principales. Clonage, transfection des cellules BW, activation et ELISA. Chacune des pièces doit être vérifiée indépendamment.Après cette procédure, des expériences supplémentaires peuvent être réalisées avec des cellules qui expriment les récepteurs endogènes, tels que tuer les acides avec les cellules NK pour étudier les interactions avec les récepteurs cellulaires NK. Nous avons utilisé ce système pour découvrir de nouveaux ligands de récepteurs cellulaires NK. Par exemple, l’hémagglutinine est un ligand de NKp46, et PVL est un ligand de TG.

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