Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
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这项工作主要得到了美国农业部 nifa afri 2013-67015-21236 的支持, 部分得到了美国农业部 nifa afri 2015-66015-23216 的支持。这项研究得到了美国能源部 (美国能源部) 之间机构间协议任命的由橡树岭科学和教育研究所 (orise) 管理的农业研究服务研究参与方案的部分支持。美国能源部) 和美国农业部。orise 由橡树 ridge 相关大学根据指定经营实体合同号管理。de-ac05-6or2310。
我们要感谢 kay faaberg 博士的 hp-prrs 感染克隆, susan Brockmeier 博士为参与实验的动物提供了帮助, sue ohlendorf 博士为编写手稿提供了秘书协助。

动物规程得到了国家动物疾病中心 (usda-ars-nadc) 动物护理和使用委员会的批准。
1. 猪血样本收集
<ol><li>将血液样本收集到 rna 管中。收集约2.5 毫升或更多, 如果有较大的收集管可用。</li>
</ol>2. 猪血样的加工
<ol><li>在室温 (15-25) 下, 以 5, 020 x克离心血液管10分钟。如果在离心前在室温下处理冷冻样品孵育管至少2小时。</li>
	<li>去除上清液,...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. 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(11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

该协议中优化的第一个关键步骤包括增加的球蛋白耗尽步骤, 这使得从全血样本中获得高质量的读数成为可能。在测序研究中使用全血的最大限制之一是样本中的大量读数, 这些读数将映射到全球分子, 并减少可映射到其他感兴趣的分子的读数.因此, 在优化样本类型的协议时, 我们需要加入一个全局损耗步骤, 以确保通过测序实现尽可能高的 mrna 和非编码 rna 捕获。根据 choi等</em...

下一代测序 (ngs) 已成为研究生物有机体基因组水平变化的有力工具。ngs 方法的样品制备可以根据生物体、组织类型以及更重要的是研究人员渴望解决的问题而有所不同。许多研究转向 ngs 作为研究健康和患病个体 1、2、3、4等国家之间基因表达差异的一种手段。测序是在整个基因组的基础上进行的, 研究人员可以在某个时间点捕获特定遗传标记的大部分 (如果不是全部的话) 基因组信息。
观察到的最常见的表达标记是信使 rna (mrna)。rna-seq 准备库的最常用的过程是通过使用一系列纯化、碎裂和结扎5、6 来优化 mrna 分子恢复的。但是, 有关如何执行协议的决定在很大程度上取决于样本类型和对所述示例提出的问题。在大多数情况下, 总 rna 被提取;然而, 并不是所有的 rRNA 分子都有兴趣, 在 mrna 表达研究等情况下, 过度丰富的 rRNA 物种, 如核糖体 rRNA (rrna) 需要删除, 以增加可检测的转录与 mrna 相关的数量。去除丰富的 rrna 分子最流行和最广泛使用的方法是减少被称为多 a 消耗7的多腺苷酸 rRNA转录。这种方法很好地用于 mrna 表达的分析, 因为它不影响 mrna 转录。然而, 在对非编码或病毒 rna 感兴趣的研究中, 多 a 消耗也会去除这些分子。
许多研究选择专注于 rna 序列库的准备, 以检查 mrna 表达 (编码) 或特定类别的小或大的非编码 rna。虽然还有其他程序8像我们这样的程序, 允许双重样品制备, 许多研究准备图书馆从单独的样本为单独的研究, 如果可用。对于我们这样的研究, 这通常需要多个血液样本来增加时间、消耗品和动物压力。我们的研究目标是能够使用动物的全血来识别和量化健康和高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒 (hp-prrsv) 之间表达的不同类别的 mrna 和非编码 rna挑战猪9,10 尽管只有一个全血样本 (2.5 毫升) 从每头猪。为了做到这一点, 我们需要优化典型的提取和库创建协议, 以生成适当的数据, 以便从单个样本中分析 mrna 和非编码 rna (ncrna) 表达 11.
这就需要制定一项协议, 允许 mrna 和非编码 rna 分析, 因为用于 rna 提取和库创建的现有标准试剂盒和方法主要用于 mrna, 并使用多 a 消耗步骤12。这一步将使其无法从样本中恢复非编码 rna 或病毒转录。因此, 需要一种优化的方法, 允许在不消耗样品多 a 消耗的情况下提取总 rna。本手稿中介绍的方法经过了优化, 允许将全血作为样本类型使用, 并为大小的 mrna 和 ncrna 建立测序库。该方法经过优化, 可以分析所有可检测到的非编码 rna, 并保留病毒 rna 供以后调查13。总之, 我们优化的库制备协议允许从一个完整的血液样本中调查多个 rna 分子。
使用这种方法的总体目标是开发一个过程, 允许从一个全血样本中收集非编码 rna 和 mrna。这使我们能够对我们研究中的每一种动物拥有来自单个样本9的 mrna、ncrna 和病毒 rna。这最终可以在不增加动物成本的情况下进行更多的科学发现, 并更完整地反映每个样本的表达。所述方法允许检查基因表达的调节剂, 并允许完成使用单个全血样本比较 mrna 和非编码 rna 表达的相关研究。我们的研究使用这个协议来研究基因表达的变化和可能的表观遗传调节剂在病毒感染的9周大的雄性商业猪。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

创新且日益强大的下一代测序技术的出现为研究与所感兴趣的生物过程相关的潜在基因表达的能力开辟了新的途径。这些创新不仅使研究人员能够从编码影响细胞功能的基因的 mrna 序列中观察表达, 而且还可以观察到仍未翻译但仍具有调控功能的非编码 rna (ncRNA) 分子。尽管研究人员有能力观察 mrna 和 ncrna 的表达, 但研究的习惯是关注其中的一种。然而, 当研究对 mrna 和 ncrna 表达感兴趣时, 由于图书馆准备工作的差异, 很多时候它们使用单独的样本来检查编码或非编码 rna。这可能会导致需要更多的样品, 这可能会增加时间、消耗品和动物压力。此外, 它可能会导致研究人员决定只为一种分析准备样本, 通常是 mrna, 从而限制可以调查的生物问题的数量。然而, ncrna 跨越多个类, 具有影响 mrna 表达的调节作用。由于 ncrna 对基本的生物过程和感染过程中的紊乱很重要, 因此, 它们可能会成为有吸引力的治疗目标。这份手稿演示了一个改进的协议, 用于从一个完整的血液样本生成 mrna 和非编码 rna 表达库, 包括病毒 rna。优化该协议, 提高 rna 纯度, 增加结扎恢复甲基化 rna, 并省略大小选择, 以允许捕获更多的 rna 物种。

我们研究中的代表性样本是球蛋白和核子耗尽的全血样本。该协议的代表性结果包括一个全球枯竭的库样本, 其 rna 完整性数 (rin) 高于 7 (图 1a) 和26-280 纳米浓度比率在2或以上 (图 1b 和 1c)。样品结果的验证是使用分光光度计进行的, 以给出每个文库和基于芯片的电泳的最终浓度, 给出 rin 数以及一个峰值?...

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Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

在这里, 我们提出了一个协议优化的处理编码 (mrna) 和非编码 (ncrna) 全球减少 rna-seq 库从一个单一的全血样本。

猪全血表达编码和非编码 rna 类的鉴定

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

这种方法可以通过检查宿主氨基反应中涉及的编码、非编码和病毒RNA表达以及病原体如何影响宿主的生物功能，帮助回答宿主-病原体相互作用研究中的关键问题。该技术的主要优点是，它提出了一个协议，从一个单一的全血样本中，从球蛋白减少的RNAseq库中对mRNA和非编码RNA进行处理。展示这项技术的将是莎拉·安德森，一个来自我实验室的技术员。首先在50 20倍G下离心，在室温下离心10分钟。在生物安全柜中工作，在去除上经剂后，在颗粒中加入8毫升无RNase水。关闭管子，旋转颗粒，直到其明显溶解，然后在室温下以50 20倍G离心管10分钟，以回收颗粒。在生物安全柜中工作，丢弃上一液并保存颗粒。要分离总RNA，首先将300微升的开液结合缓冲液移液到颗粒中。涡旋后，将混合物从每个管转移到新的标签1.5毫升离心管。从 miRNA 隔离试剂盒中加入 30 微升的均质添加剂。旋转管子，放在冰上10分钟。在烟气罩中工作，从冰上取出管子，从试剂盒中加入300微升的酸酚氯仿试剂，并再次将涡流混合。在室温下以10，000次G离心5分钟后，小心地将水相取出到新管中。根据上一步水回收量，将100%乙醇的体积添加到每个管和移液器中的水法植物中，加入1.25倍。准备每个样品包含滤芯的新鲜收集管。将 675 微升的利沙酸乙醇混合物移液到滤芯上。以10，000倍G的短暂离心机将液体通过过滤器。丢弃流式。重复将糖酸乙醇混合物添加到过滤器中并离心，直到完全使用。将 700 微升的清洗液从套件添加到滤芯中。短暂离心，将溶液拉过过滤器。丢弃流式处理并保留相同的滤芯和收集管。在每个滤芯中添加 500 微升的洗涤液 2-3。再次离心后，丢弃流经并重复洗涤步骤。要清除滤芯中残留的液体，请再旋转 60 秒。将墨盒转移到新鲜的收集管中。在每个滤芯的中心加入 100 微升 95 摄氏度的预热无核酸水。以最高速度在桌面离心机上将墨盒离心约 20 到 30 秒。要预成型杂交与球蛋白减少寡糖，首先通过添加每个提取的样品到0.2毫升薄壁无核酸酶反应管RNA变性RNA。将管子放在 70 摄氏度的热循环器中两分钟。之后，立即将管子放在冰上，以获得最佳的RNA质量。当管子冷却时，在两毫升管中准备 400 微升 10X 球蛋白还原寡糖混合物和 10X 寡糖杂交缓冲液。要进行杂交混合，加入6微克RNA样品，2微升10X糖蛋白还原寡糖混合物，一微升10X寡糖杂交缓冲液，将无核酸酶水最终体积10微升，以每0.2毫升薄壁、无核酸酶反应管。将管子在 70 摄氏度的热循环器中放置两分钟。之后，立即将管子放在冰上。要执行 RNase H 消化，请先将 10X RNase H 稀释为一个 X RNase H，并带一个 X RNase H 缓冲液。通过将两个10X RNase缓冲液的微升、一个RNase抑制剂的微升和一个X RNase H的两个微升和5个无核酸酶水的微升组合到总体积为10微升，准备RNase H反应混合物。将 RNase H 反应混合物加入 10 微升，加入球蛋白还原杂交样品并彻底混合。消化这种反应在37摄氏度10分钟，然后冷却到4摄氏度。通过将一个0.5摩尔EDTA微升到管中，停止消化，将管内的全部内容转移到一个新鲜的1.5毫升管中。紧接着，添加80微升无RNase水，350微升的解液缓冲液，然后250微升的100%乙醇到每个管，通过移液混合。将每个 700 微升样品转移到单独的洗脱滤芯中，放入两毫升收集管中，以收集流经。在 8，000 倍 G 或更高时离心 15 秒，然后丢弃流经。将相同的洗脱滤芯放入新的两毫升收集管中。要清洗滤芯膜，请将 500 微升的轻度洗涤缓冲液添加到滤芯中，并在 8000 倍 G 或更高电量下离心 15 秒。丢弃流式。然后，使用相同的收集管，在滤芯中加入500微升80%乙醇。在8000倍及更高时离心两分钟。丢弃流管和收集管，并保存洗脱旋转列。将每个洗脱旋转柱放入新的两毫升收集管中。全速离心五分钟，用滤芯上的打开盖干燥旋转柱膜，防止乙醇结转。丢弃收集管后，将每个干燥的滤芯放入一个新鲜的 1.5 毫升收集管中。将 14 微升无 RNase 水直接添加到滤芯膜的中心。为了使RNA得到分离，请全速离心管60秒，然后继续进行RNA评估和制备。球蛋白贫乏的样品现在可以分离，用于制备小型非编码RNA库以及核素贫乏mRNA和长期非编码RNA库。在使用本协议制备了球蛋白贫化和核素耗尽全血样本的表达库后，电泳文件运行摘要显示，一个具有 RNA 完整性编号为 6.3 到 9.2 的球蛋白贫乏库样本。与其他使用球蛋白耗竭方法且只能达到RIN数达到6位或接近6位的研究相比，这一发现是一个改进。单个猪全血样本的减血前和球蛋白后减少表明，260至280纳米浓度比在或超过2。利用本协议，在汇集和测序之前，获得了球蛋白和核素耗尽全血mRNA库样品的基于芯片的电谱图。对于 mRNA 库，代表性电图在大约 280 个基对时具有峰值。对于小型 ncRNA，基于芯片的电图包含大约 100 到 400 个基对的一系列峰值。大约 143 个基对的峰值对应于 miRNA，在大约 153 个基对的峰值对应于 piRNA。在尝试此过程时，重要的是要记住冰管立即注意到。按照这个程序，其他方法，如下一代测序，应执行，以回答其他问题，如差异表达，表观遗传变化，以及他们对生物通路和过程的影响。不要忘记，使用苯酚氯仿试剂是极其危险的，应采取预防措施，如在烟罩工作。此外，在处理全血或传染性生物体时，应在活化传染性生物体之前在生物安全柜中进行工作。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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一个1.5小时的程序，鉴定肠球菌直接从血培养的物种

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科研

免疫与感染

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

枚举主要外周血白细胞人口多中心临床试验，使用全血表型分析

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

革兰从血培养液使用MALDI-TOF质谱阴性细菌快速鉴定

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Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

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Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

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一种新型<em&gt;在体外</em&gt;模型研究人类全血细胞间的相互作用

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

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核衣壳退火介导电泳（NAME）分析允许HIV-1核衣壳抑制剂的快速鉴定

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

人全血中NK细胞杀伤活性的流式细胞仪分析

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Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

从全血人单核细胞来源的树突状细胞的生成

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葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

大鼠外周全血细胞免疫表型和因子生成的单细胞分析

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...