Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
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लेखक भाषा संपादन के लिए एस्तेर गायक धंयवाद । यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP/2007-2013)/ईआरसी अनुदान समझौते संख्या ३२०४७३-BacNK के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद् द्वारा इस अध्ययन का समर्थन किया गया । इसके अलावा समर्थन योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन के i-कोर कार्यक्रम द्वारा प्रदान की गई थी और जीन विनियमन में क्रोमेटिन और आरएनए पर मैं कोर द्वारा, GIF फाउंडेशन, लुईस परिवार फाउंडेशन, ICRF प्रोफेसरों अनुदान, Helmholtz इज़राइल अनुदान और Rosetrees ट्रस्ट (सभी ओएम के लिए) । यह अध्ययन भी इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 502/15), Kass चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार और रुधिर और चढ़ाए चिकित्सा के इसराइल सोसायटी से एक अनुसंधान अनुदान (एस. ई.) द्वारा समर्थित किया गया था । ओ. एम आणविक इम्यूनोलॉजी के एक क्राउन प्रोफेसर है ।

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. 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(6), 253 (2007).</li><li>Bar-On, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKp46+Recognizes+the+Sigma1+Protein+of+Reovirus:+Implications+for+Reovirus-Based+Cancer+Therapy.">NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy.</a> Journal of Virology. 91 (19), (2017).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Function,+and+Molecular+Properties+of+the+Killer+Receptor+Ncr1-Noe.">Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).</li><li>Glatzer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat(+)+innate+lymphoid+cells+acquire+a+proinflammatory+program+upon+engagement+of+the+activating+receptor+NKp44.">RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44.</a> Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activating+receptor+NKp46+is+essential+for+the+development+of+type+1+diabetes.">The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes.</a> Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).</li><li>Markel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+CEACAM1+protein+in+the+inhibition+of+activated+decidual+lymphocyte+functions.">Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions.</a> Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).</li></ol>

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

यहां हम एक रिपोर्टर प्रणाली के लिए रिसेप्टर ligand बातचीत की जांच पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (1में इस प्रोटोकॉल के एक संक्षिप्त रूप देखें) । प्रोटोकॉल तीन मुख्य भागों से बना है: एक chimeric प्रोटीन की क्लोनिंग, जो CD3ζ के intracellular डोमेन से जुड़े एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन भी शामिल है, एक अभिकर्मक के प्लाज्मिड कि BW कोशिकाओं को फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त (उदा , electroporation द्वारा), और एलिसा द्वारा माउस इल-2 का मात्रात्मक पता लगाना । इन भागों में से प्रत्येक के अंतिम उत्पाद स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए: क्लोनिंग की प्रक्रिया के लक्ष्य प्लाज्मिड में फ्यूजन प्रोटीन का पूरा अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए, BW कोशिकाओं के अभिकर्मक की अभिव्यक्ति की जांच करके सत्यापित किया जाना चाहिए BW कोशिकाओं में रुचि के रिसेप्टर (जैसे, प्रवाह cytometry द्वारा), और एलिसा प्रक्रिया सामांय सकारात्मक नियंत्रण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए (जैसे, रिकॉमबिनेंट मिल-2) के रूप में अच्छी तरह के रूप में transfected BW कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नियंत्रण के साथ; यानी, लक्ष्य है कि ब्याज की रिसेप्टर की एक ज्ञात ligand व्यक्त (जैसे, कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस CD48 BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस NK सेल रिसेप्टर 2B4 के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) । उदाहरण के लिए, क्लोनिंग प्रक्रिया सफल हो सकती है, लेकिन फ्यूजन प्रोटीन BW कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं किया जाता है । इस मामले में, electroporation दोहराया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, यदि एलिसा प्लेट की पृष्ठभूमि के स्तर के ऊपर कोई संकेत नहीं है (विशेष रूप से सकारात्मक नियंत्रण के लिए) transfected BW कोशिकाओं रिसेप्टर को व्यक्त करने में विफल हो सकता है (या अभिव्यक्ति खो गया है) या एक तकनीकी समस्या के दौरान हुई हो सकती है एलिसा प्रक्रिया ।
इस प्रक्रिया के सामांय सिद्धांतों के संरक्षण, जबकि कई संशोधनों को इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है । इन संशोधनों में शामिल है वेक्टर फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, transfecting के लिए विधि BW कोशिकाओं और विशिष्ट इस तरह के लक्ष्य के प्रकार के रूप में और एलिसा मशीन से संबंधित मानकों के लिए प्लाज्मिड (जैसे, कोशिकाओं, एंटीबॉडी, आदि) , लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या या एंटीबॉडी एकाग्रता अगर प्रासंगिक (हम अच्छी तरह से प्रति ५०,००० कोशिकाओं का उपयोग करें और ०.५ µ जी की एक एंटीबॉडी शुरू खुराक/अच्छी तरह से), मशीन समय (हम ४८ एच की एक मशीन समय का उपयोग करें) और supernatant मात्रा जो एलिसा थाली को हस्तांतरित कर रहा है ।
यह विधि संवेदनशील है, विशिष्ट है और आसानी से quantified जा सकता है । यह विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए लाइगैंडों की उपस्थिति के लिए स्क्रीनिंग के लिए आदर्श है (खासकर अगर ligand ही मांयता प्राप्त नहीं किया गया है) । transfected BW कोशिकाओं है कि एक विशिष्ट रिसेप्टर एक्सप्रेस तैयार करने के बाद, इन कोशिकाओं को जमे हुए और उपयोग किया जा सकता है जब अतिरिक्त प्रयोगों के लिए की जरूरत. हम और दूसरों को इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक पिछले अध्ययनों में रिसेप्टर ligand बातचीत का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए2,3,5,12,13,14 ,15,16) और इस प्रणाली द्वारा प्राप्त परिणामों के अंय तकनीकों द्वारा सत्यापित किया गया है । इस विधि भी एंटीबॉडी द्वारा विभिन्न मानव FcγR रिसेप्टर्स के सक्रियकरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में विरोधी वायरल एंटीबॉडी के लिए किया गया है सीरम6,7,8 या CD20 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ 9.
चूंकि यह एक रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें केवल रिसेप्टर के extracellular खंड व्यक्त किया जाता है, इस प्रणाली द्वारा प्राप्त निष्कर्षों प्राकृतिक साथ cytotoxicity परख के रूप में अंतर्जात रिसेप्टर, के साथ अतिरिक्त प्रयोगों द्वारा पूरित किया जाना चाहिए खूनी (NK) कोशिकाओं NK सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए. इसके अलावा, कुछ ligand/रिसेप्टर बातचीत एक लाख-2 रिपोर्टर प्रणाली द्वारा स्राव में परिणाम नहीं हो सकता है, और इसलिए अनदेखी की जा सकती है । इसके अलावा, के रूप में किसी भी प्रयोगात्मक सेटअप में, परिणाम के रूप में ऊपर वर्णित विभिंन मापदंडों के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए । यह मामलों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां दो शर्तों की तुलना की आवश्यकता है (जैसे, अलग एंटीबॉडी द्वारा ही एफसी रिसेप्टर के सक्रियकरण). यह भी सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि एक विशिष्ट ligand-रिसेप्टर बातचीत की संवेदनशीलता प्रणाली के रेखीय रेंज के भीतर है । अंयथा यह संतृप्ति मूल्यों के लिए नेतृत्व कर सकते है जो शर्तों के पार एक वैध तुलना बाधा सकता है । यह एक लाख का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है-2 मानक वक्र के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक खुराक उत्पादन द्वारा परीक्षण ligand के साथ प्रतिक्रिया वक्र (मूल्यों संतृप्ति के मामले में, प्रयोगात्मक मापदंडों संशोधित किया जाना चाहिए; उदाहरणके लिए, supernatant की एक छोटी मात्रा एलिसा द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए) । इस प्रणाली की एक और संभव सीमा मिल-2 के अंतर्जात स्राव के साथ लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग है (जैसे, माउस टी कोशिकाओं) जो BW कोशिकाओं के आईएल-2 स्राव मुखौटा होगा । इन अत्यधिक असामांय घटनाओं जो माउस कोशिकाओं तक सीमित है पर काबू पाने के लिए, इस रिपोर्टर प्रणाली एक अलग रिपोर्टर (जैसे, GFP) जो लक्षित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त नहीं है का उपयोग करके सुधारा जा सकता है ।

BW रिपोर्टर प्रणाली रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक है-ligand बातचीत1. यह प्रणाली विशेष रूप से लाभप्रद है जब एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand अज्ञात है या अंतर्जात ligand के साथ प्रयोग तकनीकी रूप से मुश्किल हैं. यह भी मानव FcγRs के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बंधन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि माउस BW कोशिकाओं में एक chimeric प्रोटीन व्यक्त करने पर आधारित है । इस chimeric प्रोटीन ब्याज की रिसेप्टर के extracellular डोमेन से बना है transmembrane और माउस ζ श्रृंखला के intracellular डोमेन से जुड़े । उचित लाइगैंडों रिसेप्टर की बाध्यकारी माउस IL-2 के स्राव की ओर जाता है, जो आसानी से एलिसा द्वारा पता लगाया जा सकता है, के रूप में चित्र 1में सचित्र । इस विधि संवेदनशील और एक व्यक्ति रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है, संचालित करने के लिए आसान है, और अत्यधिक reproducible. यह इस प्रकार रिसेप्टर-ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अतिरिक्त उपकरण पूरक कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, यह एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए एक ligand की उपस्थिति के लिए कई सेल लाइनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (भले ही ligand खुद को पहचान नहीं किया गया है) या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मानव FcγRs के सक्रियण का पता लगाने या एंटी वायरल युक्त मानव सीरम द्वारा एंटीबॉडी. हालांकि प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अंतर्जात FcγRs एक्सप्रेस, वे आम तौर पर संभालना मुश्किल है और आमतौर पर कई एफसी रिसेप्टर्स व्यक्त करते हैं ।
हम अपने अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता । ये NK सेल रिसेप्टर NKp462के ligand के रूप में haemagglutinin की पहचान, पीवीआर और nectin-2 मानव और माउस लाइगैंडों3,4के लिए TIGIT के रूप में, और दिखा रहा है कि fusobacterium nucleatum जीवाणु बांधों की पहचान शामिल है और सक्रिय करता है मानव TIGIT5. इसके अलावा, BW कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस एफसी रिसेप्टर्स सफलतापूर्वक रोगियों के सीरा6,7,8में विरोधी वायरल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, हम हाल ही में BW कोशिकाओं है कि मानव FcγRs विरोधी CD20 एंटीबॉडी क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL)9के उपचार के लिए इस्तेमाल किया के अंतर FcR सक्रियण का पता लगाने एक्सप्रेस की स्थापना की । महत्वपूर्ण बात यह है कि BW रिपोर्टर प्रणाली के परिणामों को पूरक प्रयोगों में मान्य किया गया है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

रिसेप्टर्स और लाइगैंडों के बीच बातचीत एक मौलिक जैविक प्रक्रिया का गठन. हालांकि, कोशिकाओं है कि देशी रिसेप्टर और ligand व्यक्त के साथ प्रत्यक्ष प्रयोगों के बाद से एक विशिष्ट रिसेप्टर के ligand को चुनौती दे रहे हैं अज्ञात हो सकता है और देशी ligand के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं तकनीकी रूप से जटिल हो सकता है. इन बाधाओं को हल करने के लिए, हम एक रिपोर्टर प्रणाली का वर्णन करने के लिए एक ligand के द्वारा एक विशिष्ट रिसेप्टर के बंधन और सक्रियण का पता लगाने के लिए ब्याज । इस रिपोर्टर प्रणाली में, एक विशिष्ट रिसेप्टर के extracellular डोमेन माउस CD3ζ करने के लिए संयुग्मित है और इस chimeric प्रोटीन तो माउस BW कोशिकाओं में व्यक्त की है. इन transfected BW कोशिकाओं को तो अलग लक्ष्य (जैसे, कोशिकाओं या एंटीबॉडी) के साथ मशीन हो सकता है । एक transfected रिसेप्टर के सक्रियकरण माउस interleukin-2 (मिल-2) जो एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता लगाया जा सकता है के स्राव की ओर जाता है । इस रिपोर्टर प्रणाली के फायदे के लिए किया जा रहा है संवेदनशील और एक एकल रिसेप्टर के लिए विशिष्ट. इसके अलावा, एक विशिष्ट रिसेप्टर के सक्रियकरण स्तर आसानी से quantified जा सकता है और भी मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है जहां रिसेप्टर के ligand अज्ञात है. इस प्रणाली को हमारे अध्ययन के कई में सफलतापूर्वक लागू किया गया है रिसेप्टर ligand बातचीत की विशेषता है । हम हाल ही में नैदानिक उपयोग में विभिन्न मोनोक्लोनल विरोधी CD20 एंटीबॉडी द्वारा मानव Fcγ रिसेप्टर्स (FcγRs) के सक्रियण का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली को नियोजित किया है.

चित्रा 3 एक BW रिपोर्टर प्रणाली के साथ एक प्रयोग के परिणाम दिखाता है । इस प्रयोग में, CLL कोशिकाओं को पूर्व अलग विरोधी CD20 एंटीबॉडी (rituximab और obinutuzumab) और फिर सह transfected BW कोशिकाओं जो CD16a-CD3ζ एक्सप्रेस के साथ-मशीन थे । हमारे अध्ययन9में इसी तरह के प्रयोगों का आयोजन किया गया । 3 ए एक कच्ची एलिसा थाली की एक छवि प्रस्तुत करता है जहां रंग की तीव्रता मिल के एक एकाग्रता-2 से मेल खाती है । प्रयोग तपसिल में किया गया । इस प्रयोग में कई नियंत्रण शामिल हैं: CLL कोशिकाओं माता पिता untransfected BW कोशिकाओं (ऊपरी पंक्ति) और CLL कोशिकाओं BW कोशिकाओं जो CD16a एक्सप्रेस-CD3ζ लेकिन एक एंटीबॉडी के साथ या एक नियंत्रण एंटीबॉडी (बाईं तरफ दूसरी पंक्ति में छह कुओं के साथ) के साथ मशीन के साथ मशीन . BW कोशिकाओं है कि CLL कोशिकाओं है कि पूर्व विरोधी CD20 एंटीबॉडी के साथ थे CD16 व्यक्त की मशीन की एक महत्वपूर्ण स्राव मिल-2 के नियंत्रण कुओं के मिल-2 स्तर की तुलना में प्रेरित किया । महत्वपूर्ण बात, विरोधी CD20 obinutuzumab के साथ CLL कोशिकाओं की पूर्व मशीन सक्रिय CD16 अधिक दृढ़ता से rituximab, एक ज्ञात खोज जो हमारी प्रणाली द्वारा recapitulated था । अंतिम पंक्ति रिकॉमबिनेंट मिल-2 के पूर्व परिभाषित सांद्रता (कोशिकाओं के अलावा बिना) उतरते दिखाता है । सही अच्छी तरह से अंतिम पंक्ति में मिल-2 नहीं है और पृष्ठभूमि पढ़ने, जो नियंत्रण कुओं के समान प्रतीत होता है का प्रतिनिधित्व करता है । चित्र 3 बी एलिसा थाली के परिणामों के ठहराव प्रस्तुत चित्रएक में दिखाया गया है । ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) के स्तर को मिल-2 रिकॉमबिनेंट मिल-2 के साथ मानक वक्र के आधार पर सांद्रता में परिवर्तित किया गया । चित्रा 3 सी एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग जहां एंटीबॉडी की अलग खुराक पूर्व CLL कोशिकाओं के साथ मशीन और फिर CD16 व्यक्त BW कोशिकाओं के साथ मशीन थे प्रस्तुत करता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> चित्रा 1: BW रिपोर्टर प्रणाली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । BW5147 कोशिकाओं छुरा transfected माउस cytoplasmic श्रृंखला (CD3ζ chimeric-recptor) के transmembrane और CD3ζ डोमेन से जुड़े रिसेप्टर्स के extracellular हिस्से के साथ कर रहे हैं । एक विशिष्ट रिसेप्टर के सक्रियकरण-CD3ζ-2 के एक स्राव में एक ligand परिणामों से एलिसा द्वारा पता लगाया जा सकता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> चित्रा 2: chimeric रिसेप्टर की संरचना-CD3ζ और पीसीआर प्राइमरों के डिजाइन । (क) एक extracellular रिसेप्टर के सामांय संरचना transmembrane और माउस CD3ζ के intracellular डोमेन से जुड़े । (ख) रिसेप्टर के extracellular डोमेन एक ' 3 प्राइमर जो भी CD3ζ के न्यूक्लियोटाइड शामिल के साथ परिलक्षित किया गया । (ग) CD3ζ के intracellular और transmembrane डोमेन एक 5 ' प्राइमर है कि भी रिसेप्टर न्यूक्लियोटाइड शामिल के साथ परिलक्षित किया गया । (घ) अंतिम पीसीआर प्रतिक्रिया में, दोनों खंडों, जिसमें अतिव्यापी दृश्यों है, डीएनए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया । सभी आंकड़ा पैनलों में, विभिंन प्रोटीन डोमेन रंग कोडित रहे है और नीले आयतों (CD3ζ अनुक्रम) और लाल आयतों (रिसेप्टर अनुक्रम) में बॉक्स्ड । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> चित्रा 3: BW रिपोर्टर प्रणाली के अंतिम उत्पाद का चित्रण । (A, B, C) CLL कोशिकाओं के साथ या दो विरोधी CD20 एंटीबॉडी (rituximab और obinutuzumab) या एक नियंत्रण एंटीबॉडी के बिना पूर्व-मशीन थे । बाद में, एंटीबॉडी-बाउंड कोशिकाओं पैतृक BW कोशिकाओं या BW कोशिकाओं जो CD16a-CD3ζ एक्सप्रेस के साथ मशीन थे । supernatant में मिल-2 का स्तर एलिसा द्वारा निर्धारित किया गया था । (क) एक कच्ची एलिसा प्लेट की एक छवि । रंग तीव्रता supernatant में मिल-2 की एकाग्रता को इंगित करता है । प्रयोग तपसिल में किया गया । निचली पंक्ति रिकॉमबिनेंट मिल-2 जो एक ही थाली में विश्लेषण किया गया की सांद्रता कम करने में एलिसा readout से पता चलता है । (ख) (क) में दिखाई गई एलिसा पाठन की ठहराव. मिल-2 के स्तर मिल-2 के एक मानक वक्र का उपयोग कर गणना की गई । (ग) एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग जहां एंटीबॉडी के विभिंन खुराकों थे पूर्व CLL कोशिकाओं के साथ मशीन और फिर CD16a-CD3ζ व्यक्त BW कोशिकाओं के साथ मशीन । , पृ < ०.००१; छात्र का t टेस् ट (B) या मल्टीपल तुलना (C) के साथ ANOVA । (ग) जो काफी अलग नहीं था में केवल तुलना rituximab और नियंत्रण के लिए था पहले एकाग्रता में अटल बिहारी (०.०१ µ g/एमएल) । त्रुटि पट्टियां triplicates के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । इसी तरह के प्रयोग हमारे हाल के9अध्ययन में से एक के भाग के रूप में आयोजित किए गए । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रिपोर्टर प्रणाली है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता स्थापित करने के लिए और रिसेप्टर ligand बातचीत ।

एक BW रिपोर्टर प्रणाली के अध्ययन के लिए रिसेप्टर Ligand बातचीत

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

शालोम. BW रिपोर्टर सिस्टम रिसेप्टर-लिगांड इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है । यह उन मामलों में अत्यंत उपयोगी है जहां एक विशिष्ट रिसेप्टर का लिगांड अज्ञात है या ऐसे मामलों में जहां अंतर्जात लिगामेंट के साथ प्रयोग तकनीकी रूप से कठिन हैं। यह विधि संवेदनशील और एक व्यक्तिगत रिसेप्टर के लिए विशिष्ट है, काम करने में आसान और प्रजनन योग्य है।प्रक्रिया का प्रदर्शन शिरा कहलोन, मेरी प्रयोगशाला के लिए एक पोस्टडॉक होगा । ट्रांसफेक्शन से पहले दिन, 100, 000 BW5147 कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर के साथ 10 प्लेटें प्लेटें, और एक RPMI पूरक। इसके बाद एक ट्यूब में 100 माइक्रोग्राम pcDNA3 प्लाज्मिड रखें।ट्यूब में पीएच 5.3 पर सोडियम एसीटेट जोड़ें। इसके बाद, प्लाज्मिड मिश्रण में 100% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम जोड़ें। फिर प्लाज्मिड मिश्रण को रात भर शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।बीडब्ल्यू कोशिकाओं को चढ़ाना के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों में इकट्ठा करें। फिर पांच मिनट के लिए 515 ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को त्याग दें। पेलोटन आरपीएमआई को बिना अतिरिक्त के फिर से रीसुस्ल करें और अपकेंद्रित्र को दोहराएं।अतिरिक्त के बिना आरपीएमआई के 1 मिलीलीटर में परिणामी गोली को फिर से खर्च करें। पुनः निलंबित गोली को बर्फ पर 4 सेंटीमीटर क्यूवेट में स्थानांतरित करें। सेंट्रलाइज प्लास्मिड जो इथेनॉल वर्षा से गुजरा।फिर प्लाज्मिड को 70% इथेनॉल के एक मिलीलीटर से धोएं। और एक और 20 मिनट के लिए अपकेंद्री दोहराएं । सभी इथेनॉल निकालें, और गोली को आंशिक रूप से सूखने दें।फिर बिना अतिरिक्त के प्रीहीटेड आरपीएमआई के 100 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। इसके बाद, क्यूवेट में कोशिकाओं में पुनः निलंबित प्लाज्मिड जोड़ें। पांच मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।इसके बाद, कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपाउरेट करें। फिर इलेक्ट्रोपेटेड कोशिकाओं को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए पूरा माध्यम के ५० मिलीलीटर जोड़ें, ५१५ जी पर ।सुपरनेट को त्यागें, और कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के 50 मिलीलीटर में फिर से रखें। फिर 24-अच्छी संस्कृति व्यंजनों में कोशिकाओं को प्लेट करें, और कोशिकाओं को 48 घंटे तक इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में जी418 के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक पूर्ण माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें।48 घंटे बाद, प्रत्येक कुएं की ऊपरी मात्रा का एक मिलीलीटर त्यागें। फिर प्रत्येक कुएं में जी418 के पांच मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर के साथ पूर्ण मध्यम पूरक का एक मिलीलीटर जोड़ें। 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में, अपने वांछित लक्ष्यों के साथ 50, 000 संक्रमित बीडब्ल्यू कोशिकाओं का उपयोग करें।48 घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट। इसके बाद प्लेट को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दें। एंटी माउस आईएल-2 एंटीबॉडी के साथ एक एलिसा प्लेट कोट करें।प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर की मात्रा में 05 माइक्रोग्राम एंटी-माउस आईएल-2 रखें। लेपित प्लेट को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन अवधि का उपयोग करें, जमे हुए BW कोशिकाओं गल, कि पहले अपने लक्ष्यों के साथ इनक्यूबेटेड थे ।फिर प्लेट को अपकाइज करें, और प्रत्येक कुएं से सुपरनेटेंट के 100 माइक्रोलीटर को प्री-कोटेड एलिसा प्लेट में स्थानांतरित करें। और दो घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इसके बाद एलिसा प्लेट में बायोटिन एंटी-माउस आईएल-2 जोड़ें।फिर इनक्यूबेशन और धोने के बाद, प्लेट में एचआरपी संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन जोड़ें। इनक्यूबेशन और धोने के बाद, एलिसा प्लेट के प्रत्येक कुएं में टीएमबी सब्सट्रेट समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंत में 650 नैनोमीटर पर एलिसा प्लेट पढ़ें।इस उदाहरण में, सीएलएल कोशिकाओं को विभिन्न एंटी-सीडी 20 एंटीबॉडी के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड किया गया था। और फिर सह संक्रमित BW कोशिकाओं जो एफसी रिसेप्टर्स CD16 व्यक्त के साथ इनक्यूबेटेड, एलिसा के साथ विश्लेषण किया जा रहा से पहले । एलिसा के साथ विश्लेषण के बाद परिणामों की मात्रा निर्धारित की गई ।ऑप्टिकल घनत्व के स्तर, मानक वक्र के आधार पर माउस आईएल-2 सांद्रता में परिवर्तित हो गए थे। एक अतिरिक्त प्रयोग में, विरोधी CD20 एंटीबॉडी की विभिन्न खुराक सीएलएल कोशिकाओं के साथ पूर्व-इनक्यूबेटेड थे। और फिर संक्रमित बीडब्ल्यू कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेटेड ।कण के चार मुख्य भाग होते हैं। क्लोनिंग, बीडब्ल्यू कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन, एक्टिवेशन और एलिसा। प्रत्येक भाग को स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए।इस प्रक्रिया के बाद, अतिरिक्त प्रयोग कोशिकाओं के साथ किए जा सकते हैं जो अंतर्जात रिसेप्टर्स को व्यक्त करते हैं, जैसे एनके सेल रिसेप्टर्स के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एनके कोशिकाओं के साथ एसिड की हत्या। हमने एनके सेल रिसेप्टर्स के नए लिगामेंट्स की खोज के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, हेमाग्लुटिनिन एनकेपी46 का एक लिगांड है, और पीवीएल टीजी का एक लिगामेंट है।

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

ड्रोसोफिला में आक्रामकता का अध्ययन (फल मक्खियों)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

एक luciferase आधारित रिपोर्टर जीन परख के साथ झिल्ली biogenesis अध्ययन

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

भाजित Ubiquitin आधार झिल्ली खमीर (मिथक) दो - हाइब्रिड सिस्टम: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

लंबी दूरी की डीएनए सहभागिता की पहचान के लिए एसोसिएटेड क्रोमोजोम जाल

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

संयंत्र में प्रोटीन बातचीत एक गेटवे संगत bimolecular प्रतिदीप्ति (BiFC) complementation सिस्टम का उपयोग की जांच

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

उत्सुकता आधारित कम आत्मीयता कोशिकी रिसेप्टर Ligand सहभागिता के स्केलेबल पता लगाने के लिए बाह्य सहभागिता स्क्रीनिंग (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Trypanosomes में आरएनए संपादन के खिलाफ दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक पत्रकार के रूप में शाही सेना उत्प्रेरक

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

एक luciferase रिपोर्टर जीन के साथ RAW264.7 प्रकोष्ठों Transfecting

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली का अध्ययन<em&gt; डी। discoideum</em&gt; तापमान नियंत्रित लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...