Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

وكان هذا العمل أساسا بدعم من "وزارة الزراعة" NIFA أفري 2013-67015-21236، وفي جزء آخر من "وزارة الزراعة" عام 2015 أفري NIFA-67015-23216. هذه الدراسة تدعمها جزئيا تعيين إلى "الزراعية البحوث خدمة البحث مشاركة برنامج" يديره معهد أوك ريدج للعلم والتعليم (أرس) من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين (وزارة الطاقة الأمريكية وزارة الطاقة)، ووزارة الزراعة في الولايات المتحدة. إدارة أوريسي أوك ريدج الجامعات المرتبطة بمقتضى العقد الفلاني لا. دي-AC05-06OR2310.
ونود أن نشكر الدكتور كاي فابيرج لاستنساخ المعدية HP برسف، الدكتورة سوزان بروكمير لمساعدة لها مع الحيوانات المشاركة في التجربة، وسو أوهليندورف للمساعدة في مجال السكرتارية في إعداد المخطوطة.

بروتوكولات الحيوان أقرتها لجنة الاستخدام والمركز الوطني للأمراض الحيوانية (وزارة الزراعة-أرس-نادك) العناية بالحيوان.
1-جمع الدم الخنازير عينات
<ol><li>جمع عينات الدم في أنابيب الجيش الملكي النيبالي. جمع ~2.5 مل أو أكثر إذا كانت أكبر مجموعة أنابيب متوفرة.</li>
</ol>2-تجهي?...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

وشملت الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول التي جعلت من الأمثل الخطوات استنفاد جلوبين المضافة، التي جعلت من الممكن الحصول على نوعية ما يلي من عينات الدم كله. واحدة من أكبر القيود المفروضة على استخدام الدم كله في تسلسل الدراسات هي أرقام عالية من يقرأ في العينة خريطة لجزيئات جلوبين والحد من ...

تسلسل الجيل القادم (خ ع) برز كأداة قوية لتحقيق التغيرات التي تحدث على مستوى الجينوم من الكائنات البيولوجية. إعداد نموذج لأساليب خ ع يمكن أن تختلف تبعاً للكائن الحي، ونوع الأنسجة، والأهم من ذلك الأسئلة الباحثون حريصون على العنوان. وقد تحول العديد من الدراسات إلى خ ع كوسيلة لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الدول مثل الأشخاص الأصحاء والمرضى1،2،،من34. تأخذ تسلسل وضع على أساس جينوم كله ويسمح لباحث الاستيلاء معظم، أن لم يكن كل، المعلومات الجينومية لعلامة الوراثية خاصة في وقت تشير.
العلامات الأكثر شيوعاً للتعبير ولاحظ يتم الكشف رسول (مرناس). الإجراءات الأكثر استخداماً لمكتبات الاستعداد لتسلسل الحمض النووي الريبي هي الأمثل لاسترداد الجزيئات مرناً عن طريق استخدام سلسلة من تنقية والتشظيات ليجيشنز5،6. ومع ذلك، القرار المتعلق بكيفية بروتوكول المراد تنفيذها تعتمد على نوع العينة والأسئلة حول عينة وقال. وفي معظم الحالات يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع؛ حتى الآن، ليس كل جزيئات الحمض النووي الريبي تهم وفي حالات مثل دراسات التعبير مرناً وفرة مفرطة الحمض النووي الريبي الأنواع، مثل الكشف الريباسي (الرنا الريباسي) تحتاج إلى إزالة لزيادة عدد النصوص القابلة للاكتشاف المقترنة مرناس. الأسلوب الأكثر شعبية وتستخدم على نطاق واسع لإزالة جزيئات الرنا الريباسي الوفيرة هو الحد من بوليادينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي النصوص المشار إليها ك نضوب بوليا7. يعمل هذا الأسلوب أيضا لتحليل التعبير مرناً كما أنه لا يؤثر على النصوص مرناً. ومع ذلك، في الدراسات التي تهتم بالكشف غير الترميز أو الفيروسية، استنفاد بوليا كما يزيل هذه الجزيئات.
اختر العديد من الدراسات إلى التركيز على إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي لدراسة أما التعبير مرناً (الترميز) أو فئة معينة من الرنا غير الترميز صغيرة أو كبيرة. على الرغم من أن هناك إجراءات أخرى8 مثلنا التي تسمح لإعداد العينة المزدوجة، إعداد دراسات عديدة المكتبات من عينات منفصلة لدراسات منفصلة عندما تكون متاحة. لدراسة مثل بلدنا، وهذا يتطلب عادة عدة عينات الدم زيادة الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. وكان هدف دراستنا ليتمكن من استخدام الدم كله من الحيوانات للتعرف على والتحديد الكمي لفئات مختلفة من كلا مرناً، وأعرب عن الحمض النووي الريبي غير الترميز بين الصحة الإنجابية الخنزير صحية وشديدة العدوى والالتهاب الرئوي فيروس (إتش بي-برسف) تحدي الخنازير9،10 على الرغم من وجود عينة دم كله واحد فقط (2.5 مل) من كل خنزير. من أجل القيام بذلك، نحن بحاجة إلى تحسين استخراج نموذجية وبروتوكولات إنشاء مكتبة لتوليد البيانات المناسبة للسماح بتحليل كل من مرناً وغير الترميز الحمض النووي الريبي (نكرنا) التعبير11 من عينة واحدة.
هذا ما دفع حاجة إلى بروتوكول يسمح مرناً وغير الترميز تحليل الحمض النووي الريبي لمجموعات القياسية المتوفرة والأساليب لإنشاء مكتبة واستخراج الحمض النووي الريبي كانت موجهة أساسا مرناً واستخدام خطوة استنفاد بولي-أ12. هذه الخطوة أن جعلت من المستحيل لاستعادة الجيش الملكي النيبالي غير الترميز أو النصوص الفيروسية من العينة. ولذلك، هناك حاجة إلى أسلوب أمثل الذي يسمح لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع دون استنفاد نموذج بوليا. وقد تم تحسين الطريقة التي عرضت في هذه المخطوطة للسماح باستخدام الدم كله كنوع عينة وبناء المكتبات التسلسل مرناً ونكرناس من الأحجام الصغيرة والكبيرة على حد سواء. تم تحسين الطريقة للسماح لتحليل جميع الكشف الترميز غير قابلة للكشف، فضلا عن الاحتفاظ بالكشف الفيروسية ل التحقيق بعد13. في كل شيء، يسمح بروتوكول إعداد مكتبة الأمثل لدينا لتحقيق جزيئات الحمض النووي الريبي متعددة من عينة واحدة من دم كله.
وكان الهدف العام وراء استخدام هذا الأسلوب وضع عملية تسمح بجمع كل الترميز غير الجيش الملكي النيبالي ومرناً من عينة واحدة من الدم كله. وهذا يسمح لنا أن يكون مرناً ونكرنا، والجيش الملكي النيبالي الفيروسية لكل الحيوانات في دراستنا المصدر من نموذج واحد9. هذا، في نهاية المطاف، يسمح باكتشاف علمي أكثر دون تكاليف إضافية الحيوان ويعطي صورة أكثر اكتمالا للتعبير عن كل عينة الفردية. وصف الأسلوب يسمح لفحص المنظمين للتعبير الجيني، فضلا عن السماح لإتمام الدراسات الارتباطية مقارنة كلا مرناً وغير الترميز التعبير الجيش الملكي النيبالي باستخدام عينة واحدة من دم كله. دراستنا يستخدم هذا البروتوكول لدراسة التغيرات في التعبير الجيني والمنظمين جينية الممكنة في المصابة فيروسي الخنازير التجارية الذكور 9-الأسبوع القديمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

حلول مبتكرة وقوية على نحو متزايد تقنيات التسلسل الجيل القادم وقد فتحت آفاقاً جديدة في القدرة على دراسة التعبير الجيني الأساسية المتصلة بالعمليات البيولوجية للفائدة. ليس فقط تسمح هذه الابتكارات الباحثين مراعاة التعبير من تسلسل مرناً أن التعليمات البرمجية للجينات أن الدالة effect الخلوية، ولكن أيضا جزيئات الحمض النووي الريبي (نكرنا) غير الترميز التي تظل غير مترجمة، ولكن لا تزال لديها مهام تنظيمية. على الرغم من أن الباحثين لديها القدرة على مراقبة التعبير مرناً ونكرنا، قد جرت العادة لدراسة التركيز على واحدة أو أخرى. ومع ذلك، عند الدراسات المهتمة بالتعبير مرناً ونكرنا، مرات عديدة يستخدمونها عينات منفصلة دراسة الترميز أو غير الترميز الكشف بسبب الاختلاف في الاستعدادات مكتبة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الحاجة إلى مزيد من العينات التي يمكن أن تزيد من الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه قد يسبب الباحثين أن تقرر إعداد العينات لتحليل واحد فقط، وعادة ما تكون مرناً، مما يحد من عدد الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تحقق. ومع ذلك، تمتد نكرناس فئات متعددة مع الأدوار التنظيمية التعبير مرناً أثر ذلك. لأن نكرنا الهامة للعمليات البيولوجية الأساسية واضطراب في هذه العمليات في أثناء الإصابة، يجوز، ولذلك تقدم أهدافا جذابة للمداواة. يوضح هذه المخطوطة بروتوكول معدل لتوليد مرناً والحمض النووي الريبي غير الترميز التعبير المكتبات، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي الفيروسية، من عينة واحدة من الدم كله. الأمثل لهذا البروتوكول، تحسين نقاء الحمض النووي الريبي وزيادة ربط لانتعاش الكشف ميثليته وأغفلت حجم التحديد، للسماح بالتقاط أكثر الأنواع الجيش الملكي النيبالي.

هي عينات ممثلة في دراستنا جلوبين وعينات الدم كله المنضب ريبو. نتائج تمثيلية للبروتوكول يتكون من نموذج مكتبة المنضب جلوبين مع عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) أعلاه 7 (الشكل 1) و 260/280 nm نسب تركيز أو أعلى 2 (الشكل 1ب وج 1). تم ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة الترميز (مرناً) وانخفاض غير الترميز جلوبين (نكرنا) مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي من عينة واحدة من دم كله.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة التفاعلات المضيفة المسببة للأمراض من خلال السماح بفحص التعبير RNA الترميز وغير الترميز الفيروسية المشاركة في الاستجابة الأمينية المضيفة وكذلك كيف يمكن لمسبب الأمراض أن يؤثر على الوظائف البيولوجية للمضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة مرنا وRNA غير الترميز من مكتبات RNAseq RNAAseq خفض الجلوبيين من عينة دم كاملة واحدة. إثبات هذه التقنية ستكون سارة أندرسون، فني من مختبري.ابدأ بالطرد المركزي لأنابيب الدم عند 50 20 مرة من G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، بعد إزالة ناظر، إضافة ثمانية ملليلتر من المياه الخالية من RNase إلى بيليه. إغلاق الأنابيب ودوامة بيليه حتى يتم حل واضح، ثم الطرد المركزي الأنابيب في 50 20 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لاسترداد بيليه.العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، والتخلص من عظمى وحفظ بيليه. لعزل الجيش الملكي النيبالي الكلي، تبدأ pipetting 300 microliters من عازلة ملزمة تحلل إلى بيليه. بعد دوامة، ونقل الخليط من كل أنبوب إلى جديد المسمى 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي.إضافة 30 ميكروليتر من المضافة المتجانسة من مجموعة العزل ميرنا. دوامة الأنابيب ومكان على الجليد لمدة 10 دقائق. العمل في غطاء الدخان، وإزالة الأنابيب من الجليد وإضافة 300 ميكرولترات من كاشف الكلوروفورم الفينول الحمضية من عدة ودوامة مرة أخرى لخلط.بعد الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة بعناية مرحلة مائي إلى أنبوب جديد. بناء على كمية الانتعاش مائي من الخطوة السابقة، إضافة 1.25 مرات حجم 100٪ الإيثانول إلى phage مائي في كل أنبوب وماصة لخلط. قم بإعداد أنابيب جمع جديدة تحتوي على خرطوشة فلتر لكل عينة.ما يقرب من 675 ميكرولترات من خليط lysate الإيثانول على خرطوشة مرشح. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة في 10،000 مرات G لتمرير السائل من خلال مرشح. تجاهل التدفق من خلال.كرر خليط lysate-الإيثانول إضافة إلى مرشح والطرد المركزي حتى تم استخدامه بالكامل. أضف 700 ميكروليتر من محلول الغسيل واحد من المجموعة إلى خرطوشة التصفية. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لسحب الحل من خلال المرشحات.تجاهل التدفق من خلال والحفاظ على نفس خراطيش التصفية وأنابيب الجمع. أضف 500 ميكرولترات من محلول الغسيل 2-3 لكل خرطوشة تصفية. بعد الطرد المركزي مرة أخرى، تجاهل تدفق من خلال وتكرار خطوة الغسيل.لإزالة أي سائل متبقي من خراطيش التصفية، قم ب تدويرها 60 ثانية إضافية. قم بنقل الخراطيش إلى أنابيب تجميع جديدة. أضف 100 ميكروليتر من 95 درجة مئوية من المياه الخالية من النوى إلى مركز كل خرطوشة مرشح.أجهزة الطرد المركزي خراطيش لمدة 20 إلى 30 ثانية تقريبا في جهاز الطرد المركزي الطاولة في السرعة القصوى. لتشجين ما قبل مع oligos الحد من الجلوبيين، وتشويه الأول الجيش الملكي النيبالي عن طريق إضافة كل عينة المستخرجة في أنبوب تفاعل 0.2 milliliter رقيقة الجدران النوكلاز خالية من النيوكلاز. ضع الأنابيب في دورة حرارية عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين.بعد ذلك، ضع على الفور الأنابيب على الجليد للحصول على نوعية الحمض النووي الريبي الأمثل. في حين أن الأنابيب هي التبريد، وإعداد 400 ميكرولترات من 10X غلوبين الحد من أوليجو مزيج و10X oligo التهجين العازلة في أنبوب ملليلتر اثنين. لجعل مزيج التهجين، إضافة ستة ميكروغرام من عينة RNA، واثنين من ميكرولترات من 10X الغلوبين الحد من oligo مزيج، واحد ميكرولتر من 10X oligo العازلة التهجين، والنوى المياه الحرة إلى حجم النهائي من 10 ميكرولترات لكل 0.2 ملليلتر رقيقة الجدران، نوكلاسي خالية من أنبوب التفاعل.ضع الأنابيب في دورة حرارية عند درجة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، ضع الأنابيب على الجليد على الفور. لأداء عملية الهضم RNase H، قم أولاً بتخفيف 10X RNase H إلى X RNase H مع واحد X RNase H buffer.إعداد RNase H مزيج التفاعل من خلال الجمع بين اثنين من microliters من 10X RNase العازلة، واحد ميكرولتر من مثبط RNase، واثنين من ميكرولترات واحدة من RNase H، وخمسة ميكرولترات من المياه الخالية من النيات إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولترات. إضافة 10 ميكرولترات من مزيج RNase H رد فعل إلى عينات التهجين الحد من الجلوبيين ومزيج دقيق. استوعب رد الفعل هذا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم يبرد إلى أربع درجات مئوية.وقف الهضم عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من 0.5 EDTA المول إلى الأنبوب، ونقل المحتوى بأكمله من الأنبوب إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. مباشرة بعد ذلك، إضافة 80 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase، 350 ميكرولترات من العازلة تحلل، ثم 250 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى كل أنبوب وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. نقل كل عينة ميكرولتر 700 إلى خرطوشة تصفية elution منفصلة وضعت في أنبوب جمع مليلتر لجمع تدفق من خلال.جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 مرة G أو أكبر ومن ثم تجاهل تدفق من خلال. ضع خراطيش تصفية elution نفسها في أنابيب جمع ميليلتر جديدة. لغسل أغشية خرطوشة المرشح، أضف 500 ميكرولترات من مخزن الغسيل الخفيف إلى خراطيش الترشيح والطرد المركزي لمدة 15 ثانية عند 8000 مرة من G أو أكثر.تجاهل التدفق من خلال. ثم، باستخدام نفس أنابيب جمع، إضافة 500 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول لخراطيش تصفية. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 8،000 مرة G وأكبر.تجاهل كل من تدفق من خلال وجمع أنابيب، وحفظ أعمدة تدور elution. ضع كل عمود دوران elution في أنبوب جمع مليلتر جديد. جهاز طرد مركزي في سرعة كاملة لمدة خمس دقائق مع غطاء مفتوح على خراطيش تصفية لتجفيف أغشية العمود تدور ومنع نقل الإيثانول.بعد التخلص من أنابيب التجميع، ضع كل خرطوشة تصفية مجففة في أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 14 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى مركز غشاء خرطوشة التصفية. ل elute الجيش الملكي النيبالي، الطرد المركزي الأنابيب لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة ومن ثم الاستمرار في مزيد من تقييم الحمض النووي الريبي وإعداد.ويمكن الآن تقسيم العينة المنضب الجلوبيين واستخدامها لإعداد مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة وغير الترميزية وكذلك مكتبة الحمض النووي الريبي المنضب ومكتبات الحمض النووي الريبي الطويلة وغير الترميزية. بعد إعداد مكتبات التعبير من عينات الدم الكاملة المنضبة من الجلوبيين والمنضبة ريبو باستخدام هذا البروتوكول، أظهر ملخص تشغيل ملف electrophoresis عينة مكتبة مستنفدة بالغلوبين بأرقام تكامل RNA التي تراوحت من 6.3 إلى 9.2. وقد ثبت أن هذا التحسن كان تحسنا بالمقارنة مع الدراسات الأخرى التي استخدمت أساليب استنفاد الغلوبين ولم تتمكن إلا من تحقيق أرقام RIN عند أو قرب ستة.أظهر ما قبل الغلوبين- تخفيض ما بعد الجلوبيين لعينة دم كاملة واحدة بورسين أن 260 إلى 280 نسب تركيز نانومتر هي في أو أكثر اثنين. وباستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على كهربية ذات رقائق من عينات مكتبة مرنا الدم الكاملة المنضبة بالغلوبين والربو قبل التجميع والتسلسل. بالنسبة لمكتبات مرنا، يكون المخطط الكهربائي التمثيلي ذروة في حوالي 280 زوجاً من اللغات الأساسية.بالنسبة لـ ncRNAs الممثل كهربية ذات أساس رقاقة صغيرة تحتوي على مجموعة من القمم من حوالي 100 إلى 400 زوج قاعدة. 22 - وتتطابق القمم عند 143 زوجاً من أزواج القاعدة تقريباً مع الـ miRNAs، وتبلغ الذروة حوالي 153 زوجاً من أزواج الأساسات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أنابيب الثلج على الفور حيث لوحظ.وفي أعقاب هذا الإجراء، ينبغي تنفيذ طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير التفاضلي، والتغيرات اللاجينية، وتأثيرها على المسارات والعمليات البيولوجية. لا ننسى أن العمل مع مُكشف الفينول-كلوروفورم خطير للغاية وينبغي اتخاذ احتياطات مثل العمل في غطاء الدخان. أيضا، عند التعامل مع الدم الكامل أو الكائنات المعدية، ينبغي أن يتم تنفيذ العمل في خزانة السلامة البيولوجية قبل تنشيط الكائن المعدي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

تعداد خلايا الدم البيضاء الكبرى الطرفية بالسكان الدم للمحاكمات متعددة المراكز السريرية باستخدام الدم الكامل الفحص Phenotyping

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

تحليل خلية واحدة من إيمونوفينوتيبي وإنتاج سيتوكين في الدم كله الطرفية عبر الخلوي الشامل

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...