Name: a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

Авторы благодарят Эстер певица за язык редактирования. Это исследование было поддержано Европейским Советом исследования под седьмой рамочной программы Европейского союза (FP/2007-2013) / соглашение грантов ЕИС номер 320473-BacNK. Дальнейшая поддержка была оказана путем я-CORE программа планирования и составления бюджета Комитета и научного фонда Израиля и я ядро на хроматин и РНК в регулирование гена, Фонд GIF, Льюис Фонд семьи, НЕРС профессора Грант, Гельмгольца Израиль Грант и Rosetrees доверие (все для о.м.). Это исследование было также поддержано Израиля научного фонда (Грант 502/15), Kass медицинских исследований премии и исследовательский грант от Израиля общества гематологии и переливания медицины (чтобы Восточная). А.М – профессор Корона молекулярной иммунологии.

<ol>
	<li>Mandelboim, O., Lankry, D., Gazit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Natural Killer Cell Protocols. , 258-262 (2010).</li><li>Mandelboim, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+haemagglutinins+on+virus-infected+cells+by+NKp46+activates+lysis+by+human+NK+cells.">Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells.</a> Nature. 409 (6823), 1055-1060 (2001).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+TIGIT+with+PVR+and+PVRL2+inhibits+human+NK+cell+cytotoxicity.">The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17858-17863 (2009).</li><li>Stanietsky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+TIGIT+inhibits+NK-cell+cytotoxicity+upon+interaction+with+PVR.">Mouse TIGIT inhibits NK-cell cytotoxicity upon interaction with PVR.</a> European Journal of Immunology. , (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+the+Fap2+protein+of+Fusobacterium+nucleatum+to+human+inhibitory+receptor+TIGIT+protects+tumors+from+immune+cell+attack.">Binding of the Fap2 protein of Fusobacterium nucleatum to human inhibitory receptor TIGIT protects tumors from immune cell attack.</a> Immunity. 42 (2), 344-355 (2015).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fcgamma+receptors.">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcgamma receptors.</a> Journal of Immunoogical Methods. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li><li>Corrales-Aguilar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+individual+patterns+of+virus-immune+IgG+effector+responses+in+humans.">Highly individual patterns of virus-immune IgG effector responses in humans.</a> Medical Microbiology and Immunology. 205 (5), 409-424 (2016).</li><li>Radinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+ebolavirus+long+recovered+survivors+produce+GP-specific+Abs+that+are+of+the+IgG1+subclass+and+preferentially+bind+FcgammaRI.">Sudan ebolavirus long recovered survivors produce GP-specific Abs that are of the IgG1 subclass and preferentially bind FcgammaRI.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6054 (2017).</li><li>Elias, S., Kahlon, S., Kotzur, R., Kaynan, N., Mandelboim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab+activates+FcgammaRI+more+potently+than+other+anti-CD20+antibodies+in+chronic+lymphocytic+leukemia+(CLL).">Obinutuzumab activates FcgammaRI more potently than other anti-CD20 antibodies in chronic lymphocytic leukemia (CLL).</a> Oncoimmunology. 7 (6), e1428158 (2018).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).</li><li>Bar-On, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKp46+Recognizes+the+Sigma1+Protein+of+Reovirus:+Implications+for+Reovirus-Based+Cancer+Therapy.">NKp46 Recognizes the Sigma1 Protein of Reovirus: Implications for Reovirus-Based Cancer Therapy.</a> Journal of Virology. 91 (19), (2017).</li><li>Glasner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+Function,+and+Molecular+Properties+of+the+Killer+Receptor+Ncr1-Noe.">Expression, Function, and Molecular Properties of the Killer Receptor Ncr1-Noe.</a> Journal of Immunology. 195 (8), 3959-3969 (2015).</li><li>Glatzer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RORgammat(+)+innate+lymphoid+cells+acquire+a+proinflammatory+program+upon+engagement+of+the+activating+receptor+NKp44.">RORgammat(+) innate lymphoid cells acquire a proinflammatory program upon engagement of the activating receptor NKp44.</a> Immunity. 38 (6), 1223-1235 (2013).</li><li>Gur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activating+receptor+NKp46+is+essential+for+the+development+of+type+1+diabetes.">The activating receptor NKp46 is essential for the development of type 1 diabetes.</a> Nature Immunology. 11 (2), 121-128 (2010).</li><li>Markel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+role+of+CEACAM1+protein+in+the+inhibition+of+activated+decidual+lymphocyte+functions.">Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions.</a> Journal of Clinical Investigation. 110 (7), 943-953 (2002).</li></ol>

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Здесь мы представляем протокол для генерации репортер системы расследовать рецептор лиганд взаимодействий (сокращенная форма этого протокола в1см). Протокол состоит из трех основных частей: клонирование, химерных белка, который включает внеклеточного домена со специфическими рецепторами сплавили Внутриклеточный домен CD3ζ, transfection плазмида, который выражает синтез белка в BW клеток (например , путем электропорации) и количественного обнаружения мыши IL-2, ELISA. Конечный продукт каждого из этих частей должна быть проверена независимо: процесс клонирования должны проверяться путем полного sequencing синтез белка в целевой плазмида, transfection клетки BW должны быть проверены путем изучения выражение рецептор интерес в BW клетки (например, подачей cytometry) и процесс ELISA должна проверяться общие позитивные элементы управления (например, рекомбинантных mIL-2), а также с конкретными элементами управления для transfected клеток BW; т.е. цели, которые выражают известные лигандов рецепторов интерес (например, клетки, что Экспресс CD48 может использоваться как позитивный элемент управления для BW клетки, которые выражают NK клеток рецепторов 2B4). Например процесс клонирования может быть успешным, но синтез белка не выраженные BW клеток. В этом случае следует повторить электропорации. Кроме того, если нет сигнала выше фонового уровня пластину ELISA (особенно для позитивных элементов управления) transfected клеток BW могут не удалось выразить рецептор (или выражение было потеряно) или техническая проблема может иметь место во время процесс ELISA.
Этот протокол может внести несколько изменения при сохранении общих принципов процедуры. Эти изменения включают в себя вектора используется для выражения синтез белка, метод для transfecting плазмиды клетки BW и конкретных параметров, связанных с инкубации и ELISA как тип целевого объекта (например, клетки, антител и т.д.) , число клеток-мишеней или концентрации антитела, если соответствующие (мы используем 50 000 ячеек на колодец и антитело начальная доза 0,5 мкг/скважины), время инкубации (мы используем время инкубации 48 ч) и супернатанта тома, который передается пластину ELISA.
Этот метод является чувствительным, конкретные и может быть легко количественно. Это идеальное место для проверки на наличие лигандов для конкретных рецепторов (особенно если лиганд, сам не было признано). После подготовки transfected клеток BW, которые выражают со специфическими рецепторами, эти клетки можно замороженные и используется при необходимости для дополнительных экспериментов. Мы и другие использовали эту систему успешно в ходе предыдущих исследований для изучения рецептор лиганд взаимодействий (например2,3,5,12,13,14 ,1516) и результаты, полученные этой системы были проверены другими методами. Этот метод также может использоваться для изучения активации различных человеческих FcγR рецепторов антител, как это было сделано для анти-вирусные антител в сыворотке крови6,,78 или с моноклональными антителами против CD20 9.
Поскольку это репортер системы, в которых выражается только внеклеточного сегмент рецептора, результаты, полученные этой системы должна дополняться дополнительные эксперименты с эндогенных рецепторов, например цитотоксичность анализов с натуральными клеток-киллеров (НК) для изучения взаимодействия с NK клеток рецепторов. Кроме того некоторые взаимодействия лигандов/рецептор не может привести к секреции mIL-2 репортер системой и поэтому может упускаться из виду. Кроме того как и любой экспериментальной установки, результаты должны быть проверены для различных параметров, как описано выше. Это особенно важно в тех случаях, когда сравнение двух условий требуется (например, активации рецептора же ФК различными антителами). Важно также, чтобы убедиться, что чувствительность взаимодействия конкретных лиганд рецептор находится в пределах диапазона линейной системы. В противном случае это может привести к насыщенности значения, которые могут препятствовать правильное сравнение различных условий. Это может быть достигнуто с помощью стандартной кривой mIL-2, а также путем создания кривой доза ответ с протестированных лиганда (в случае насыщения значения, экспериментальные параметры должны быть изменены; например, меньший объем супернатант должны быть проанализированы ELISA). Еще одно возможное ограничение этой системы является использование целевых ячеек с эндогенной секреции mIL-2 (например, клетки мыши T) который бы замаскировать секреции IL-2 BW клеток. Для преодоления этих весьма необычных явлений, которые ограничиваются клетки мыши, этот репортер система может быть усовершенствована с помощью различных репортер (например, GFP), которая выражается не в клетки-мишени.

Репортер система BW — это метод для изучения взаимодействия рецептор лиганд1. Эта система особенно выгодно, когда лигандом со специфическими рецепторами неизвестна или эксперименты с эндогенного лиганда технически сложным. Он может также использоваться для изучения привязки моноклональных антител человека FcγRs. Метод основан на выражая химерных белка в клетках мыши BW. Этот химерных белок состоит из внеклеточного домена рецептора интерес, сливается в трансмембранного и внутриклеточных домены цепи ζ мыши. Связывание соответствующие лигандами рецептора приводит к секреции IL-2 мыши, который может быть легко обнаружен ELISA, как показано на рисунке 1. Этот метод является чувствительным и специфичные для отдельных рецепторов, легко работать и высокую воспроизводимость. Он может таким образом дополнить дополнительные инструменты для изучения взаимодействия рецептор лиганд. Например он может использоваться для экран несколько клеточных линий на наличие лигандом для конкретных рецепторов (даже если лиганд, сам не были определены) или для определения активации человеческого FcγRs моноклональные антитела или сыворотку крови человека содержащих анти-вирусные антител. Хотя основной иммунные клетки Экспресс эндогенного FcγRs, они обычно трудно обрабатывать и обычно выражают несколько Fc рецепторов.
Мы использовали эту систему успешно во многих из наших исследований характеризовать рецептор лиганд взаимодействий. Они включают определение гемагглютинин как лиганд NK клеточных рецепторов NKp462, выявление PVR и nectin-2 как лигандов для человека и мыши TIGIT3,4, и показывает, что nucleatum фузобактерии бактерия связывает и активирует человека TIGIT5. Кроме того BW клетки, которые выражают Fc рецепторов успешно используются для обнаружения Противовирусные антитела в пациентов сера,6,7,,8. В частности мы недавно создали BW клетки, которые выражают человека FcγRs обнаружить дифференциального FcR активации антител анти CD20, используется для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ)9. Важно отметить, что в дополнительных экспериментов были подтверждены результаты системы репортер бо.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuPrep, Plasmid Mini Extraction Kit</td>
			<td>Bioneer</td>
			<td>K-3030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-mouse IL-2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>503804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>De-groot</td>
			<td>60-655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>MBS3458105GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>01-340-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peroxidase streptavidin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Biological industry</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB</td>
			<td>SouthernBiothech</td>
			<td>0410-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bw reporter system for studying receptor-ligand interactions

Взаимодействие между рецепторами и лигандами составляют основной биологический процесс. Однако, прямые эксперименты с клетками, которые выражают родной рецепторов и лигандом являются сложными, поскольку лигандом со специфическими рецепторами могут быть неизвестны и экспериментальных процедур с родной лиганд может быть технически сложным. Чтобы устранить эти препятствия, мы описываем репортер системы для обнаружения привязки и активации со специфическими рецепторами лигандом интерес. В этой системе репортер внеклеточного домена со специфическими рецепторами конъюгированных мыши CD3ζ и этот химерных белок затем выражается в клетки мыши BW. Эти transfected клеток BW можно затем инкубируют с различными целями (например, клетки или антител). Активация transfected рецептора приводит к секреции мыши интерлейкин-2 (mIL-2) которые могут быть обнаружены энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). Эта система репортер имеет преимущества чувствительных и специфические для одной рецепторов. Кроме того уровень активации со специфическими рецепторами легко могут быть количественно и может использоваться даже в тех случаях, когда неизвестно лигандов рецепторов. Эта система была внедрена успешно во многих из наших исследований характеризовать рецептор лиганд взаимодействий. Недавно мы использовали эту систему для изучения активации человеческого Fcγ рецепторы (FcγRs), различные моноклонального анти CD20 антител в клинической практике.

Рисунок 3 показывает результаты эксперимента с системой репортер бо. В этом эксперименте клетки CLL были предварительно инкубировали с различными анти CD20 антител (rituximab и obinutuzumab) и затем совместно инкубировали с transfected клеток BW, которые выражают CD16a-CD3ζ. Подобные эксперименты были проведены в нашем исследовании9. На рисунке 3A представляет изображение сырые плиты ELISA, где интенсивность цвета соответствует концентрации mIL-2. Эксперимент проводился в трех экземплярах. Этот эксперимент включено несколько элементов управления: ЛЛЦ клетки инкубировали с родительской клетки untransfected BW (верхняя строка) и ХЛЛ клетки инкубировали с BW клетки, которые выражают CD16a-CD3ζ, но без антитело или управления антитела (шесть скважин во втором ряду слева) . Инкубация BW ячеек выражена CD16 с ХЛЛ клетки, которые предварительно были инкубировали с антител анти CD20 индуцированной значительный секрецию mIL-2 по сравнению с мил-2 уровень контроля скважин. Главное, предварительной инкубации клеток ЛЛЦ с анти CD20 obinutuzumab активированный CD16 более сильно, чем Ритуксимаб, известный, поиск, который был изъятый в нашей системе. Последняя строка показывает, по убыванию предварительно определенных концентрациях рекомбинантных mIL-2 (без добавления ячеек). Право также в последней строке не мил-2 и представляет собой фон чтения, которая выглядит контроля скважин. Рисунок 3B представляет количественная оценка результатов пластину ELISA, показано на рисунке 3A. Оптическая плотность (OD) уровни были преобразованы в концентрации mIL-2, на основе стандартной кривой с рекомбинантным mIL-2. Рисунок 3 c представляет эксперименте ответ дозы, где различных доз антител были предварительно инкубировали с ХЛЛ клетки и затем инкубируют с клетками BW, выражая CD16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig1.jpg"> Рисунок 1: Схематическое представление о системе репортер BW. BW5147 клетки являются стабильно transfected с внеклеточного часть различных рецепторов, сливается с трансмембранного и цитоплазматических доменов мыши CD3ζ цепи (химерных recptor-CD3ζ). Активация конкретных рецепторов CD3ζ лигандом результаты в секреции mIL-2, которые могут быть обнаружены по ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig2.jpg"> Рисунок 2: структура химерных рецепторов CD3ζ и дизайн праймеров PCR. (A) общая структура рецептора внеклеточного сливается в трансмембранного и внутриклеточных домены мыши CD3ζ. (B внеклеточного домена рецептора был усилен с грунт 3', которая также включала нуклеотидов CD3ζ. (C внутриклеточные и трансмембранных доменов CD3ζ были усилены с праймером 5', которая также включала рецептор нуклеотидов. (D) в окончательной реакции ПЦР обоих сегментов, которые имеют перекрывающиеся последовательности, использовались как шаблона дна. В всех рисунок панели домены различных белков цветом и зажаты в синие прямоугольники (CD3ζ последовательности) и красными прямоугольниками (рецептор последовательности). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58685/58685fig3.jpg"> Рисунок 3: Иллюстрация конечного продукта системы репортер BW. (A, B, C) CLL клетки были предварительно инкубируют с или без двух антител анти CD20 (rituximab и obinutuzumab) или управления антитела. После этого антитела прыгните клетки инкубировали с родительского BW клетки или клетки BW, которые выражают CD16a-CD3ζ. Уровень mIL-2 в надосадке определяется ELISA. (A) изображение сырые плиты ELISA. Интенсивность цвета указывает концентрация mIL-2 в надосадке. Эксперимент проводился в трех экземплярах. Нижней строке показывает ELISA индикация в снижении концентрации рекомбинантных mIL-2, которые были проанализированы в том же пластины. (B) количественная оценка ELISA, чтение показано в (A). MIL-2 уровни были рассчитаны с использованием стандартной кривой mil-2. (C) A доза ответ эксперимент где различных доз антител были предварительно инкубировали с ХЛЛ клетки и затем инкубируют с клетками BW, выражая CD16a-CD3ζ. , P < 0,001; T -критерия Стьюдента (B) или дисперсионный анализ с несколькими сравнения (C). Только сравнение в (C), которая существенно не отличалась был ритуксимаба и управления Ab в первом концентрации (0,01 мкг/мл). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение triplicates. Подобные эксперименты были проведены в рамках одного из наших недавних исследований9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58685/58685fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions at JoVE.com

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Этот протокол описывает, как создать систему репортер, который может использоваться для идентификации и количественной оценки взаимодействия рецептор лиганд.

Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Shalom.The BW Репортер система позволяет изучать рецептор-лиганд взаимодействий. Это чрезвычайно полезно в тех случаях, когда лиганд конкретного рецептора неизвестен или в тех случаях, когда эксперименты с эндогенным лигандом технически сложны. Этот метод чувствителен и специфичен для индивидуального рецептора, прост в эксплуатации и воспроизводится.Демонстрацией процедуры будет Шира Кахлон, постдок для моей лаборатории. За день до трансфекции, пластины 10 пластин с 10 миллилитров 100000 BW5147 клеток, и дополнить RPMI. Затем поместите 100 микрограммов плазмиды PCDNA3 в трубку.Добавьте ацетат натрия при рН 5,3 в трубку. После этого добавьте 2,5 тома 100%этанола в плазмидную смесь. Затем инкубировать плазмидную смесь на ночь при температуре минус 20 градусов по Цельсию.Через 24 часа после покрытия клеток BW, собирать клетки в двух 50 миллилитров труб. Затем центрифуга клетки на 515 г в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Resuspend пелотон RPMI без дополнений и повторить центрифугации.Resuspend в результате гранулы в 1 миллилитр RPMI без дополнений. Перенесите перерасходную гранулу на 4-сантиметровый кювет на льду. Центрифуга плазмида, которая прошла этанол осадков.Затем промойте плазмид одним миллилитром 70%этанола. И повторите центрифугу еще на 20 минут. Удалите весь этанол и дайте грануле частично высохнуть.Затем повторно посовещенные гранулы в 100 микролитров разогретой RPMI, без дополнений. После этого добавьте хлюпенированную плазмиду в клетки в кювете. Инкубировать клетки на льду в течение пяти минут.Далее, электропорат клеток. Затем перенесите электропомерные клетки в 50-миллилитровую трубку. Добавить 50 миллилитров полной среды в трубку и центрифугу в течение пяти минут, при 515 г.Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в 50 миллилитров полной среды. Затем пластины клеток в 24-хорошо культуры блюда, и инкубировать клетки в течение 48 часов. После этого добавьте один миллилитр полной среды, дополненный 10 миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо.48 часов спустя, отбросить один миллилитр верхнего объема каждой хорошо. Затем добавьте один миллилитр полной среды, дополненный пятью миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо. Используйте 50 000 трансфицированных клеток BW с желаемыми целями в одном колодец из пластины из 96 колодец.Инкубировать тарелку в течение 48 часов. Затем заморозить пластину при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Пальто пластины ELISA с анти-мышь IL-2 антитела.Поместите 05 микрограммов антимышки Ил-2 в объеме 50 микролитров PBS в каждую колодец. Инкубировать покрытием пластины на ночь при четырех градусах по Цельсию. Используйте короткий инкубационный период при 37 градусах по Цельсию, чтобы разморозить замороженные клетки BW, которые ранее были инкубированы своими целями.Затем центрифуга пластины, и передать 100 микролитров supernatant от каждого хорошо предварительно покрытием пластины ELISA. И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. После этого добавьте биотин против мыши Ил-2 в пластину ELISA.Затем после инкубации и стирки добавьте к пластине спряженный стрептавидин HRP. После инкубации и мытья добавьте 100 микролитров субстратного раствора TMB к каждой пластине ELISA. Наконец прочитайте пластину ELISA на 650 нанометров.В этом примере клетки CLL были предварительно инкубированы различными антителами против CD20. А затем совместно инкубируется с трансфицированными клетками BW, которые выражают рецепторы Fc CD16, прежде чем анализировать с ELISA. После анализа с ELISA результаты были количественно.Уровни оптической плотности, были преобразованы в концентрации мыши IL-2, на основе стандартной кривой. В дополнительном эксперименте различные дозы антител против CD20 были предварительно инкубированы клетками ХЛЛ. А затем инкубируется с трансфицированными клетками BW.Частица содержит четыре основные части. Клонирование, трансфекция клеток BW, активация и ELISA. Каждая из частей должна быть проверена независимо.После этой процедуры, дополнительные эксперименты могут быть выполнены с клетками, которые выражают эндогенные рецепторы, такие как убийство кислот с нк-клеток для изучения взаимодействия с рецепторами НК-клеток. Мы использовали эту систему, чтобы обнаружить новые лиганды рецепторов НК-клеток. Например, гемагглютинин является лигандом NKp46, а PVL является лигандом TG.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Изучение агрессии у дрозофилы (дрозофил)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Сплит-Убиквитин основе дрожжей Мембрана два-Hybrid (МИФ) Система: Мощный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Связанные хромосомы Ловушка для выявления дальних взаимодействий ДНК

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Обнаружение белковых взаимодействий в завод использованием шлюза Совместимость комплементации флуоресценции Бимолекулярные (BiFC) Системные

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Процедура Скрининг Обработка глюкокортикоидных сигнализации с корреспондентом системе данио рерио Личинка люциферазы

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Изучение белка качества системы управления<em&gt; D. discoideum</em&gt; Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...