Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
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저자는 언어 편집에 대 한에 스 더가 수 감사합니다. 이 연구는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP/2007-2013) 아래 유럽 연구 위원회에 의해 지원 되었다 / ERC 부여 계약 번호 320473-BacNK. 난-코어는 계획 예산 위원회 및 이스라엘 과학 재단의 프로그램에 의해 및 I-핵심 Chromatin와 RNA 유전자 규칙, GIF 재단, 루이스 가족 재단 ICRF 교수 그랜트에 의해 추가 지원을 제공 했다는 헬름홀츠 이스라엘 그랜트 그리고 Rosetrees 신뢰 (모든 O.M.). 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (그랜트 502/15), 카스 의료 연구 상 (S.E)를 이스라엘 사회 혈액학 및 수혈 의학에서 연구 그랜트에 의해 또한 지원 되었다. O.M 분자 면역학의 왕관 교수 이다입니다.

1. 공상 건설을 표현 하는 플라스 미드의 생성
참고: 목표 마우스 CD3ζ 체인 (그림 2A)의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합의 수용 체의 세포 외 도메인을 표현 하는 플라스 미드를 생성 하는.
<ol><li>신호 펩 티 드를 포함 하 여 관심의 수용 체의 세포 외 도메인의 시퀀스를 검색 합니다. (예를 들어, cDNA 또는 한 플라스 미드)이 수용이 체를 표현 하기 위해 예상 되는 DNA 자료를 얻을.</li>
	<li>DNA 자료를 표현 하는 막 횡단 및 마우스 CD3ζ 체인의 세포내 도메인 (예., cDNA 또는 한 플라스 미드).</li>
	<li>그림 2A에 표시 된 일반적인 구조에 따라 융해 단백질의 시퀀스를 디자인 합니다. 전체 시퀀스 프레임 내에 동일한 codon 읽는 다는 것을 확인 하십시오. 이 순서는 적절 한 뇌관을 디자인 하 고 최종 제품을 확인 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>융해 단백질의 파편의 각각을 별도로 증폭 하는 두 개의 PCR 반응 디자인 (그림 2B, 2c)10. 참고: PCR 반응에 대 한 특정 조건 (예., 신장 시간 및 어 닐 링 온도)는 특정 수용 체를 위한 뇌관의 성격에 따라 달라 집니다.<ol>
<li>수용 체의 extracellular 세그먼트를 증폭.<ol>
<li>수용 체, Kozak 합의 시퀀스, 그리고 적절 한 제한 사이트 (그림 2B)의 신호 펩 티 드의 부분을 포함 5 개의 ' 뇌관 디자인.</li>
			<li>Flanks 융합 단백질 (그림 2B)의 두 부분 3' 뇌관 디자인. 예를 들어 초기 디자인에 대 한이 3' 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 9 기본적인 쌍의 마지막 20의 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다. 참고: 거기 아무 필요도 금지 사이트를 추가 3' 뇌관이이 뇌관 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 및 결 찰에 대 한 사용 되지 않습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>CD3ζ 세그먼트를 증폭.<ol>
<li>5' 뇌관 flanks 융합 단백질 (그림 2C)의 두 부분을 디자인 합니다. 예를 들어 초기 디자인에 대 한 5 개의 ' 뇌관 수용 체의 extracellular 세그먼트와 CD3ζ 세그먼트의 처음 20 기본적인 쌍의 마지막 9 기본적인 쌍을 포함할 수 있습니다. 참고:이 입문서 융합된 시퀀스를 생성 하는 데 사용 됩니다 고 결 찰을 사용 하지 않는 5 개의 ' 뇌관 제한 사이트를 추가할 필요가 없습니다 있다.</li>
			<li>CD3ζ 시퀀스를 적절 한 제한 사이트 (그림 2C)의 끝을 포함 하는 3' 뇌관 디자인.</li>
		</ol>
</li>
		<li>어 닐 링 온도 각 쌍 (두 부분 융해 단백질의 시퀀스를 포함, 뇌관만 각 반응에서 시퀀스의 부분 anneals 참고)에 비슷한이 두 반응의 각 뇌관 시퀀스를 수정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>처음 두 반응의 PCR 제품의 혼합물과 세포 외 수용 체 세그먼트 (단계 1.4.1.1)의 5 개의 ' 뇌관은 3' CD3ζ 세그먼트 (단계 1.4.2.2)의 (그림 2D)10 DNA 템플렛으로 사용 되는 추가 PCR을 수행 . 이 반응 최종 융합된 시퀀스를 생성 해야 합니다.</li>
	<li>복제에 대 한 평소와 같이 진행 합니다.<ol>
<li>벡터 (대상 벡터는 일반적으로 G418 및 암 피 실린 저항을 표현 하는 pcDNA3)을 삭감 대상에 최종 PCR 제품 선</li>
		<li>유능한 박테리아11에 합자 벡터 변환.<ol>
<li>얼음에 유능한 박테리아의 50 µ L 해빙</li>
			<li>박테리아에 합자 벡터를 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.</li>
			<li>42 ° C 45에서 품 어 s.</li>
			<li>항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
			<li>적절 한 항생제 (예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션)와 파운드 플레이트에 씨.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수집 하 고 (15 mL 튜브)에 파운드의 5 mL에 여러 가지 세균성 식민지 성장.</li>
		<li>다음 날, 미니 준비 키트와 플라스 미드 추출 합니다.</li>
		<li>제한 효소와 유전자 삽입을 분석 합니다.</li>
		<li>시퀀싱 관련 식민지 하 고 시퀀스와 독서 프레임 올바른지 확인 (같이 1.3 단계에서에서).</li>
	</ol>
</li>
	<li>유능한 박테리아11로 확인 된 플라스 미드를 변환.<ol>
<li>20 µ L 얼음에 유능한 박테리아의 해빙</li>
		<li>박테리아에 플라스 미드의 1 µ L을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>42 ° C 45에서 품 어 s.</li>
		<li>항생제 없이 파운드의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>연속 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>(예, 0.1 mg/mL의 최종 농도와 암 피 실린 솔루션) 적절 한 항생제로 세균성 성장 플레이트에 씨.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 날, 0.1 mg/mL 암 피 실린 (~ 250 mL)와 큰 파운드 컨테이너에 세균성 식민지 성장.</li>
	<li>다음 날, 맥시 준비 키트에서 제공 하는 특정 지침에 따라 수행 합니다. 참고: electroporation 절차에 대 한 대량 플라스 미드가 아래로 필요 합니다.</li>
</ol>2. transfection BW 셀에 공상 단백질을 표현 하는 플라스 미드의
참고: 다른 방법 transfection를 위해 채택 될 수 있다 또한 (예를들면., lentiviral 감염). Electroporation, 전에 아래와 같이 DNA의 에탄올 강수량을 수행 합니다. 다음 단계는 무 균 조건 필요합니다.
<ol><li>하루 전에, electroporation는 BW5147 셀 ("BW") 준비. 접시 10 접시 (10 cm) 100000 BW5147 셀/mL의 (즉, 10 x 106 세포의 총) 10 mL와 RPMI 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 1 %L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1%와 보충 페니실린-스 ("완전 한 매체").</li>
	<li>1.5-2 mL 튜브에 융해 단백질을 표현 하는 pcDNA3 플라스 미드의 100 µ g 놓고 그것에 pH 5.3-5.5에서 3m 나트륨 아세테이트를 추가 합니다. 나트륨 아세테이트의 볼륨 100 µ g 플라스 미드의 볼륨의 0.1 (10%)에 해당 한다; NaOH 또는 HCl를 추가 하 여 pH 미터를 가진 나트륨 아세테이트의 pH를 적정 하십시오.</li>
	<li>2.2 단계 (2.5 엑스 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 총 거래량)에 설명 된 대로 플라스 미드 및 나트륨 아세테이트의 혼합물에 100% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. 70 ° c.에서 2 h 또는-20 ° C에서 밤새 품 어</li>
	<li>2.4. 24 h 후 BW 셀 도금 되었습니다, 모든 BW 셀 (~ 100 mL) 2 50 mL 튜브에 수집 합니다. 515 x g 에 5 분에 대 한 셀을 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>다시 25 mL RPMI-단일 50 mL 튜브에서에 두 튜브에서 펠 릿을 일시 중단 합니다. 예를 들어 다시 25 mL RPMI-와 1 개의 관의 펠 릿을 일시 중지 하 고이 액체를 사용 하 여 다시 뷔 셀에서 총 펠 릿 다시 단일 튜브에 매체의 25 mL에 일시 중지 되도록 다른 50 mL 튜브에 액체를 일시 중단. 참고: 매체 이어야 한다 추가 없이 혈 청 electroporation 방해할 수도 있기 때문.</li>
	<li>515 x g에 5 분 동안 다시 셀 원심 다시 RPMI의 1 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 얼음에 0.4 cm 베트 내용을 전송.</li>
	<li>16000 x g 와 4 ° C에서 30 분 동안 에탄올 강수량 (2.3 단계)를 받았다 플라스 미드를 원심</li>
	<li>70% 에탄올과 다른 20 분 16000 x g 와 (를 소금) 4 ° C에서 원심 분리기의 1 mL로 한 번 씻어.</li>
	<li>모든 에탄올을 제거 하 고 약간 건조 한 펠 릿 (즉, 조직 문화 후드에서 오픈 관에서). 다시 100 µ L의 RPMI-이전 60 ° c가 열 된 펠 릿을 일시 중단</li>
	<li>다시 일시 중단 된 플라스 미드 (단계 2.8)는 베트에 셀을 추가 하 고 얼음에 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>Electroporate 0.23에서 셀 kV, 250 capacitation. 이 ~ 4 ms를 취해야 한다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 electroporated 세포를 전송, 515 x g. 에서 완전 한 매체 및 5 분 동안 원심 분리기의 50 mL를 추가
</li>
	<li>상쾌한 삭제 하 고 다시 완전 한 매체의 50 mL와 함께 셀을 일시 중단.</li>
	<li>24 잘 문화 요리 (1 mL 당 50 ~ 웰 스의 총 잘) electroporated 셀 접시 하 고 37 ° C, 5% CO2 48 h에 품 어.</li>
	<li>항생제로 transfected 셀을 선택 합니다. 48 h 추가 10 mg/mL G418 각 잘 보완 하는 완전 한 매체의 1 mL (이 단계에서 각 마지막 볼륨 잘 2 mL 이며 각 G418의 최종 농도 잘 5 mg/mL). 참고: 다른 항생제 내성 플라스 미드 있으면이 단계 전에 untransfected BW 세포를 죽 일 하는 데 필요한 항생제 농도 결정 합니다.</li>
	<li>모든 48 h 신중 하 게 우물에서 매체를 교 반 하지 않고 각의 위쪽 볼륨의 1 mL를 삭제 (BW 세포는 우물의 바닥에 있을 하는 경향이 있다). 각 잘에서 최종 볼륨은 다시 2 mL 5 mg/mL G418 각 음을 보충 하는 완전 한 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>모든 우물에서 세포 성장 위한 문화 접시를 정기적으로 검사 합니다. 참고: 노란색 매체의 색상에서 변경 수 있습니다 식별할 성장 세포; 그러나, 처음에 매체 됩니다 노란색에 G418 때문에 자체. 양수 우물 (웰 스 성장 하는 세포)를 식별 합니다. 이 우물 G418 방지 되며 따라서 융해 단백질을 표현할 것으로 예상 된다. 이 프로세스는 일반적으로 3 주 걸립니다.</li>
</ol>3. 긍정적인 우물에서 셀에 Transfected 수용 체의 식의 확인.
<ol><li>하 페는 수용 체에 대 한 특정 항 체로 transfected BW 셀 얼룩.</li>
	<li>Cytometry는 제어 셀 (untransfected BW)의 표현에 의해 수용 체의 식 수준 비교.</li>
	<li>확인 후 하나 이상의 우물의, 실험적인 목적을 위한 세포를 즉시 사용 하는 방법, 문화, 성장 또는 미래의 응용 프로그램에 대 한 동결.</li>
	<li>새로운 실험을 수행 하기 전에 transfected 수용 체의 식을 확인 합니다. 성장, 안정 되어 있는 수용 체 식 G418 셀의 몇 주 후 G418 문화 매체에서 생략할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 보육 대상 Transfected BW 셀의
참고: transfected BW 셀을 사용 하 여 처음으로, 그것은 관심의 수용 체의 알려진된 리간드를 표현 하는 대상 또는 플레이트-바인딩 항 체 특히 관심 (cross-linking의 수용 체에 대 한 감독 들을 테스트 하는 것이 좋습니다. 실험; 아래 참조, 4.2.1.3 섹션).
<ol><li>가급적 이면, (예를 들어 새로운 10 cm 배양 접시에 문화에 있는 세포의 2 개 mL를 완전 한 매체의 10 mL을 추가) 하 여 BW 세포 실험 하기 전에 24 시간을 분할.</li>
	<li>그들의 목표를 가진 transfected BW 세포를 품 어. 빈 벡터 (또는 부모의 BW 셀) 표현 하는 제어 BW 셀에 실험을 동시에 수행 합니다. 96F 격판덮개는 바람직 (하지만 96U 접시를 사용할 수 있습니다). 3 중에서 실험을 수행 합니다. 완전 한 매체에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.<ol>
<li>목표를 준비 합니다. 대상의 유형, 목표의 기능으로 변화 한다 그리고 사전에 항 체 또는 항 체 혼자 incubated 셀 수 있습니다. 이 시스템은 또한 대상5박테리아와 함께 사용 되었습니다.<ol>
<li>목표 셀 (즉, 셀 라인) 분할 된다, 경우 6000 rad 분석 결과 이전에 그들을 비추는. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 대상 셀의 장소 50000.</li>
			<li>항 체 및 인간 FcγRs을 표현 하는 BW 셀 실험 품 어 96 잘 접시에 얼음에 항 체와 대상 셀에 대 한 (예를 들어, 대상 셀의 50 µ L와 항 체;의 50 µ L에 대 한 서로 다른 항 체 투여 시험 될 수 있다).</li>
			<li>혼자 항 체를 사용 하 여 (실험 cross-linking) 대상으로, 그들은 플레이트-바인딩을 해야한다. 이 위해 먼저 96F 접시 1-2 h 37 ° C, 5% CO2 (전형적인 시작 복용량은 50 μ에 특정 항 체의 0.5 μ g)에 대 한 완전 한 매체에 있는 항 체에 품 어. 언바운드 항 체를 제거 하는 접시를 씻는 다. 참고:이 경우에, 96F 접시 하면 transfected 수용 체의 활성화로 이어질 것입니다 격판덮개 transfected BW 셀의 추가 후에 항 체의 바인딩이 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>BW 세포 (effector 세포)를 추가 합니다. 96 접시 (100 µ L의 볼륨)에 한 잘에 50000 BW 셀을 배치 합니다.</li>
		<li>볼륨에 필요한 경우 200 µ L 각 잘 완료.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2 48 h (이 기간 측정 될 수 있다)에 번호판을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>48 h 후-20 ° C와 ELISA, 전에 해 동 플레이트 고정 또는 ELISA 즉시 사용 (다음 단계 참조).</li>
</ol>5입니다. 엘리 사
<ol><li>반대로 마우스 일리노이-2 항 체 (항 mIL-2)와 ELISA 격판덮개 코트. 잘 당 1 x PBS의 50 µ L의 볼륨에 반대로 mIL-2의 0.05 µ g를 배치 합니다. 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 반대로 mIL-2 항 체로 코팅된 ELISA 격판덮개를 품 어. 참고: ELISA 인큐베이션 단계 후 직접 수행, ELISA 격판덮개 한다 코팅 24 h BW 셀의 잠복기의 끝 전에.</li>
	<li>ELISA 격판덮개에 액체를 폐기 하 고 1 x PBS와 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 구성 되는 차단 솔루션 (잘 당 200 µ L)를 추가 합니다. 실 온에서 2 h의 ELISA 격판덮개를 품 어.</li>
	<li>세 번 0.05 %PBS 트윈 솔루션 (즉, 1 x PBS의 1 리터에서 트윈-20의 0.5 mL)와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.</li>
	<li>그들의 목표 (4.3)와 인 큐베이 팅 된 BW 셀 96 접시를 가져가 라. 접시, 냉동 하는 경우 완전히 녹여 (예., 여 37 ° C에 외피를 짧은). 원심 96 접시 (5 분, 515 x g) 고 신중 하 게 미리 코팅 및 차단 ELISA 격판덮개에 각 잘 상쾌한의 100 µ L를 전송. 참고:는 상쾌한 셀을 복용 하지 않도록 각의 측면에서 수집 한다.</li>
	<li>원하는 경우, 밀-2의 표준 곡선을 생성 하기 위해 코팅된 ELISA 격판덮개의 빈 행 중 하나에 정의 된 농도와 재조합 밀-2를 추가 합니다. 예를 들어 밀-2 2500 pg/mL의 농도에서 시작 하 고에 각 후속 잘; 50% 감소 추가 하지 마십시오 밀 2 마지막 잘.</li>
	<li>ELISA 격판덮개 또는 2 h 37 ° C에서 4 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
	<li>4 시간 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.</li>
	<li>ELISA 격판덮개에 biotin 반대로 마우스 일리노이-2를 추가 합니다. 1 x 1 %BSA PBS의 1 mL에 1 µ g 항 체의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L를 나눕니다.</li>
	<li>1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.</li>
	<li>활용 하는 HRP streptavidin을 추가 합니다. 1 %BSA PBSX1의 1 mL에 1 µ L streptavidin의 농도 사용 하 고 잘 당 100 µ L로 나눕니다.</li>
	<li>30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>6 번 PBS 트윈와 ELISA 격판덮개를 세척 하십시오.</li>
	<li>TMB 기판 솔루션의 당 100 µ L를 추가 합니다. 때문에 시간을 뒤져는 TMB 추가할 때 우물 사이의 차이 최소화 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료 합니다.</li>
	<li>650에서 ELISA 플레이트 리더 ELISA 격판덮개를 읽고 nm (읽기 수 신호가 약한 경우 반복).</li>
</ol>

<ol>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기 선물이 기자 시스템 조사 (참조1에서이 프로토콜의 축약 된 형태) 수용 체 ligand 상호 작용을 생성 하기 위한 프로토콜. 프로토콜은 세 가지 주요 부분으로 구성: CD3ζ, BW 셀에 융해 단백질을 표현 하는 플라스 미드의 transfection의 세포내 도메인 융합 특정 수용 체의 세포 외 도메인을 포함 하는 공상 단백질의 복제 (예: , electroporation에 의해), 그리고 마우스 ELISA에 의해 일리노이-2의 정량적 검출. 이 부속의 각각의 최종 제품 독립적으로 확인 해야 합니다: 대상 플라스 미드에 융해 단백질의 완전 한 연속 복제 프로세스를 확인 해야 합니다, BW 세포의 transfection에의 식을 검사 하 여 확인 되어야 한다는 BW 셀 (예를 들어, cytometry에 의해), 그리고 엘리 사 과정에 대 한 관심의 수용 체 transfected BW 셀;에 대 한 특정 컨트롤 뿐만 아니라 일반적인 긍정적인 컨트롤 (예:, 재조합 밀-2)에 의해 확인 되어야 한다 즉, (예를 들어, 셀에 BW 셀을 표현 하는 NK 세포 수용 체 2B4 익스프레스 CD48 긍정적인 제어로 사용할 수 있습니다)의 수용 체의 알려진된 리간드를 표현 하는 대상. 예를 들어, 복제 프로세스 수 있습니다, 하지만 융해 단백질은 BW 세포에 의해 표현 하지. 이 경우에 electroporation 반복 한다. 또는, ELISA 격판덮개의 배경 수준 이상의 신호 transfected BW 세포 수용 체를 표현 하기 위해 실패 수 있습니다 (특히 컨트롤에 대 한 긍정적인) (또는 식 손실 되었습니다) 동안 기술적인 문제가 발생 한 또는 ELISA 과정입니다.
몇 가지 수정 절차의 일반 원칙을 유지 하면서이 프로토콜을 만들 수 있습니다. 이러한 수정 융해 단백질, transfecting BW 전지와 외피와 ELISA 대상 (예를 들어, 셀, 항 체, 등)의 종류 등에 관련 된 특정 매개 변수를 플라스 미드에 대 한 방법을 표현 하는 데 사용 하는 벡터를 포함 대상 셀 또는 항 체 농도 관련 (우리 잘 하 고 시작 하는 복용량의 0.5 µ g/항 체 당 50000 셀)를 사용 하는 경우의 수 (우리를 사용 하 여 48 h의 외피 시간) 부 화 시간과 ELISA 격판덮개 전송 되는 표면에 뜨는 볼륨.
이 방법은 중요 한, 특정 고 쉽게 양이 정해질 수 있다. (특히 경우 자체 ligand 인정 하지) 특정 한 수용 체에 ligands의 존재에 대 한 심사에 이상적입니다. 특정 수용 체를 표현 하는 transfected BW 셀 준비 후이 세포 냉동 고 추가 실험을 위해 필요할 때 사용 될 수 있습니다. 우리와 다른 사용이 시스템 성공적으로 이전 연구에서 수용 체 ligand 상호 작용 (예2,3,5,12,,1314 탐험 ,1516) 하 고이 시스템에서 얻은 결과 다른 기술에 의해 확인 되었습니다. 이 방법을 사용할 수 있습니다 또한 다른 인간 FcγR 수용 체의 활성화를 공부 하 항 체, 혈 청6,,78 또는 CD20에 대하여 단일 클론 항 체와 항 바이러스 항 체를 일에 의해 9.
이 수용 체의 extracellular 세그먼트만 표시 됩니다 기자 시스템 이므로,이 시스템에서 얻은 결과 자연 세포 독성 분석 실험 등 내 인 성 수용 체와 추가 실험에 의해 보완 해야 킬러 (NK) 세포 NK와의 상호 작용을 공부 하는 수용 체 세포. 또한, 특정 수용 체의 ligand 상호 작용 하지 밀 2 분 비 기자 시스템에 의해 발생할 수 있습니다 그리고 그러므로 간과 될 수 있습니다. 또한, 어떤 실험 설정에서 결과 확인 되어야 한다 다양 한 매개 변수에 대 한 위에 설명 된 대로. 이 경우 두 개의 조건의 비교 필요 (예를 들어, 다른 항 체에 의해 같은 Fc 수용 체의 활성화) 특히 중요 하다. 그것은 또한 특정 리간드-수용 체 상호 작용의 감도 시스템의 선형 범위 내 임을 확인 하는 것이 중요. 그렇지 않으면이 조건에 걸쳐 유효한 비교를 배제 수 있습니다 채도 값 발생할 수 있습니다. 이 테스트 ligand와 복용량 응답 곡선을 생성 하 여 뿐만 아니라 밀 2 표준 곡선을 사용 하 여 달성 될 수 있다 (포화 값, 경우 실험적인 매개 변수 수정 해야; 예를 들어를 상쾌한의 작은 볼륨 분석 되어야 합니다 ELISA에 의해). 이 시스템의 또 다른 가능한 한계 밀-2의 (예를 들어, 마우스 T 세포)는 뷔 셀의 일리노이-2 분 비 마스크 것 내 인 성 분 비 물과 대상 셀의 사용 이다. 극복 하기 위해 마우스 세포에 수감 되는이 매우 드문 발생,이 기자 시스템 대상 세포에 의해 표현 되는 다른 기자를 (예를 들어, GFP)를 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다.

BW 기자 시스템 수용 체 ligand 상호 작용1을 공부 하는 기술 이다. 이 시스템은 특정 수용 체의 ligand 알려진 또는 내 인 성 ligand와 실험은 기술적으로 어려운 때 특히 유리 하다. 그것은 또한 공부 인간의 FcγRs 단일 클론 항 체의 바인딩을 사용할 수 있습니다. 메서드를 사용 하면 마우스 BW 셀에 공상 단백질 표현 기반으로 합니다. 이 공상 단백질 마우스 ζ 체인의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합의 수용 체의 세포 외 도메인 구성 됩니다. 수용 체의 적절 한 ligands의 바인딩은 감지할 수 있습니다 쉽게 ELISA, 그림 1에서 볼 수 있듯이 마우스 일리노이-2의 분 비를 리드. 이 메서드는와 관련 된 개별 수용 체, 간편한 작동, 민감하고 높은 재현성. 그것은 따라서 수용 체 ligand 상호 작용을 공부에 대 한 추가 도구를 보완 하는 수 있습니다. 예를 들어 사용할 수 있습니다 (경우에 자체 ligand 식별 되지 않은) 특정 수용 체에 ligand의 존재에 대 한 여러 세포 라인 화면 또는 단일 클론 항 체 또는 인간 혈 청 항 바이러스를 포함 하 여 인간 FcγRs의 활성화를 감지 항 체입니다. 기본 면역 세포 생 FcγRs 익스프레스, 하지만 그들은 일반적으로 처리 하 고 일반적으로 여러 Fc 수용 체를 표현 하기 어려운입니다.
우리는 사용이 시스템 성공적으로 우리의 연구의 많은 수용 체 ligand 상호 작용의 특성. 이 NK 세포 수용 체 NKp462, 인간 ligands 및 마우스 TIGIT3,4, nectin-2 PVR을 식별의 ligand haemagglutinin 식별을 포함 하 고 fusobacterium nucleatum 보여주는 박테리아 바인딩합니다 및 인간의 TIGIT5를 활성화합니다. 또한, Fc 수용 체를 표현 하는 BW 셀 환자 세라6,,78안티 바이러스 항 체를 검출 하기 위하여 성공적으로 사용 되었습니다. 특히, 우리는 최근에 만성 림프모구 백혈병 (CLL)9의 처리에 사용 하는 안티-CD20 항 체의 차동 FcR 활성화를 감지 하는 인간의 FcγRs를 표현 하는 BW 셀 설립. 중요 한 것은, BW 기자 시스템의 결과 보완 실험에 유효성이 검증 되었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

수용 체와 ligands 간의 상호 작용 기본적인 생물 학적 프로세스를 구성합니다. 그러나, 네이티브 수용 체를 표현 하는 세포와 실험을 직접 하 고는 ligand 도전 이후 특정 수용 체의 ligand 수 있습니다 알 수 없는 네이티브 ligand와 실험 절차는 기술적으로 복잡 한 될 수 있습니다. 이러한 장애를 해결 하기 위해 우리는 기자 감지 하는 시스템 바인딩 및 특정 수용 체의 활성화의 리간드에 의해 설명 합니다. 이 기자 시스템에서 특정 수용 체의 세포 외 도메인 CD3ζ 활용 하 고이 공상 단백질 다음 마우스 BW 셀에 표시 됩니다. 이러한 transfected BW 셀 다른 대상 (예를 들어, 셀 또는 항 체) 하 고 다음 알을 품 수 있습니다. Transfected 수용 체의 활성화 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)에 의해 검출 될 수 있다 마우스 interleukin-2 (밀-2)의 분 비에 지도 한다. 이 기자 시스템 과민 하 고 특정 한 수용 체의 이점이 있다. 또한, 특정 수용 체의 활성화 수준을 쉽게 측정할 수 있다 그리고 수용 체의 리간드가 알려진 없는 경우에도 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 우리의 연구 특성 수용 체 ligand 상호 작용의 대부분에 성공적으로 구현 되었습니다. 우리는 최근 임상 사용에서 다른 단일 클로 널 항-CD20 항 체에 의해 인간 Fcγ 수용 체 (FcγRs)의 활성화를 공부 하는이 시스템을 채용 했습니다.

그림 3 에서는 BW 기자 시스템 실험의 결과를 보여 줍니다. 이 실험에서 CLL 세포는 미리 다른 안티-CD20 항 체 (rituximab, obinutuzumab)와 함께 알을 품 이었고 공동 인 큐베이 팅 transfected BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는. 비슷한 실험은 우리의 연구9에서 실시 되었다. 그림 3A 원시 ELISA 격판덮개 명도 밀 2의 농도에 해당 하는 곳의 이미지를 제공 합니다. 실험 3 중에서 수행 되었다. 이 실험 포함 여러 컨트롤: 보호자 untransfected BW 셀 (위쪽 행)와 CLL 세포 incubated CLL 세포 incubated BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는 하지만 항 체 없이 또는 제어 항 체 (왼쪽에서 두 번째 행에서 6 웰 스) . CD16 안티-CD20 항 체와 인 큐베이 팅 했다 미리 CLL 세포 표현 BW 세포의 외피 밀-2 제어 우물의 밀 2 레벨에 비해의 중요 한 분 비를 유도 한다. 중요 한 것은, 안티-CD20 obinutuzumab 가진 CLL 세포의 사전 보육 활성화 CD16 rituximab, 알려진 찾는 우리의 시스템에 의해 지는 보다는 더 강하게. 마지막 행 (셀의 추가) 없이 재조합 밀 2의 미리 정의 된 농도 내림차순으로 표시 됩니다. 마지막 행에서 오른쪽 잘 밀-2는 고 나타나는 컨트롤 웰 스와 비슷한 배경 독서를 나타냅니다. 그림 3B 그림 3A에서 ELISA 격판덮개의 결과의 정량화를 선물 한다. 광학 밀도 (OD) 레벨 밀 2 농도 재조합 밀-2 표준 곡선을 기반으로 변환 했다. 그림 3C 복용량 응답 실험을 항 체의 다른 복용량 했다 미리 CLL 세포와 인 큐베이 팅 하 고 다음 BW 셀 CD16 표현으로 알을 품을 선물 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> 그림 1: BW 기자 시스템의 도식 대표. BW5147 세포는 안정적으로 마우스 CD3ζ 체인 (공상 recptor-CD3ζ)의 막 횡단 및 세포질 영역을 융합 하는 서로 다른 수용 체의 extracellular 부분을 가진 페. Ligand 결과 ELISA에 의해 검출 될 수 있다-2 밀의 분 비에 의해 특정 수용 체 CD3ζ의 활성화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> 그림 2: PCR 뇌관의 디자인과 공상 수용 체 CD3ζ의 구조. (A)는 세포 외 수용 체의 구조는 마우스 CD3ζ의 막 횡단 및 세포내 도메인 융합. (B) 수용 체의 세포 외 도메인은 또한 CD3ζ의 뉴클레오티드를 포함 하는 3' 뇌관 증폭 되었다. (CD3ζ의 도메인 C)는 세포내 및 막 횡단 수용 체 뉴클레오티드 포함 5' 뇌관 증폭 했다. (D) 최종 PCR 반응에에서 있는 시퀀스를 중첩, 두 세그먼트 DNA 템플렛으로 사용 되었다. 모든 그림 패널에서 다른 단백질 도메인 색상으로 구분 하 고 파란색 사각형 (CD3ζ 시퀀스) 및 빨간색 사각형 (수용 체 시퀀스) 박스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> 그림 3: BW 기자 시스템의 최종 제품의 그림. (A, B, C) CLL 세포 미리 incubated 두 안티-CD20 항 체 (rituximab 및 obinutuzumab) 또는 제어 항 체 없이 했다. 이후에, 항 체 바인딩된 셀 부모의 BW 셀 또는 BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 하는 인 큐베이 팅 했다. 밀-2는 상쾌한의 수준 ELISA에 의해 결정 되었다. (A)는 원시 ELISA 격판덮개의 이미지. 명도 상쾌한에 밀 2의 농도 나타냅니다. 실험 3 중에서 수행 되었다. 아래쪽 행 같은 접시에 분석 된 재조합 밀-2의 농도 감소에 ELISA 판독을 보여줍니다. (B) (A)에 표시 된 읽기 ELISA의 정량화. 밀 2 레벨 밀-2의 표준 곡선을 사용 하 여 계산 했다. (C) A 복용량 응답 실험 항 체의 다른 복용량 미리 CLL 세포와 알을 품 하 고 다음 인 큐베이 팅 BW 셀 CD16a CD3ζ을 표현 했다. P < 0.001; 학생의 t 시험 (B) 또는 여러 비교 (C) ANOVA. (C)에 크게 다른 유일한 비교 rituximab 및 첫 번째 농도 (0.01 µ g/mL)에서 제어 Ab에 대 한 했다. 오차 막대는 triplicates의 표준 편차를 나타냅니다. 비슷한 실험은 우리의 최근 연구9중의 일환으로 실시 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

이 프로토콜을 식별 하 고 계량 수용 체 ligand 상호 작용 하는 데 사용할 수 있는 기자 시스템을 설정 하는 방법을 설명 합니다.

수용 체 Ligand 상호 작용을 공부 하기 위한 BW 기자 시스템

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.BW 리포터 시스템은 수용체 리간드 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 특정 수용체의 리간드가 알려지지 않았거나 내인성 리간드를 가진 실험이 기술적으로 어려운 경우에 매우 유용합니다. 이 방법은 민감하고 개별 수용체에 특정, 작동하기 쉽고 재현 할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 독인 시라 칼론이 될 것입니다. 전날, 100, 000 BW5147 셀의 10 밀리리터가 있는 10개의 플레이트를 플레이트하고 RPMI를 보충합니다. 그런 다음 튜브에 pcDNA3 플라스미드의 100 마이크로그램을 놓습니다.관에 pH 5.3에서 아세테이트 나트륨을 추가합니다. 그 후, 플라스미드 혼합물에 100%에탄올의 2.5부량을 추가한다. 그런 다음 밤새 플라스미드 혼합물을 영하 20도에서 배양합니다.BW 세포를 도금한 후 24시간 후, 2개의 50 밀리리터 튜브에서 세포를 수집합니다. 그런 다음 515 g의 세포를 5분간 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. 펠로톤 RPMI를 추가하지 않고 다시 중단하고 원심분리를 반복합니다.추가없이 RPMI의 1 밀리리터에서 결과 펠릿을 다시 중단합니다. 재매달된 펠릿을 얼음 위에 4센티미터 커벳으로 옮기습니다. 에탄올 강수량을 겪은 플라스미드원심분리.그런 다음 플라스미드를 70%에탄올 1밀리리터로 씻습니다. 그리고 또 다른 20 분 동안 원심 분리를 반복합니다. 에탄올을 모두 제거하고 펠릿이 부분적으로 건조되도록 합니다.그런 다음 추가없이 예열 된 RPMI의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 이 후, 커벳의 세포에 다시 중단 된 플라스미드를 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 세포를 배양.다음으로, 세포를 전기화합니다. 그런 다음 전기 소세포를 50 밀리리터 튜브로 이송합니다. 515g에서 5분간 튜브와 원심분리기에 50밀리리터의 완전한 매체를 추가합니다.상체를 버리고 완전한 배지의 50 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 세포를 24웰 배양 접시에 넣고 48시간 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 전체 매체의 1 밀리 리터를 추가, 보충 10 각 잘 G418의 밀리 리터 당 밀리 그램.48 시간 후, 각 우물의 상부 량의 1 밀리리터를 폐기하십시오. 그런 다음 G418의 밀리리터 당 5 밀리그램으로 보충된 완전한 중간 크기의 밀리리터 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 원하는 표적을 가진 50, 000의 전감염된 BW 세포를 96웰 플레이트의 단일 우물에서 사용하십시오.접시를 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 접시를 영하 20도에서 동결합니다. 항 마우스 IL-2 항체로 ELISA 플레이트를 코팅합니다.각 우물에 PBS의 50 마이크로 리터의 부피에, 안티 마우스 IL-2의 05 마이크로 그램을 배치합니다. 코팅 된 접시를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 이전에 표적으로 배양되었던 냉동 BW 세포를 해동하기 위하여, 섭씨 37도에서 잠깐 잠복기를 사용합니다.그런 다음 플레이트원심분리하고, 상퍼의 100 마이크로리터를 각 웰에서 미리 코팅된 ELISA 플레이트로 옮기다. 그리고 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 이 후 ELISA 플레이트에 비오틴 항 마우스 IL-2를 추가합니다.그런 다음 인큐베이션 및 세척 후 HRP 공액 스트렙타비딘을 접시에 추가합니다. 인큐베이션 및 세척 후, ELISA 플레이트의 각 웰에 TMB 기판 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로 650 나노 미터에서 ELISA 플레이트를 읽으십시오.이 예에서, CLL 세포는 상이한 반대로 CD20 항체로 사전 배양되었다. 그리고 ELISA와 분석되기 전에 Fc 수용체 CD16을 발현하는 전감염된 BW 세포와 공동 배양하였다. ELISA를 분석한 후 결과는 정량화되었다.광학 밀도 수준은 표준 곡선을 기반으로 마우스 IL-2 농도로 변환되었다. 추가 실험에서, 항 CD20 항체의 다른 복용량은 CLL 세포로 사전 배양되었다. 그리고 그 때 전감염된 BW 세포로 배양하였다.파티클에는 네 개의 주요 부품이 포함되어 있습니다. 복제, BW 세포의 트랜스퍼링, 활성화 및 ELISA. 각 부품은 독립적으로 확인해야 합니다.이 절차에 따라 NK 세포수용체와의 상호 작용을 연구하기 위해 NK 세포와 산을 죽이는 것과 같은 내인성 수용체를 발현하는 세포로 추가 실험을 수행할 수 있습니다. 우리는 NK 세포 수용체의 새로운 리간드를 발견하기 위해이 시스템을 사용했다. 예를 들어, 헤마글루티닌은 NKp46의 리간드이며, PVL은 TG의 리간드이다.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

(과일 파리) Drosophila의 침략을 유학

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

연구

생물학

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

장거리 DNA의 상호 작용을 확인을위한 관련 염색체 트랩

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...