Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
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Gli autori ringraziano Esther Singer per la lingua di modifica. Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (FP/2007-2013) / convenzione di sovvenzione CER numero 320473-BacNK. Un ulteriore supporto è stato fornito dal programma del Comitato del budget e la pianificazione e la Israel Science Foundation I-CORE e dai-Core sulla cromatina e RNA nella regolazione genica, la Fondazione di GIF, la Fondazione di famiglia Lewis, la concessione di cattedra ICRF, il Helmholtz Israele grant e la fiducia di boschi (tutti a O.M.). Questo studio è stato anche sostenuto dalla Israel Science Foundation (grant 502/15), il premio di ricerca medica di Kass e un assegno di ricerca dal Israele società di ematologia e medicina trasfusionale (a s. e). Omar è un professore di corona di immunologia molecolare.

1. generazione di un plasmide che esprime il costruire chimerico
Nota: L'obiettivo è di generare un plasmide che esprime il dominio extracellulare del recettore di interesse fusa per i domini transmembrana e intracellulari del mouse CD3ζ catena (Figura 2A).
<ol><li>Recuperare la sequenza del dominio extracellulare del recettore di interesse, tra cui il peptide di segnale. Ottenere materiale di DNA che dovrebbe esprimere questo recettore (ad es., cDNA o un plasmide).</li>
	<li>Ottenere materiale di DNA che esprime la transmembrana e i domini intracellulari del mouse CD3ζ catena (ad es., cDNA o un plasmide).</li>
	<li>Progettare la sequenza della proteina di fusione basata sulla struttura generica illustrata nella Figura 2A. Assicurarsi che l'intera sequenza è all'interno della cornice di lettura del codone stesso. Questa sequenza viene utilizzata per disegnare primers appropriato e verificare il prodotto finale.</li>
	<li>Progettare due reazioni di PCR per amplificare ciascuno dei frammenti di proteine di fusione separatamente (Figura 2B, 2C)10. Nota: Le condizioni specifiche per le reazioni di PCR (ad es., allungamento tempo e temperatura di annealing) dipendono dalla natura degli iniettori, che sono progettati per uno specifico recettore.<ol>
<li>Amplificare il segmento extracellulare del recettore.<ol>
<li>Progettare un primer 5' che include parte del peptide segnale del recettore, una sequenza di consenso di Kozak e un sito di restrizione appropriato (Figura 2B).</li>
			<li>Progettare un primer 3' che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 2B). Ad esempio, per la progettazione iniziale questo primer 3' possa includere le ultime 20 coppie di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 9 coppie di basi del segmento CD3ζ. Nota: È necessario aggiungere un sito di restrizione per il primer 3' poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza di fusa e non viene utilizzato per la legatura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificare il segmento CD3ζ.<ol>
<li>Progettare un primer 5' che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 2). Ad esempio, per la progettazione iniziale il primer 5' può includere le ultime 9 coppie di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 20 coppie di basi del segmento CD3ζ. Nota: È necessario aggiungere un sito di restrizione per il primer 5' poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza di fusa e non viene utilizzato per la legatura.</li>
			<li>Progettare un primer 3' che comprende la fine della sequenza di CD3ζ così come un sito di restrizione appropriato (Figura 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Correggere le sequenze dell'iniettore in ciascuna di queste due reazioni in modo che la temperatura di annealing è simile in ogni coppia (si noti che il primer, che comprende sequenze delle due parti della proteina di fusione, si accoppia solo con parte della sequenza in ogni reazione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire un ulteriore PCR in cui viene utilizzata una miscela dei prodotti di PCR delle prime due reazioni come il modello di DNA con il primer 5' del segmento extracellulare del recettore (punto 1.4.1.1) e 3' del segmento CD3ζ (punto 1.4.2.2) (Figura 2D)10 . Questa reazione deve generare la sequenza finale di fusa.</li>
	<li>Procedere come al solito per la clonazione.<ol>
<li>Legare il prodotto PCR finale alla destinazione taglio vettoriale (il vettore di destinazione è di solito pcDNA3 che esprime la resistenza G418 e ampicillina).</li>
		<li>Trasformare il vettore dei batteri competenti11.<ol>
<li>Scongelare i 50 µ l di batteri competenti sul ghiaccio.</li>
			<li>Aggiungere il vettore legato ai batteri e incubare in ghiaccio per 20 min.</li>
			<li>Incubare a 42 ° C per 45 s.</li>
			<li>Aggiungere 200 µ l di LB senza antibiotici.</li>
			<li>Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione continua.</li>
			<li>Seme su una piastra LB con gli antibiotici adatti (ad es., ampicillina soluzione con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccogliere e coltivare diverse colonie batteriche in 5 mL di LB (in provette da 15 mL).</li>
		<li>Il giorno successivo, estrarre plasmidi con un mini kit di preparazione.</li>
		<li>Analizzare l'inserto di gene con enzimi di restrizione.</li>
		<li>Sequenza le relative colonie e verificare che la sequenza e la struttura di lettura siano corrette (come indicato al punto 1.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasformare il plasmide verificato in batteri competenti11.<ol>
<li>Scongelare i 20 µ l di batteri competenti sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l del plasmide ai batteri e incubare in ghiaccio per 20 min.</li>
		<li>Incubare a 42 ° C per 45 s.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di LB senza antibiotici.</li>
		<li>Incubare per 1h a 37 ° C con agitazione continua.</li>
		<li>Seme su una piastra di crescita batterica con gli antibiotici adatti (ad es., ampicillina soluzione con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno successivo, crescere una colonia batterica in un grande contenitore LB con ampicillina 0,1 mg/mL (~ 250 mL).</li>
	<li>Il giorno successivo, eseguire maxi prep secondo le istruzioni specifiche fornite dal kit. Nota: Per la procedura di elettroporazione, una grande quantità di plasmide è necessaria, come dettagliato di seguito.</li>
</ol>2. transfezione del plasmide che esprime la proteina chimerica nelle cellule di BW
Nota: Diversi metodi possono essere impiegati anche per la transfezione (ad es., da infezione lentivirale). Prima l'elettroporazione, eseguire precipitazione dell'etanolo del DNA come descritto di seguito. I prossimi passi richiedono condizioni di sterilità.
<ol><li>Il giorno prima, preparare la BW5147 cellule ("BW") per l'elettroporazione. Piastra 10 piastre (di 10 cm) con 10 mL di 100.000 BW5147 cellule/mL (cioè, un totale di 10 x 106 cellule) con RPMI completato con 10% siero fetale del vitello (FCS), piruvato di sodio 1%, 1% L-Glutammina, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% penicillina-streptomicina ("medium completo").</li>
	<li>Mettere 100 µ g del plasmide pcDNA3 che esprime la proteina di fusione in un tubo da 1,5-2 mL e aggiungere 3 M sodio acetato a pH 5.3-5.5 ad esso. Il volume dell'acetato di sodio dovrebbe corrispondere a 0,1 (10%) del volume di 100 µ g plasmide; titolare il pH dell'acetato di sodio con un pH-metro con l'aggiunta di NaOH o HCl.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela del plasmide e l'acetato di sodio, come descritto in passaggio 2.2 (2,5 volte il volume totale del plasmide e sodio acetato). Incubare per una notte a-20 ° C o per 2 ore a 70 ° C.</li>
	<li>2.4. 24h dopo le cellule di BW sono state placcate, raccogliere tutte le celle di BW (~ 100 mL) in provette 2 50 mL. Centrifugare le cellule per 5 min a 515 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet da entrambi i tubi in 25 mL di RPMI - in una provetta singola 50 mL. Ad esempio, risospendere il pellet di uno tubo con 25 mL di RPMI - e quindi utilizzare questo fluido per risospendere il fluido nell'altro tubo 50 mL affinché il pellet totale dalle cellule BW è nuovamente sospeso in 25 mL di terreno in un singolo tubo. Nota: Il mezzo dovrebbe essere senza aggiunte, dato che il siero potrebbe interferire con l'elettroporazione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule ancora per 5 min a 515 x g. Risospendere il pellet in 1 mL di RPMI e trasferire il contenuto in una cuvetta di 0,4 cm sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare il plasmide che ha subito la precipitazione dell'etanolo (punto 2.3) per 30 min a 16.000 x g e a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare una volta con 1 mL di etanolo al 70% e centrifugare per un altro 20 min a 16.000 x g e a 4 ° C (per lavare fuori il sale).</li>
	<li>Rimuovere tutto l'etanolo e asciugare leggermente il pellet (cioè, in un tubo aperto nella coltura del tessuto cappa). Risospendere il pellet con 100 µ l di RPMI-precedentemente riscaldata a 60 ° C.</li>
	<li>Aggiungere il plasmide ri-sospensione (passo 2.8) per le cellule in provetta e incubare per 5 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Electroporate le cellule alle 0.23 kV, 250 capacitazione. Questo dovrebbe prendere ~ 4 ms.</li>
	<li>Trasferire le cellule elettroporate a un tubo da 50 mL, aggiungere 50 mL di terreno completo e centrifugare per 5 min a 515 x g.
</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere le cellule con 50 mL di terreno completo.</li>
	<li>Piastra le cellule elettroporate in piastre di coltura 24 pozzetti (1 mL / Beh, per un totale di ~ 50 pozzi) e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 48 h.</li>
	<li>Selezionare le celle transfected con antibiotici. Dopo 48 h aggiungere 1 mL di completa supplementato con 10 mg/mL G418 in ogni pozzetto (in questa fase il volume finale in ciascuna è ben 2 mL e la concentrazione finale di G418 in ogni bene è 5 mg/mL). Nota: Se il plasmide contiene una diversa resistenza antibiotica, determinare la concentrazione di antibiotico necessaria per uccidere le cellule untransfected BW prima di questo passaggio.</li>
	<li>Ogni 48 h, scartare con attenzione 1 mL del volume superiore di ciascun pozzetto senza mescolare il mezzo nel pozzo (le cellule di BW tendono ad essere nella parte inferiore del pozzo). Aggiungere completa supplementato con 5 mg/mL G418 in ciascun pozzetto, in modo che il volume finale in ciascun pozzetto è ancora 2 mL.</li>
	<li>Esaminare regolarmente le piastre di coltura per la crescita delle cellule in tutti i pozzetti. Nota: Un cambiamento nel colore del mezzo al giallo può contribuire ad identificare le cellule in crescita; Tuttavia, all'inizio il mezzo sarà giallo a causa il G418 stessa. Identificare i pozzetti positivi (pozzi con la crescita delle cellule). Questi pozzi sono G418 resistente e pertanto sono tenuti a esprimere la proteina di fusione. Questo processo richiede in genere circa 3 settimane.</li>
</ol>3. Verifica dell'espressione del recettore trasfettato in cellule nei pozzetti positivi.
<ol><li>Macchia le celle transfected BW con un anticorpo specifico contro il recettore che era trasfettato.</li>
	<li>Confrontare il livello di espressione del recettore tramite flusso cytometry per l'espressione delle cellule di controllo (cellule untransfected BW).</li>
	<li>Dopo la verifica di uno o più pozzetti, utilizzare immediatamente le cellule per scopi sperimentali, crescere in coltura o congelare per future applicazioni.</li>
	<li>Verificare l'espressione del recettore trasfettato prima di eseguire un nuovo esperimento. Dopo alcune settimane di crescita, le cellule con G418 con espressione del recettore stabile, G418 può essere omesso dal terreno di coltura.</li>
</ol>4. incubazione delle cellule trasfettate BW con target
Nota: Quando si utilizza cellule transfected BW per la prima volta, è preferibile di testarli su bersagli che esprimono un noto ligando del recettore di interesse o su piastra associato anticorpi specificamente diretti contro il recettore di interesse (cross-linking esperimenti; Vedi sotto, sezione 4.2.1.3).
<ol><li>Preferibilmente, dividere le celle di BW 24 h prima dell'esperimento (ad esempio, con l'aggiunta di 10 mL di terreno completo a 2 mL di cellule in coltura in una nuova piastra di coltura di 10 cm).</li>
	<li>Incubare le cellule transfected BW con i loro obiettivi. Eseguire contemporaneamente l'esperimento sulle cellule di controllo BW che esprimono un vettore vuoto (o cellule parentali di BW). 96F piastre sono preferibili (ma utilizzabile anche 96U piastre). Eseguire l'esperimento in triplice copia. Sospendere tutte le celle nel medium completo.<ol>
<li>Preparare i bersagli. Il tipo di destinazione varia in funzione dell'obiettivo e può essere cellule, cellule che sono state pre-incubate con anticorpi, o anticorpi da solo. Questo sistema è stato utilizzato anche con i batteri come obiettivi5.<ol>
<li>Se gli obiettivi sono divisione delle cellule (cioè, linee cellulari), li irradiare alle 6.000 rad prima del dosaggio. Posto 50.000 delle cellule bersaglio in un singolo pozzo di una piastra 96 (in un volume di 100 µ l).</li>
			<li>Per esperimenti con anticorpi e cellule di BW che esprimono umano FcγRs, incubare le cellule bersaglio con un anticorpo sul ghiaccio in un piatto ben 96 (ad esempio, 50 µ l di cellule bersaglio e 50 µ l di anticorpo; le dosi differenti dell'anticorpo possono essere testate).</li>
			<li>Se usando gli anticorpi da soli come bersagli (esperimenti di cross-linking), dovrebbero essere associati a piastra. A tale scopo, prima di Incubare gli anticorpi in un mezzo completo in un piatto di 96F per 1-2 h a 37 ° C e 5% CO2 (una tipica dose iniziale è di 0,5 μg di un anticorpo specifico in 50 µ l). Lavare la piastra per rimuovere gli anticorpi non legati. Nota: In questo caso, un piatto di 96F consentirà legame dell'anticorpo alla piastra, che dopo l'aggiunta di cellule transfected BW porterà alla attivazione del recettore trasfettato.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere le cellule BW (cellule effettrici). Cellule di luogo 50.000 BW in un singolo pozzo di una piastra 96 (in un volume di 100 µ l).</li>
		<li>Completano il volume in ogni pozzetto a 200 µ l se necessario.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 ° C e 5% di CO2 per 48 h (questo periodo di tempo può essere calibrato).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo 48 h, congelare le piastre a-20 ° C e disgelo prima ELISA, o utilizzare immediatamente per ELISA (vedere passaggi successivi).</li>
</ol>5. ELISA
<ol><li>Cappotto una piastra ELISA con un anticorpo anti-IL-2 (anti-mIL-2). Inserire 0,05 µ g di anti-mIL-2 in un volume di 50 µ l di PBS 1X per pozzetto. Incubare la piastra ELISA rivestita con l'anticorpo anti-mIL-2 a 4 ° C durante la notte o a 37 ° C per 2 h. Nota: Per eseguire ELISA direttamente dopo la fase di incubazione, piastra ELISA dovrebbe essere ricoperto 24h prima della fine del periodo d'incubazione delle cellule BW.</li>
	<li>Scartare il liquido nella piastra ELISA e aggiungere una soluzione bloccante (200 µ l per pozzetto), che si compone di 1X PBS e 1% albumina di siero bovino (BSA). Incubare la piastra ELISA per 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la piastra ELISA tre volte con PBS Tween soluzione allo 0,05% (cioè, 0,5 mL di Tween-20 in 1 litro di PBS 1X).</li>
	<li>Prendere la piastra 96 che ha le cellule di BW che sono state incubate con i loro obiettivi (4.3). Se la piastra è stata congelata, scongelare completamente (ad es., di breve incubazione a 37 ° C). Centrifugare la piastra 96 (5 min, 515 x g) e attentamente trasferire 100 µ l del surnatante in ciascun pozzetto alla piastra ELISA prepatinata e bloccata. Nota: Il surnatante dovrebbe essere raccolti dai lati di ciascun pozzetto per evitare di prendere le cellule.</li>
	<li>Se lo si desidera, è possibile aggiungere ricombinante mIL-2 con concentrazioni definite in una delle righe vuote della piastra ELISA rivestita per generare una curva standard di mIL-2. Ad esempio, a partire da una concentrazione di 2 mIL di 2.500 pg/mL e quindi diminuire del 50% in tutti i pozzetti successivi; non aggiungere mIL-2 all'ultimo bene.</li>
	<li>Incubare la piastra ELISA a 4 ° C durante la notte o a 37 ° C per 2 h.</li>
	<li>Lavare la piastra ELISA quattro volte con PBS Tween.</li>
	<li>Aggiungere biotina anti-topo IL-2 piastra ELISA. Utilizzare una concentrazione di 1 µ g anticorpo in 1 mL di PBS 1x con BSA 1% e si dividono in 100 µ l per pozzetto.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween.</li>
	<li>Aggiungere HRP coniugato streptavidina. Utilizzare una concentrazione di 1 µ l streptavidina in 1 mL di PBSX1 con BSA 1% e dividerlo in 100 µ l per pozzetto.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione TMB. Completare questa fase rapidamente per ridurre al minimo le differenze tra i pozzetti a causa di ritardi quando si aggiunge il TMB.</li>
	<li>Leggere la piastra ELISA con un lettore di piastra ELISA a 650 nm (la lettura può essere ripetuta se il segnale è debole).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. 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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui presentiamo un protocollo per la generazione di un sistema di reporter per indagare le interazioni recettore-ligando (vedere una forma abbreviata del presente protocollo a1). Il protocollo è composto da tre parti principali: la clonazione di una proteina chimerica, che include il dominio extracellulare di uno specifico recettore fusa al dominio intracellulare di CD3ζ, la transfezione di un plasmide che esprime la proteina di fusione di cellule BW (per esempio. , mediante elettroporazione) e la determinazione quantitativa del mouse il-2 da ELISA. Il prodotto finale di ciascuna di queste parti dovrebbe essere verificato in maniera indipendente: il processo di clonazione deve essere verificato da sequenziamento completo della proteina di fusione nel plasmide bersaglio, la transfezione delle cellule BW dovrebbe essere verificata esaminando l'espressione del recettore di interesse per le cellule di BW (ad es., mediante citometria a flusso) e il processo di ELISA deve essere verificata da controlli positivi generali (ad es., ricombinante mIL-2) oltre che con controlli specifici per le cellule transfected BW; cioè, gli obiettivi che esprimono un noto ligando del recettore di interesse (ad es., cellule che esplicita CD48 utilizzabile come controllo positivo per cellule di BW che esprimono il NK delle cellule del recettore 2B4). Per esempio, il processo di clonazione potrebbe essere corretta, ma la proteina di fusione non è espressa dalle cellule del BW. In questo caso, deve essere ripetuta l'elettroporazione. In alternativa, se non c'è nessun segnale sopra il livello di fondo della piastra ELISA (soprattutto per i controlli positivi) cellule transfected BW non abbia esprimono il recettore (o l'espressione è stata persa) o potrebbe essersi verificato un problema tecnico durante il processo di ELISA.
Diversi potranno subire modifiche al presente protocollo, preservando i principi generali della procedura. Queste modifiche includono il vettore utilizzato per esprimere la proteina di fusione, il metodo per trasfezione del plasmide alle cellule di BW e parametri specifici legati alla incubazione ed ELISA quali il tipo di destinazione (ad es., cellule, anticorpi, ecc.) , numero di cellule bersaglio o la concentrazione di anticorpi, se pertinenti (usiamo 50.000 cellule per pozzetto e un anticorpo dose iniziale di 0,5 µ g/pozzetto), tempo di incubazione (usiamo un tempo di incubazione di 48 h) e il surnatante volume che viene trasferito alla piastra ELISA.
Questo metodo è sensibile, specifico e possono essere facilmente quantificati. È ideale per lo screening per la presenza di ligandi per recettori specifici (soprattutto se non è stato riconosciuto il ligando stesso). Dopo la preparazione di cellule trasfettate BW che esprimono un recettore specifico, queste cellule possono essere congelate e utilizzate quando necessario per ulteriori esperimenti. Noi ed altri abbiamo usato questo sistema con successo negli studi precedenti per esplorare interazioni recettore-ligando (ad esempio2,3,5,12,13,14 15,16) e i risultati ottenuti da questo sistema sono stati verificati mediante altre tecniche. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'attivazione dei recettori FcγR diversi dagli anticorpi, come è stato fatto per gli anticorpi anti-virali in siero6,7,8 o con anticorpi monoclonali contro CD20 9.
Poiché si tratta di un sistema di reporter in cui solo il segmento extracellulare del recettore è espresso, i risultati ottenuti da questo sistema dovrebbero essere integrati da ulteriori esperimenti con il recettore endogeno, come saggi di citotossicità con naturale cellule dell'assassino (NK) per studiare le interazioni con NK delle cellule recettori. Inoltre, determinate interazioni ligando-recettore non possono comportare una secrezione di mIL-2 dal sistema reporter e pertanto potrebbero essere trascurati. Inoltre, come in qualsiasi setup sperimentale, i risultati devono essere verificati per vari parametri come descritto sopra. Ciò è particolarmente importante nei casi in cui un confronto delle due condizioni è necessaria (per esempio, l'attivazione del recettore Fc stesso di anticorpi differenti). Inoltre è importante verificare che la sensibilità di un'interazione ligando-recettore specifico sia all'interno della gamma lineare del sistema. Altrimenti questo potrebbe portare a valori di saturazione che possono precludere un confronto valido tra condizioni. Ciò può essere ottenuto utilizzando una curva standard mIL-2, nonché generando una curva dose-risposta con il ligando testata (nel caso di saturare i valori, i parametri sperimentali devono essere modificati; ad esempio, un più piccolo volume del surnatante dovrebbero essere analizzate da ELISA). Un'altra possibile limitazione di questo sistema è l'uso delle cellule bersaglio con secrezioni endogene di mIL-2 (per esempio, cellule di topo T) che potrebbe mascherare la secrezione del-2 delle cellule di BW. Per superare questi eventi altamente insoliti che sono confinati in cellule di topo, questo sistema di reporter potrebbe essere migliorato utilizzando un reporter differente (ad es., GFP) che non è espresso dalle cellule bersaglio.

Il sistema di reporter BW è una tecnica per lo studio di interazioni recettore-ligando1. Questo sistema è particolarmente vantaggioso quando il ligando di un recettore specifico è sconosciuto o esperimenti con il ligando endogeno sono tecnicamente difficili. Può anche essere utilizzato per studiare l'associazione di anticorpi monoclonali umani FcγRs. Il metodo si basa su che esprimono una proteina chimerica in cellule di topo BW. Questa proteina chimerica è composto del dominio extracellulare del recettore di interesse fusa per i domini transmembrana e intracellulari della catena ζ del mouse. Associazione di appropriati ligandi del recettore porta alla secrezione del-2 del mouse, che può essere facilmente rilevata da ELISA, come illustrato nella Figura 1. Questo metodo è sensibile e specifico per un singolo recettore, facile da usare e altamente riproducibili. Così può complementare ulteriori strumenti per lo studio di interazioni recettore-ligando. Ad esempio, può essere utilizzato per diverse linee di cellule per la presenza di un ligando per uno specifico recettore a schermo (anche se non è stato identificato il ligando stesso) o per rilevare l'attivazione della FcγRs umana dagli anticorpi monoclonali o di siero umano contenente anti-virale anticorpi. Sebbene le cellule immunitarie primarie esprimono FcγRs endogena, essi sono generalmente difficile da gestire e di solito esprimere diversi recettori Fc.
Noi abbiamo usato questo sistema con successo in molti dei nostri studi per caratterizzare interazioni recettore-ligando. Questi includono l'identificazione di emoagglutinina come il ligando del recettore delle cellule NK NKp462, identificando PVR e nectin-2 come ligandi per l'essere umano e del mouse TIGIT3,4, e mostrando che il nucleatum di batterio si lega e attiva umana TIGIT5. Inoltre, le cellule di BW che esprimono recettori Fc sono state utilizzate con successo per rilevare gli anticorpi anti-virali in sieri6,7,8 pazienti. In particolare, abbiamo recentemente stabilito cellule BW che esprimono umano FcγRs per rilevare differenziale FcR attivazione di anticorpi anti-CD20, utilizzato per il trattamento della leucemia linfocitaria cronica (CLL)9. D'importanza, i risultati del sistema BW reporter sono stati convalidati in esperimenti complementari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

Interazioni tra recettori e ligandi costituiscono un fondamentale processo biologico. Tuttavia, diretta esperimenti con cellule che esprimono il recettore nativo e il ligando sono difficili poiché il ligando di un recettore specifico può essere sconosciuto e procedure sperimentali con il ligando nativo possono essere tecnicamente complicate. Per affrontare questi ostacoli, descriviamo un sistema reporter per rilevare il legame e l'attivazione di un recettore specifico da un ligando di interesse. In questo sistema di reporter, il dominio extracellulare di un recettore specifico è coniugato al mouse CD3ζ e questa proteina chimerica è quindi espressa in cellule di topo BW. Queste cellule trasfettate BW possono essere incubate con destinazioni diverse (per esempio, cellule o anticorpi). Attivazione di un recettore trasfettato porta alla secrezione di interleuchina-2 del mouse (mIL-2) che può essere rilevato da analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Questo sistema di reporter ha i vantaggi di essere sensibile e specifico per un singolo ricevitore. Inoltre, il livello di attivazione di un recettore specifico possa essere facilmente quantificato e può essere utilizzato anche in casi in cui il ligando del recettore è sconosciuto. Questo sistema è stato implementato con successo in molti dei nostri studi per caratterizzare le interazioni recettore-ligando. Recentemente abbiamo utilizzato questo sistema per studiare l'attivazione dei recettori Fcy (FcγRs) di anticorpi diversi monoclonale anti-CD20 nell'uso clinico.

La figura 3 illustra i risultati di un esperimento con un sistema di reporter BW. In questo esperimento, le cellule CLL sono state pre-incubate con anticorpi diversi anti-CD20 (rituximab e obinutuzumab) e poi co-incubate con cellule trasfettate BW che esprimono CD16a-CD3ζ. Esperimenti simili sono stati condotti nel nostro Studio9. Figura 3A presenta un'immagine di una piastra ELISA cruda dove l'intensità di colore corrisponde a una concentrazione di mIL-2. L'esperimento è stato effettuato in triplice copia. Questo esperimento inclusi diversi controlli: CLL cellule incubate con cellule parentali di BW untransfected (riga superiore) e cellule di CLL incubate con BW cellule che esprimono CD16a-CD3ζ ma senza un anticorpo o con un anticorpo di controllo (sei pozzi in seconda fila a sinistra) . L'incubazione delle cellule di BW che esprime CD16 con cellule CLL che sono state pre-incubate con anticorpi anti-CD20 ha indotto una significativa secrezione di mIL-2 rispetto ai livelli del mIL-2 nei pozzetti di controllo. D'importanza, pre-incubazione delle cellule CLL con il obinutuzumab anti-CD20 attivato CD16 più fortemente di rituximab, un noto trovando che è stata ricapitolata dal nostro sistema. L'ultima riga Mostra decrescente le concentrazioni pre-definite di mIL-2 ricombinante (senza l'aggiunta di cellule). Il pozzo giusto nell'ultima riga non dispone di mIL-2 e rappresenta la lettura di sfondo, che è simile per i pozzetti di controllo. Figura 3B presenta la quantificazione dei risultati della piastra ELISA illustrato nella Figura 3A. I livelli di densità ottica (OD) sono stati convertiti in mIL-2 concentrazioni basate sulla curva standard con mIL-2 ricombinante. Figura 3 presenta un esperimento di risposta dose dove dosi differenti di anticorpi sono state pre-incubate con cellule di CLL e poi incubate con cellule di BW che esprimono CD16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del sistema reporter BW. Le cellule BW5147 sono trasfettate stabilmente con la porzione extracellulare di recettori diversi fusi ai domini transmembrana e citoplasmici del mouse CD3ζ catena (chimerico quali-CD3ζ). Attivazione di un recettore specifico-CD3ζ da un ligando provoca una secrezione di mIL-2 che possono essere rilevati da ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> Figura 2: la struttura del recettore chimerico-CD3ζ e il design degli iniettori di PCR. (A) struttura generale di un recettore extracellulare fuso ai domini transmembrana e intracellulari del mouse CD3ζ. (B) il dominio extracellulare del recettore è stato amplificato con un primer 3' che comprendeva anche nucleotidi di CD3ζ. (C) i domini transmembrana e intracellulari di CD3ζ sono stati amplificati con un primer 5' che comprendeva anche nucleotidi del ricevitore. (D) nella reazione di PCR finale, entrambi i segmenti, che sono sequenze di sovrapposizione, sono stati utilizzati come il modello di DNA. In tutti i pannelli di figura, domini differenti della proteina sono color-coded e boxed in rettangoli blu (CD3ζ sequenza) e rettangoli rossi (la sequenza del ricevitore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> Figura 3: illustrazione del prodotto finale del sistema reporter BW. (A, B, C) Cellule di CLL sono state pre-incubate con o senza due anticorpi anti-CD20 (rituximab e obinutuzumab) o un anticorpo di controllo. In seguito, le cellule legata all'anticorpo sono state incubate con cellule parentali BW o BW cellule che esprimono CD16a-CD3ζ. Il livello di mIL-2 nel surnatante è stato determinato da ELISA. (A) un'immagine di una piastra ELISA cruda. Intensità del colore indica la concentrazione di mIL-2 nel surnatante. L'esperimento è stato effettuato in triplice copia. La riga inferiore indica la lettura di ELISA nel diminuire le concentrazioni di ricombinante mIL-2 che sono state analizzate nello stesso piatto. (B) quantificazione del Elisa lettura mostrato in (A). I livelli di mIL-2 sono stati calcolati usando una curva standard di mil-2. (C) A dose risposta experiment dove diverse dosi di anticorpi sono state pre-incubate con cellule di CLL e poi incubate con cellule di BW che esprimono CD16a-CD3ζ. , P < 0,001; Test t di Student (B) o ANOVA con i confronti multipli (C). Il confronto solo in (C) che non era significativamente differente era per rituximab e il controllo Ab nella prima concentrazione (0,01 µ g/mL). Barre di errore rappresentano la deviazione standard delle triplici copie. Esperimenti simili sono stati eseguiti come parte di una delle nostre recenti Studio9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di reporter che può essere utilizzato per identificare e quantificare le interazioni recettore-ligando.

Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.Il BW Reporter System consente di studiare le interazioni recettore-ligando. È estremamente utile nei casi in cui il ligando di uno specifico recettore è sconosciuto o nei casi in cui gli esperimenti con il ligando endogeno sono tecnicamente difficili. Questo metodo è sensibile e specifico per un singolo recettore, facile da usare e riproducibile.A dimostrare la procedura sarà Shira Kahlon, un postdoc per il mio laboratorio. Il giorno prima della trasfezione, placcare 10 piastre con 10 millilitri di 100.000 cellule BW5147 e integrare un RPMI. Quindi posizionare 100 microgrammi del plasmide pcDNA3 in un tubo.Aggiungere l'acetato di sodio a pH 5.3 al tubo. Successivamente, aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela plasmide. Quindi incubare la miscela plasmide durante la notte a meno 20 gradi Celsius.24 ore dopo aver placcato le cellule BW, raccogliere le cellule in due tubi da 50 millilitri. Quindi centrifugare le cellule a 515 g per cinque minuti e scartare il supernatante. Rimospend il gruppo RPMI senza aggiunte e ripetere la centrifugazione.Resuspend il pellet risultante in 1 millilitro di RPMI senza aggiunte. Trasferire il pellet rimorsio in una cuvata di 4 centimetri sul ghiaccio. Centrifugare il plasmide che ha subito precipitazioni di etanolo.Quindi lavare il plasmide con un millilitro di 70% di etanolo. E ripetere la centrifugazione per altri 20 minuti. Rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare parzialmente il pellet.Quindi rimescolare il pellet in 100 microlitri di RPMI preriscaldato, senza aggiunte. Dopo questo, aggiungere il plasmide rimorsidito alle cellule in coccola. Incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti.Quindi, elettroporate le cellule. Quindi trasferire le celle elettroporate in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 50 millilitri di mezzo completo al tubo e centrifugare per cinque minuti, a 515 g.Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 50 millilitri di mezzo completo. Quindi placcare le cellule in piatti di coltura di 24 pozzi e incubare le cellule per 48 ore. Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo completo, integrato con 10 milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo.48 ore dopo, scartare un millilitro del volume superiore di ogni pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo completo integrato con cinque milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo. Utilizzare 50.000 cellule BW trasfette con i bersagli desiderati, in un unico pozzo di una piastra da 96 po'.Incubare la piastra per 48 ore. Quindi congelare la piastra a meno 20 gradi Celsius. Rivestire una piastra ELISA con anticorpo IL-2 anti-topo.Posizionare 05 microgrammi di IL-2 anti-mouse, in un volume di 50 microlitri di PBS in ogni pozzo. Incubare la piastra rivestita durante la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzare un breve periodo di incubazione a 37 gradi Celsius, per scongelare le cellule BW congelate, precedentemente incubate con i loro bersagli.Quindi centrifugare la piastra e trasferire 100 microlitri del supernatante da ogni pozzo alla piastra ELISA pre-rivestita. E incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo questo aggiungere biotina anti-mouse IL-2 alla piastra ELISA.Quindi, dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere la streptavidina coniugata HRP al piatto. Dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato TMB, ad ogni pozzo della piastra ELISA. Leggi infine la piastra ELISA a 650 nanometri.In questo esempio, le cellule CLL sono state pre-incubate con diversi anticorpi anti-CD20. E poi co-incubato con cellule BW trasfette che esprimono i recettori Fc CD16, prima di essere analizzato con ELISA. Dopo l'analisi con ELISA i risultati sono stati quantificati.I livelli di densità ottica, sono stati convertiti in concentrazioni il-2 del mouse, in base alla curva standard. In un esperimento aggiuntivo, diverse dosi di anticorpi anti-CD20 sono state pre-incubate con cellule CLL. E poi incubato con le cellule BW trasfette.La particella contiene quattro parti principali. Clonazione, trasfezione di cellule BW, attivazione ed ELISA. Ognuna delle parti deve essere verificata in modo indipendente.Seguendo questa procedura, ulteriori esperimenti possono essere eseguiti con cellule che esprimono i recettori endogeni, come uccidere gli acidi con cellule NK per studiare le interazioni con i recettori cellulari NK. Abbiamo usato questo sistema per scoprire nuovi ligandi dei recettori cellulari NK. Per esempio, l'emagglutinina è un ligando di NKp46, e PVL è un ligando di TG.

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