Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Forfatterne takker Esther Singer for redigering. Denne studien ble støttet av den europeiske forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) / ERC Grant avtalen antall 320473-BacNK. Ytterligere støtte ble gitt av jeg-kjernen i planlegging og budsjettering komité og Israel Science Foundation og jeg-kjernen på Chromatin og RNA i Gene regulering, GIF grunnlaget, Lewis Family Foundation, ICRF professorat tilskuddet, den Helmholtz Israel grant og Rosetrees tillit (alle ved O.M.). Denne studien ble også støttet av Israel Science Foundation (grant 502/15) Kass medisinsk forskning prisen og et forskningsstipend fra Israel Society for hematologi og transfusjon medisin (til S.E). O.M er krone professor molekylær immunologi.

1. generasjon av en plasmider som uttrykker Chimeric konstruere
Merk: Målet er å generere en plasmider som uttrykker den ekstracellulære domenet av reseptoren rundt del transmembrane og intracellulær domener av musen CD3ζ kjeden (figur 2A).
<ol><li>Hente en rekke ekstracellulære domenet til reseptoren inkludert signal peptid. Få DNA stoff som forventes å uttrykke denne reseptoren (f.eks cDNA eller en plasmider).</li>
	<li>DNA stoff som uttrykker den transmembrane og intracellulær domener av musen CD3ζ kjeden (f.eks., cDNA eller en plasmider).</li>
	<li>Utforme en rekke fusion protein basert på den generelle strukturen vist i figur 2A. Kontroller at hele sekvensen i samme codon lesing rammen. Denne sekvensen brukes til å utforme riktig primer og bekrefte det endelige produktet.</li>
	<li>Utforme to PCR reaksjoner å forsterke hver av fragmenter av fusion proteiner separat (figur 2B, 2 C)10. Merk: De spesifikke vilkårene for PCR reaksjoner (f.eks., forlengelse tid og avspenning temperatur) avhenge primerne, som er utviklet for en bestemt reseptor.<ol>
<li>Forsterke ekstracellulære segmentet av reseptoren.<ol>
<li>Utforme en 5'-primer som inkluderer signal peptid reseptoren, en Kozak konsensus sekvens, og en passende begrensning (figur 2B).</li>
			<li>Utforme en 3-primer som flankene begge deler av fusion protein (figur 2B). For eksempel for første design kan dette 3 primer inneholde de 20 siste base parene ekstracellulære segmentet av reseptoren og første 9 base parene av CD3ζ segmentet. Merk: Det er ikke nødvendig å legge til en begrensning område 3 primer siden dette primer brukes til å generere smeltet sekvensen, og brukes ikke til hemorroider.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Forsterke CD3ζ segmentet.<ol>
<li>Utforme en 5'-primer som flankene begge deler av fusion protein (figur 2C). For eksempel for første design kan 5' primer inkludere siste 9 base parene av ekstracellulære segmentet av reseptoren og 20 første base parene av CD3ζ segmentet. Merk: Det er ikke nødvendig å legge til en begrensning område 5' primer siden dette primer brukes til å generere smeltet sekvensen, og brukes ikke til hemorroider.</li>
			<li>Utforme en 3-primer som inkluderer slutten av CD3ζ sekvensen som et passende begrensning område (figur 2C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Riktig primer sekvenser i hver av disse to reaksjoner slik at annealing temperaturen ligner hvert par (Merk at primer, som inkluderer sekvenser av de to delene av fusion protein, bare anneals med en del av sekvensen i hver reaksjon).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utføre en ekstra PCR som en blanding av PCR produkter av de to første reaksjonene brukes som malen DNA med 5' primer på ekstracellulære reseptor segmentet (trinn 1.4.1.1) og de 3' av CD3ζ segmentet (trinn 1.4.2.2) (figur 2D)10 . Denne reaksjonen skal generere siste smeltet sekvensen.</li>
	<li>Fortsette som vanlig for kloning.<ol>
<li>Ligate PCR sluttproduktet målet kuttet vektor (målet vektoren er vanligvis pcDNA3 som uttrykker G418 og ampicillin).</li>
		<li>Forvandle kompetent bakterier11ligated vektoren.<ol>
<li>Tine 50 µL av kompetente bakterier på is.</li>
			<li>Legge til ligated vektoren bakterier og ruge på is 20 min.</li>
			<li>Ruge på 42 ° C i 45 s.</li>
			<li>Legge til 200 µL av LB uten antibiotika.</li>
			<li>Inkuber 1t på 37 ° C med kontinuerlig risting.</li>
			<li>Frø på en LB plate med aktuelle antibiotika (f.eks, ampicillin løsning med en siste konsentrasjon av 0,1 mg/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Samle og vokse flere bakteriell koloniene i 5 mL av LB (i 15 mL rør).</li>
		<li>Neste dag, ekstra plasmider med en mini prep kit.</li>
		<li>Analysere genet innsatsen med begrensning enzymer.</li>
		<li>Sekvens relevante koloniene, og kontroller at sekvensen og lese rammen er riktig (som angitt i trinn 1.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forvandle den bekreftet plasmider kompetent bakterier11.<ol>
<li>Tine 20 µL av kompetente bakterier på is.</li>
		<li>Legge til 1 µL av plasmider bakterier og ruge på is 20 min.</li>
		<li>Ruge på 42 ° C i 45 s.</li>
		<li>Legge til 200 µL av LB uten antibiotika.</li>
		<li>Inkuber 1t på 37 ° C med kontinuerlig risting.</li>
		<li>Frø på en bakterievekst plate med aktuelle antibiotika (f.eks, ampicillin løsning med en siste konsentrasjon av 0,1 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neste dag, vokse en bakterie kolonien i en stor LB container med 0,1 mg/mL ampicillin (~ 250 mL).</li>
	<li>Neste dag, utføre maxi prep i henhold til bestemte instruksjonene av kit. Merk: Fremgangsmåten for electroporation, et stort antall plasmider er nødvendig, som beskrevet nedenfor.</li>
</ol>2. hva av plasmider som uttrykker Chimeric Protein i BW celler
Merk: Metoder kan også benyttes for hva (f.eks., av lentiviral infeksjon). Før electroporation, utføre etanol nedbør av DNA som beskrevet nedenfor. De neste trinnene krever sterile forhold.
<ol><li>Dagen før forberede BW5147 celler ("BW celler") electroporation. Plate 10 plater (10 cm) med 10 mL 100.000 BW5147 celler/mL (dvs., totalt 10 x 106 celler) med RPMI med 10% fosterets kalv serum (FCS), 1% natrium pyruvate, 1% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% penicillin-streptomycin ("komplett medium").</li>
	<li>Plasser 100 µg av pcDNA3 plasmider som uttrykker fusion proteinet i en 1,5-2 mL tube og legge 3 M natrium acetate ved pH 5.3-5.5 til. Volumet av natrium acetate skal tilsvare 0,1 (10%) av volumet av 100 µg plasmider, sjarmere pH i natrium acetate med en pH-meter ved å legge NaOH eller HCl.</li>
	<li>Legge til 2,5 mengder 100% etanol blanding av plasmider og natrium acetate som beskrevet i trinn 2.2 (2,5 ganger det totale volumet av plasmider og natrium acetate). Ruge over natten ved 20 ° C eller 2t på 70 ° C.</li>
	<li>2.4. 24 timer etter BW cellene har vært belagt, samle alle BW celler (~ 100 mL) i 2 50 mL rør. Sentrifuge celler for 5 min på 515 x g og kast nedbryting.</li>
	<li>Nytt avbryte pellet fra begge rør 25 mL av RPMI - i en enkelt 50 mL tube. For eksempel å suspendere pellet av en tube med 25 mL av RPMI - og deretter bruke denne væsken re suspendere væsken i andre 50 mL røret slik at den totale pellet fra BW cellene er nytt suspendert i 25 mL av medium i en enkelt rør. Merk: Mediet skal være uten tillegg, siden serum kan forstyrre electroporation.</li>
	<li>Sentrifuge celler igjen for 5 min på 515 x g. Nytt suspendere pellet i 1 mL av RPMI, og overføre innholdet til 0,4 cm søppel på is.</li>
	<li>Sentrifuge plasmider som gjennomgikk etanol nedbør (trinn 2.3) for 30 min på 16.000 x g og 4 ° C.</li>
	<li>Vask en gang med 1 mL av 70% etanol og sentrifuge for en annen 20 min på 16.000 x g og 4 ° C (å vaske ut).</li>
	<li>Fjern alle etanol og la pellet tørke litt (dvs. i en åpen rør i vev kultur panseret). Nytt utsette pellets med 100 µL RPMI-tidligere oppvarmet til 60 ° C.</li>
	<li>Legg til nytt suspendert plasmider (trinn 2.8) til cellene i cuvette og ruge i 5 min på is.</li>
	<li>Electroporate cellene på 0,23 kV, 250 capacitation. Dette bør ta ~ 4 ms.</li>
	<li>Overføre electroporated cellene til en 50 mL tube, legge til 50 mL av komplett medium og sentrifuge for 5 min på 515 x g.
</li>
	<li>Forkast nedbryting og å suspendere cellene med 50 mL av komplett medium.</li>
	<li>Plate electroporated cellene i 24-brønnen retter (1 mL per brønn, for totalt ~ 50) og ruge på 37 ° C og 5% CO2 48 h.</li>
	<li>Merk cellene som skal transfekterte med antibiotika. Etter 48 timer legge 1 mL av komplett medium med 10 mg/mL G418 i hver brønn (på dette stadiet er det siste bindet i hver vel 2 mL og endelige konsentrasjonen av G418 i hver vel er 5 mg/mL). Merk: Hvis plasmider inneholder en annen antibiotikaresistens, bestemme antibiotika konsentrasjon kreves for å drepe untransfected BW cellene før dette trinnet.</li>
	<li>Hver 48 h, nøye forkaste 1 mL av øvre volumet av hver brønn uten stirring mediet i brønnen (BW cellene pleier å være på bunnen av brønnen). Legge fullstendig middels med 5 mg/mL G418 i hver brønn, slik at det siste bindet i hver brønn er igjen 2 mL.</li>
	<li>Undersøke kultur platene for cellevekst i alle brønnene regelmessig. Merk: En endring i fargen på medium til gul kan bidra til å identifisere voksende celler. men i begynnelsen mediet vil være gul på grunn av G418 selv. Identifisere positive brønner (wells med økende celler). Disse er G418 motstandsdyktig og derfor forventes å uttrykke fusion protein. Denne prosessen tar vanligvis ~ 3 uker.</li>
</ol>3. verifikasjon av uttrykk for transfekterte reseptoren i celler i positiv brønnene.
<ol><li>Flekk transfekterte BW cellene med et spesifikt antistoff mot reseptoren som var transfekterte.</li>
	<li>Sammenligne hvilket uttrykk reseptoren av flowcytometri til uttrykk for kontroll cellene (untransfected BW celler).</li>
	<li>Etter ett eller flere brønner bruke celler umiddelbart for eksperimentelle formål, vokse i kultur eller fryse for framtidige applikasjoner.</li>
	<li>Kontroller uttrykk for transfekterte reseptoren før du utfører et nytt eksperiment. Etter noen uker med vekst, cellene med G418 med en stabil reseptor uttrykk, utelates G418 fra kultur medium.</li>
</ol>4. inkubasjon transfekterte BW cellene med mål
Merk: Når du bruker transfekterte BW cellene for første gang, er det best å teste dem på mål som uttrykker en kjent ligand av reseptoren av interesse eller på plate-bundet antistoffer spesifikt rettet mot reseptoren av interesse (cross-linking eksperimenter; se nedenfor, § 4.2.1.3).
<ol><li>Helst delt BW cellene 24 timer før eksperimentet (for eksempel ved å legge 10 mL av komplett medium til 2 mL av celler i kultur i en ny 10 cm kultur plate).</li>
	<li>Inkuber transfekterte BW cellene med sine mål. Utføre eksperimentet samtidig på kontroll BW celler som uttrykker en tom vektor (eller foreldre BW celler). 96F plater er å foretrekke (men 96U plater kan også brukes). Utføre eksperimentet i tre eksemplarer. Avbryte alle cellene i fullstendig medium.<ol>
<li>Forberede mål. Typen mål varierer som en funksjon av målet, og kan være celler, celler som har vært pre inkubert med antistoffer eller antistoffer alene. Dette systemet har også blitt brukt med bakterier som mål5.<ol>
<li>Hvis mål er å dele celler (dvs. cellelinjer), irradiate dem på 6000 rad før analysen. Sted 50.000 av målcellene i en enkelt godt av en 96 plate (i et volum på 100 µL).</li>
			<li>For eksperimenter med antistoffer og BW celler som uttrykker menneskelige FcγRs, ruge målcellene med et antistoff på is i en 96 godt plate (for eksempel, 50 µL av målcellene og 50 µL av antistoffer, ulike antistoff doser kan testes).</li>
			<li>Hvis bruker antistoffer alene som mål (cross-linking eksperimenter), bør de være plate-bundet. For dette formålet første ruge antistoffer i en komplett medium en 96F plate for 1-2 h på 37 ° C og 5% CO2 (typisk startwebadressen dose er 0,5 μg av et spesifikt antistoff i 50 μL). Vaske platen for å fjerne ubundet antistoffer. Merk: I dette tilfellet en 96F plate vil aktivere binding av antistoffer mot platen, som etter transfekterte BW cellene fører til aktivering av transfekterte reseptoren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legg BW cellene (Effektor celler). Plass 50.000 BW celler i en enkelt brønn av en 96 plate (i et volum på 100 µL).</li>
		<li>Fullføre volumet i hver brønn til 200 µL om nødvendig.</li>
		<li>Inkuber platene på 37 ° C og 5% CO2 48 h (denne tidsperioden kan kalibreres).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter 48 timer, fryse platene på 20 ° C og tine før ELISA, eller bruke umiddelbart for ELISA (se neste trinn).</li>
</ol>5. ELISA
<ol><li>Coat en ELISA plate med et anti-musen IL-2 antistoff (anti-mIL-2). Plass 0,05 µg mIL-2 i et volum på 50 µL av 1 x PBS per brønn. Inkuber belagt ELISA platen med mIL-2 antistoffer på 4 ° C over natten eller på 37 ° C i 2 timer. Merk: For å utføre ELISA direkte etter inkubasjon trinn, ELISA platen bør være belagt 24 timer før slutten av inkubasjonstiden av BW cellene.</li>
	<li>Forkast væske i ELISA platen og legge til en blokkering løsning (200 µL per brønn) som består av 1 x PBS og 1% bovin serum albumin (BSA). Inkuber ELISA platen i 2 timer ved romtemperatur.</li>
	<li>Vask ELISA platen tre ganger med 0,05% PBS Tween løsning (dvs. 0,5 mL Tween-20 i 1 liter 1 x PBS).</li>
	<li>Ta 96 platen som har BW cellene som ble inkubert med sine mål (4.3). Hvis platen var frosset, helt tine det (f.eks., ved kort inkubasjon på 37 ° C). Sentrifuge 96 platen (5 min, 515 x g) og nøye overføre 100 µL av nedbryting i hver brønn til pre belagt og blokkerte ELISA plate. Merk: Nedbryting skal samles fra sidene av hver brønn for å unngå å ta cellene.</li>
	<li>Eventuelt legge rekombinant mIL-2 med definerte konsentrasjoner til en av de tomme radene av belagt ELISA platen til å generere en standard kurve av mIL-2. For eksempel starte fra en mIL-2 konsentrasjon av 2500 pg/mL og deretter reduseres med 50% i hver påfølgende bra; ikke Legg mIL-2 til siste godt.</li>
	<li>Inkuber ELISA platen på 4 ° C over natten eller på 37 ° C i 2 timer.</li>
	<li>Vask ELISA platen fire ganger med PBS Tween.</li>
	<li>Legge til biotin anti-musen IL-2 ELISA platen. Bruke en konsentrasjon av 1 µg antistoff i 1 mL 1 x PBS med 1% BSA og del i 100 µL per brønn.</li>
	<li>Inkuber ved romtemperatur 1t.</li>
	<li>Vask ELISA platen seks ganger med PBS Tween.</li>
	<li>Legg HRP-konjugert streptavidin. Bruk en konsentrasjon av 1 µL streptavidin i 1 mL av PBSX1 med 1% BSA og dele det i 100 µL per brønn.</li>
	<li>Inkuber ved romtemperatur for 30 min.</li>
	<li>Vask ELISA platen seks ganger med PBS Tween.</li>
	<li>Legg 100 µL per brønn av TMB-substratløsningen. Fullfør dette trinnet raskt for å redusere forskjellene mellom brønnene på grunn av etterslep når TMB.</li>
	<li>Lese ELISA platen med en ELISA plate leser på 650 nm (lesing kan gjentas hvis signalet er svakt).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).</li><li>Bar-On, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKp46+Recognizes+the+Sigma1+Protein+of+Reovirus:+Implications+for+Reovirus-Based+Cancer+Therapy.">NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy.</a> Journal of Virology. 91 (19), (2017).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Function,+and+Molecular+Properties+of+the+Killer+Receptor+Ncr1-Noe.">Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).</li><li>Glatzer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat(+)+innate+lymphoid+cells+acquire+a+proinflammatory+program+upon+engagement+of+the+activating+receptor+NKp44.">RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44.</a> Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activating+receptor+NKp46+is+essential+for+the+development+of+type+1+diabetes.">The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes.</a> Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).</li><li>Markel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+CEACAM1+protein+in+the+inhibition+of+activated+decidual+lymphocyte+functions.">Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions.</a> Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Her presenterer vi en protokoll for å generere en reporter system for å undersøke reseptor-ligand samhandlinger (se en forkortet form av denne protokollen i1). Protokollen består av tre hoveddeler: kloning av en chimeric protein, som inkluderer den ekstracellulære domenet av en bestemt reseptor smeltet intracellulær domenet av CD3ζ, hva av en plasmider som uttrykker fusion protein BW celler (f.eks , av electroporation), og kvantitative mus IL-2 med ELISA. Det endelige produktet av hver av disse delene må bekreftes uavhengig: kloning prosessen må verifiseres av komplett sekvensering av fusion proteinet i målet plasmider, hva BW cellene må bekreftes ved å undersøke uttrykk for den reseptor for BW cellene (f.eksav flowcytometri) og ELISA prosessen må bekreftes ved generelt positiv kontroller (f.eks, rekombinant mIL-2) eller med bestemte kontroller for transfekterte BW cellene; dvs. mål som uttrykker en kjent ligand av reseptoren av interesse (f.eks, celler som uttrykker CD48 kan også brukes som en positiv for BW celler som uttrykker NK celle reseptor 2B4). For eksempel, kloning prosessen kan være vellykket, men fusion protein er uttrykt ikke av BW cellene. I dette tilfellet skal electroporation gjentas. Alternativt, hvis det ikke er noe signal over bakgrunnsnivået av ELISA plate (spesielt for positiv kontrollene) transfekterte BW cellene ikke uttrykke reseptoren (eller uttrykket er brutt) eller et teknisk problem har oppstått i ELISA prosessen.
Flere endringer gjøres til denne protokollen samtidig bevare de generelle prinsippene av prosedyren. Disse endringene inkluderer vektoren å uttrykke fusion protein, metoden for transfecting plasmider BW celler og bestemte parametere knyttet til inkubasjon og ELISA som type mål (f.eks celler, antistoffer, osv.) , antall målcellene eller antistoff konsentrasjonen hvis relevant (vi bruker 50 000 celler per brønn og et antistoff starter dose 0,5 µg/vel), inkubasjon tid (vi bruker en inkubasjon tid 48 h) og supernatant volumet som overføres til ELISA plate.
Denne metoden er sensitiv, bestemt og lett kan kvantifiseres. Det er ideelt for screening for tilstedeværelsen av ligander for spesifikke reseptorer (spesielt hvis ligand selv ikke har blitt anerkjent). Etter å forberede transfekterte BW celler som uttrykker en bestemt reseptor, kan disse cellene frosset og brukes ved behov for ekstra eksperimenter. Vi og andre har brukt dette systemet ble tidligere studier for å utforske reseptor-ligand samhandlinger (for eksempel2,3,5,12,13,14 15,16) og resultatene av dette systemet har blitt bekreftet av andre teknikker. Denne metoden kan også brukes til å studere aktivering av ulike menneskelige FcγR reseptorer av antistoffer, som har blitt gjort for anti-viral antistoffer i serum6,7,8 eller monoklonale antistoffer mot CD20 9.
Siden dette er en reporter system som bare ekstracellulære segmentet av reseptoren uttrykkes, bør resultatene oppnås ved dette systemet suppleres med flere eksperimenter med endogene reseptoren, som cytotoksisitet analyser med naturlig Killer (NK) celler å studere interaksjon med NK celle reseptorer. Videre enkelte ligand/reseptor interaksjoner resulterer ikke i en mIL-2 sekresjon av reporteren systemet, og derfor kan overses. I tillegg i noen eksperimentelle oppsett, skal resultatene bekreftes for ulike parametere som beskrevet ovenfor. Dette er spesielt viktig i tilfeller der en sammenligning av to forhold er nødvendig (f.eksaktivering av samme Fc reseptoren av ulike antistoffer). Det er også viktig å kontrollere at følsomheten til en bestemt ligand-reseptor interaksjon innen lineær systemet. Ellers kan dette føre til metning verdier som kan utelukke en gyldig sammenligning over betingelser. Dette kan oppnås ved hjelp av en standard mIL-2-kurve og generere en dose-respons kurve med testet ligand (ved saturating verdier, eksperimentelle parameterne bør endres. f.eksen mindre mengde nedbryting skal analyseres med ELISA). En annen mulig begrensning av dette systemet er bruken av målcellene med endogene sekret av mIL-2 (f.eksmus T celler) som ville skjule IL-2 utskillelsen av BW celler. For å overvinne disse svært uvanlig forekomster som er begrenset til musen celler, kan reporter systemet forbedres ved hjelp av ulike reporter (f.eksGFP) som ikke er uttrykt ved målcellene.

BW reporter systemet er en teknikk for å studere reseptor-ligand interaksjoner1. Dette systemet er spesielt fordelaktige når ligand en bestemt reseptoren er ukjent eller eksperimenter med endogene ligand teknisk vanskelig. Det kan også brukes for å studere binding av monoklonale antistoffer mot menneskelig FcγRs. Metoden er basert på uttrykke et chimeric protein i musen BW celler. Dette chimeric protein består av ekstracellulære domenet til reseptoren rundt del transmembrane og intracellulær domener av musen ζ kjeden. Binding av aktuelle ligander av reseptoren fører til sekresjon av musen IL-2, som lett kan oppdages ved ELISA, som vist i figur 1. Denne metoden er følsom og gjelder for en enkelt reseptoren, enkel å betjene, og svært reproduserbare. Det kan således utfyller ekstra verktøy for å studere reseptor-ligand interaksjoner. For eksempel, kan den brukes til skjermen flere linjer for tilstedeværelsen av en ligand for en bestemt reseptor (selv om ligand selv ikke er identifisert) eller å oppdage aktivering av menneskelig FcγRs av monoklonale antistoffer eller humant serum inneholder anti-viral antistoffer. Selv om primære immunceller express endogene FcγRs, er de generelt vanskelig å håndtere og vanligvis express flere Fc reseptorer.
Vi har brukt dette systemet med hell i mange av våre studier som karakteriserer reseptor-ligand interaksjoner. Disse inkluderer identifisere haemagglutinin som ligand av NK celle reseptor NKp462, identifisere PVR og nectin-2 som ligander for menneske og mus TIGIT3,4, og viser at fusobacterium nucleatum bakterie binder og aktiverer menneskelige TIGIT5. I tillegg har BW celler som uttrykker Fc reseptorer blitt brukt med hell å oppdage anti-viral antistoffer i pasientenes sera6,7,8. Spesielt etablert vi nylig BW celler som uttrykker menneskelige FcγRs for å oppdage differensial FcR aktivering av anti-CD20 antistoffer brukes for behandling av kronisk lymfatisk leukemi (CLL)9. Viktigst, har resultatene av BW reporter systemet validert komplementære eksperimenter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

Interaksjoner mellom reseptorer og ligander utgjør en grunnleggende biologisk prosess. Imidlertid direkte eksperimenter med celler som uttrykker innfødt reseptoren og ligand er utfordrende siden ligand en bestemt reseptoren kan være ukjent og eksperimentelle prosedyrer med innfødt ligand kan være teknisk komplisert. For å løse disse hindringene, beskriver vi en reporter system for å oppdage bindingen og aktivering av en bestemt reseptor ved en ligand rundt. I denne reporteren system, ekstracellulære domenet til en bestemt reseptor er konjugert til musen CD3ζ og denne chimeric protein uttrykkes deretter musen BW celler. Disse transfekterte BW cellene kan da være inkubert med forskjellige mål (f.eks, celler eller antistoffer). Aktivering av en transfekterte reseptor fører til utskillelsen av musen interleukin-2 (mIL-2) som kan oppdages av enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dette reporter systemet har fordelene av å være følsom og bestemte å en enkelt reseptor. I tillegg aktiveringsnivået for en bestemt reseptor lett kan kvantifiseres og kan brukes selv i tilfeller der ligand av reseptoren er ukjent. Dette systemet er implementert med hell i mange av våre studier som karakteriserer reseptor-ligand interaksjoner. Vi har nylig ansatt dette systemet å studere aktivering av menneskelig Fcγ-reseptorer (FcγRs) av ulike monoklonale anti-CD20 antistoffer i klinisk bruk.

Figur 3 viser resultatet av et eksperiment med BW reporter system. I dette eksperimentet, CLL celler pre inkubert med forskjellige anti-CD20 antistoffer (rituximab og obinutuzumab) og deretter co inkubert med transfekterte BW celler som uttrykker CD16a-CD3ζ. Lignende eksperimenter ble utført i våre studier9. Figur 3A presenterer et bilde av en rå ELISA plate der fargeintensiteten tilsvarer en konsentrasjon av mIL-2. Eksperimentet ble gjennomført i tre eksemplarer. Dette eksperimentet inkludert flere kontroller: CLL celler inkubert med foreldre untransfected BW cellene (øvre rad) og CLL inkubert med BW celler som uttrykker CD16a-CD3ζ men uten et antistoff eller en kontroll antistoff (seks brønner i den andre raden til venstre) . Inkubasjonstiden for BW celler som uttrykt CD16 med CLL celler som var pre inkubert med anti-CD20 antistoffer indusert en betydelig utskillelsen av mIL-2 forhold til mIL-2 nivå av kontroll. Viktigere, aktivert pre-inkubering CLL cellene med anti-CD20 obinutuzumab CD16 sterkere enn rituximab, en kjent finne som ble recapitulated av systemet vårt. Den siste raden viser synkende forhåndsdefinerte konsentrasjoner av rekombinant mIL-2 (uten tillegg av celler). Høyre brønnen i siste har ikke mIL-2 og representerer bakgrunn lesing, som ligner kontroll brønnene. Figur 3B presenterer kvantifisering av resultatene av ELISA platen vises i figur 3A. Optisk densitet (OD) nivåer ble omgjort til mIL-2 konsentrasjoner basert på standardkurven med rekombinant mIL-2. Figur 3 c presenterer en dose svar eksperiment hvor ulike doser av antistoffer var pre inkubert med CLL celler og deretter inkubert med BW celler uttrykke CD16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> Figur 1: skjematisk fremstilling av BW reporter systemet. BW5147 celler er stabilt transfekterte med den ekstracellulære delen av ulike reseptorer del transmembrane og cytoplasmatiske domener av musen CD3ζ kjeden (chimeric recptor-CD3ζ). Aktivering av en bestemt reseptor-CD3ζ av en ligand resulterer i en utskillelsen av mIL-2 som kan oppdages ved ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> Figur 2: chimeric reseptor-CD3ζ og utformingen av PCR primere. (A) generelle strukturen i en ekstracellulære reseptor del transmembrane og intracellulær domener av musen CD3ζ. (B) reseptoren ekstracellulære domenet ble forsterket med en 3-primer som også inkluderte nukleotider i CD3ζ. (C) intracellulær transmembrane domener av CD3ζ ble forsterket med en 5'-primer som også inkluderte reseptor nukleotider. (D) i den endelige PCR reaksjonen, ble begge deler, som har overlappende sekvenser, brukt som malen DNA. I alle figur paneler, er annet protein domener fargekodet og innestengt blå rektanglene (CD3ζ sekvens) og røde rektangler (reseptor sekvensen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> Figur 3: illustrasjon av det endelige produktet av BW reporter. (A, B, C) CLL celler var pre inkubert med eller uten to anti-CD20 antistoffer (rituximab og obinutuzumab) eller en kontroll antistoff. Etterpå ble antistoff-bundet cellene inkubert med foreldrekontroll BW celler eller BW celler som uttrykker CD16a-CD3ζ. Nivået av mIL-2 i nedbryting ble bestemt av ELISA. (A) et bilde av en rå ELISA plate. Fargeintensiteten angir konsentrasjonen av mIL-2 i nedbryting. Eksperimentet ble gjennomført i tre eksemplarer. Den nederste raden viser er ELISA avlesning i å redusere konsentrasjonene av rekombinant mIL-2 som ble analysert i samme plate. (B) kvantifisering av ELISA lesing i (A). MIL-2 nivåer ble beregnet ved hjelp av en standard kurve av mil-2. (C) en dose svar eksperiment hvor ulike doser av antistoffer var pre inkubert med CLL celler og deretter inkubert med BW celler uttrykke CD16a-CD3ζ. , P < 0,001; Student t -test (B) eller VARIANSANALYSE med flere sammenligninger (C). Bare sammenligningen c som ikke var signifikant forskjellig var rituximab og kontroll Ab i første konsentrasjon (0,01 µg/mL). Feilfelt representerer standardavviket for triplicates. Lignende eksperimenter ble gjennomført som del av en av våre siste studie9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter en reporter system som kan brukes til å identifisere og telle reseptor-ligand interaksjoner.

En BW Reporter System for å studere reseptor-Ligand interaksjoner

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.The BW Reporter System gjør det mulig å studere reseptor-ligand interaksjoner. Det er svært nyttig i tilfeller der ligand av en bestemt reseptor er ukjent eller i tilfeller der forsøkene med endogene ligand er teknisk vanskelig. Denne metoden er følsom og spesifikk for en individuell reseptor, enkel å betjene og reproduserbar.Å demonstrere prosedyren vil være Shira Kahlon, en postdoktor for laboratoriet mitt. Dagen før transfection, plate 10 plater med 10 milliliter på 100, 000 BW5147 celler, og supplere en RPMI. Plasser deretter 100 mikrogram pcDNA3 plasmid i et rør.Tilsett natriumacetat ved pH 5.3 i røret. Etter dette legger du til 2,5 volumer på 100% etanol til plasmidblandingen. Deretter inkubere plasmidblandingen over natten ved minus 20 grader Celsius.24 timer etter plating BW cellene, samle cellene i to 50 milliliter rør. Sentrifuger deretter cellene ved 515 g i fem minutter, og kast supernatanten. Resuspend peloton RPMI uten tillegg og gjenta sentrifugering.Resuspend den resulterende pellet i 1 milliliter RPMI uten tillegg. Overfør den gjenbrukte pelleten til en 4 centimeter cuvet på is. Sentrifuge plasmid som gjennomgikk etanol nedbør.Vask deretter plasmid med en milliliter 70% etanol. Og gjenta sentrifugering i ytterligere 20 minutter. Fjern hele etanol, og la pelleten tørke delvis.Deretter resuspend pellet i 100 mikroliter av forvarmet RPMI, uten tillegg. Etter dette legger du til den restavhengige plasmid til cellene i cuvet. Inkuber cellene på is i fem minutter.Deretter elektroporate cellene. Overfør deretter de elektroporerte cellene til et 50 milliliter rør. Tilsett 50 milliliter komplett medium til røret og sentrifuge i fem minutter, ved 515 g.s.Kast det overnaturlige, og gjenbruk cellene i 50 milliliter komplett medium. Deretter plate cellene i 24-brønns kultur retter, og inkubere cellene i 48 timer. Etter dette, legge til en milliliter komplett medium, supplert med 10 milligram per milliliter G418 til hver brønn.48 timer senere, kast en milliliter av det øvre volumet av hver brønn. Deretter legger du til en milliliter komplett medium supplert med fem milligram per milliliter G418 til hver brønn. Bruk 50 000 transfectede BW-celler med sine ønskede mål, i en enkelt brønn av en 96-brønns plate.Inkuber platen i 48 timer. Deretter fryse platen på minus 20 grader Celsius. Coat en ELISA plate med anti-mus IL-2 antistoff.Plasser 05 mikrogram anti-mus IL-2, i et volum på 50 mikroliter PBS i hver brønn. Inkuber den belagte platen over natten ved fire grader Celsius. Bruk en kort inkubasjonsperiode ved 37 grader Celsius, for å tine de frosne BW-cellene, som tidligere ble inkubert med sine mål.Sentrifuger platen, og overfør 100 mikroliter av supernatanten fra hver brønn til den forhåndsbelagte ELISA-platen. Og inkubere ved 37 grader Celsius i to timer. Etter dette legge biotin anti-mus IL-2 til ELISA platen.Deretter etter inkubasjon og vask, tilsett HRP konjugert streptavidin til platen. Etter inkubasjon og vask, tilsett 100 mikroliter av TMB-substratløsningen, til hver brønn av ELISA-platen. Les til slutt ELISA-platen ved 650 nanometer.I dette eksemplet ble KLL-celler forhåndsinkubert med forskjellige anti-CD20-antistoffer. Og deretter co-inkubert med trans infiserte BW celler som uttrykker Fc reseptorer CD16, før de blir analysert med ELISA. Etter analyse med ELISA ble resultatene kvantifisert.De optiske tetthetsnivåene ble omgjort til mus IL-2 konsentrasjoner, basert på standardkurven. I et ekstra eksperiment ble ulike doser av anti-CD20-antistoffer forhåndsinkubert med KLL-celler. Og deretter inkubert med de trans infiserte BW-cellene.Partikkelen inneholder fire hoveddeler. Kloning, transinfeksjon av BW-celler, aktivering og ELISA. Hver av delene skal verifiseres uavhengig.Etter denne prosedyren kan ytterligere eksperimenter utføres med celler som uttrykker endogene reseptorer, for eksempel å drepe syrer med NK-celler for å studere interaksjoner med NK-cellereseptorer. Vi har brukt dette systemet til å oppdage nye ligands av NK celle reseptorer. For eksempel er hemagglutinin en ligand av NKp46, og PVL er en ligand av TG.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Grådighet-basert Ekstracellulær Interaction Screening (AVEXIS) for Scalable Detection of Low-affinitet ekstracellulære Receptor-ligand interaksjoner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

RNA Catalyst som reporter for Screening narkotika mot RNA Redigering i trypanosomer

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfektere celler med en luciferasereportergenet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studerer Protein Quality Control System of<em&gt; D. discoideum</em&gt; Bruke Temperaturstyrt Live-Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...