Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Dette arbejde var primært støttet af den af USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og dels af USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne undersøgelse var delvist understøttet af en aftale i landbruget forskning Service forskning deltagelse programmet administreres af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse (ORISE) gennem en tværinstitutionelle aftale mellem os Department of Energy ( DOE) og US Department of Agriculture. ORISE er forvaltes af Oak Ridge associeret universiteter under DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smitsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier for hendes hjælp dyrene involveret i eksperimentet og Sue Ohlendorf for sekretærservice bistand under forberedelse af manuskriptet.

Animalske protokoller blev godkendt af National Animal sygdom Center (USDA-ARS-NADC) dyrs pleje og brug udvalget.
1. samling af svin blod prøver
<ol><li>Indsamle blodprøver i RNA rør. Indsamle ~2.5 mL eller mere, hvis større indsamling rør er tilgængelige.</li>
</ol>2. behandling af svin blod prøver
<ol><li>Der centrifugeres blod rør på 5,020 x g i 10 min. ved stuetemperatur (15-25 ° C). Hvis behandlingen frosne prøver Inkuber rør ved stuetemper...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Det første vigtige skridt i den protokol, der gjorde det optimeret inkluderet ekstra globin udtynding trin, som gjorde det muligt at få kvalitet læsninger fra hele blodprøver. En af de største begrænsninger på ved hjælp af fuldblod i sekventering undersøgelser er det høje antal læsninger i stikprøven, vil knytte til globin molekyler og reducere de læser, der kan knyttes til andre molekyler af interesse18. Derfor, i optimering af protokollen for vores prøvetype, vi havde brug at indar...

Næste generation sequencing (NGS) fremstod som et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af de ændringer, der opstår på genomisk niveau af biologiske organismer. Prøveforberedelse til NGS metoder kan varieres afhængigt af organismen, vævstype, og endnu vigtigere spørgsmål forskerne er ivrige efter at adresse. Mange undersøgelser har vist at NGS som et middel til at studere forskellene i genekspression mellem stater som raske og syge personer1,2,3,4. Sekventering tage sted på grundlag af samlede genom og giver mulighed for en forsker at fange mest, hvis ikke alle genomisk oplysninger for en bestemt genetiske markør på et tidspunkt punkt.
De mest almindelige markører ytringsfriheden observeret er messenger RNA'er (mRNAs). De mest anvendte procedurer for prepping biblioteker for RNA-seq er optimeret til genopretning af mRNA molekyler ved hjælp af en række purifications, opdelinger og ligations5,6. Dog beslutningen om hvordan en protokol er der skal udføres er stærkt afhængig af prøvetypen og spørgsmålene om nævnte stikprøve. I de fleste tilfælde er total RNA ekstraheret; men ikke alle RNA molekyler er af interesse og i sager som mRNA udtryk undersøgelser alt for rigelige RNA arter, som ribosomale RNA'er (rRNA) skal fjernes for at øge antallet af påviselige udskrifter tilknyttet mRNAs. De mest populære og udbredte metode til at fjerne de rigelige rRNA molekyler er reduktion af polyadenylated RNA udskrifter omtales som polyA udtømning7. Denne metode fungerer godt for analysen af mRNA udtryk da det ikke påvirker mRNA udskrifter. I undersøgelser, der er interesseret i ikke-kodende eller viral RNA'er, fjerner polyA udtynding også disse molekyler.
Mange undersøgelser vælger at fokusere på RNA sekvens bibliotek forberedelse at undersøge enten mRNA udtryk (kodning) eller en bestemt klasse af små eller store ikke-kodende RNA. Selv om der er andre procedurer8 som vores, der giver mulighed for den dobbelte prøveforberedelse, forberede mange undersøgelser biblioteker fra separate prøver på separate undersøgelser når det er tilgængeligt. For en undersøgelse som vores, ville dette normalt kræve flere blodprøver stigende tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Målet med vores undersøgelse var at bruge fuldblod fra dyr til at identificere og kvantificere de forskellige klasser af både mRNA og ikke-kodende RNA udtrykt mellem sund og højpatogen porcint reproduktions- og luftvejssyndrom virus (HP-PRRSV) udfordret svin9,10 trods kun en enkelt fuldblod prøve (2,5 mL) fra hvert svin. For at gøre dette, vi havde brug at optimere de typiske udvinding og bibliotek oprettelsen protokoller til at generere de relevante data til analyse af både mRNA og ikke-kodende RNA (ncRNA) udtryk11 fra en enkelt prøve.
Det fik brug for en protokol, der er tilladt for mRNA og ikke-kodende RNA analyse, fordi de tilgængelige standard kits og metoder til oprettelse af RNA-udvinding og bibliotek var hovedsageligt tiltænkt mRNA og bruge en poly-en udtynding trin12. Dette trin ville have gjort det umuligt at gendanne ikke-kodende RNA eller viral udskrifter fra prøven. Derfor, en optimeret metode var nødvendig at tilladt for total RNA udvinding uden prøve polyA udtynding. Metoden fremlægges i dette håndskrift er blevet optimeret til at tillade brugen af fuldblod som en prøvetypen og opbygge sekventering biblioteker for både mRNA og klarlægning af små og store størrelser. Metoden er blevet optimeret for at give mulighed for analyse af alle påviselige ikke-kodende RNA'er samt bevare viral RNA'er til senere undersøgelse13. I alt vores optimeret bibliotek forberedelse protokol giver mulighed for undersøgelse af flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede mål bag brugen af denne metode var at udvikle en proces, der er tilladt for samling af både ikke-kodende RNA og mRNA fra én prøve med fuldblod. Dette tillader os at have mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vores undersøgelse, stammer fra en enkelt prøve9. Dette, i sidste ende giver mulighed for mere videnskabelig opdagelse uden yderligere omkostninger til dyr og giver en mere komplet billede af udtryk for hver enkelt prøve. Den beskrevne metode giver mulighed for undersøgelse af regulatorer af genekspression samt giver mulighed for færdiggørelsen af korrelationsmaalinger undersøgelser sammenligning begge mRNA og ikke-kodende RNA udtryk ved hjælp af en enkelt hele blodprøve. Vores undersøgelse anvendes denne protokol til at undersøge ændringerne i genekspression og mulige epigenetiske lovgivere i viralt inficerede 9 - uger gamle mandlige kommercielle svin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Fremkomsten af innovative og stadig mere magtfulde næste generation sequencing teknikker har åbnet nye veje ind i mulighed for at undersøge de underliggende genekspression relateret til biologiske processer af interesse. Disse innovationer ikke kun give forskere at observere udtryk fra mRNA sekvenser, som kode for gener at virkning cellefunktion, men også de ikke-kodende RNA (ncRNA) molekyler, der forbliver utranslaterede, men stadig have myndighedsopgaver. Selv om forskerne har evnen til at observere både mRNA og ncRNA udtryk, har det været sædvane for en undersøgelse for at fokusere på ene eller den anden. Men når undersøgelser er interesseret i både mRNA og ncRNA udtryk, mange gange de bruger separate prøver for at undersøge enten kodning eller ikke-kodende RNA'er på grund af forskellen i biblioteket præparater. Dette kan føre til behovet for flere prøver, som kan øge tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Derudover kan det forårsage forskere til at beslutte at forberede prøverne for kun én analyse, normalt mRNA, begrænse antallet af biologiske spørgsmål, der kan undersøges. Dog span klarlægning flere klasser med regulerende roller at virkning mRNA udtryk. Fordi ncRNA er vigtige for grundlæggende biologiske processer og forstyrrelse af disse processer i under infektion, kan de derfor foretage attraktive mål for therapeutics. Dette håndskrift, viser en modificeret protokol for generation mRNA og ikke-kodende RNA udtryk biblioteker, herunder viral RNA, fra en enkelt prøve af fuldblod. Optimering af denne protokol, forbedret RNA renhed, øget ligatur for inddrivelse af methylerede RNA'er og udeladt størrelse udvælgelse, for at tillade fangst af flere arter, RNA.

De repræsentative prøver i vores undersøgelse er globin og ribo-forarmet hele blodprøver. Repræsentative resultatet af protokollen består af en globin forarmet bibliotek prøve med en RNA integritet tal (RIN) over 7 (figur 1en) og 260/280 nm koncentration nøgletal på eller over 2 (figur 1b og 1 c). Validering af prøven resultatet blev udført ved hjælp af spektrofotometret for at give d...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Her præsenterer vi en protokol optimeret til behandling af kodning (mRNA) og ikke-kodende (ncRNA) globin reduceret RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.

Identifikation af kodning og ikke-kodende RNA klasser udtrykt i svin fuldblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i studiet af værtspatogeninteraktioner ved at tillade undersøgelse af det kodnings-, ikke-kodnings- og virale RNA-udtryk, der er involveret i værtsaminoens respons, samt hvordan et patogen kan påvirke værtens biologiske funktioner. Den største fordel ved denne teknik er, at den præsenterer en protokol, der er optimeret til behandling af mRNA og ikke-kodende RNA fra globin-reducerede RNAseq-biblioteker fra en enkelt fuldblodsprøve. At demonstrere teknikken vil være Sarah Anderson, en tekniker fra mit laboratorium.Start med at centrifugere blodrørene ved 50 20 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur. Arbejde i en biologisk sikkerhed kabinet, efter fjernelse af supernatant, tilsæt otte milliliter RNase-fri vand til pellet. Luk rørene og vortex pellet, indtil det er synligt opløst, derefter centrifuge rørene ved 50 20 gange G i 10 minutter ved stuetemperatur for at inddrive pellet.Arbejde i en biologisk sikkerhed kabinet, kassere supernatant og gemme pellet. For at isolere det samlede RNA skal du starte med at pipettere 300 mikroliter lysisbindingsbuffer til pellet. Efter vortexing overføres blandingen fra hvert rør til et nyt mærket 1,5 milliliter centrifugerør.Der tilsættes 30 mikroliter homogent additiv fra miRNA-isolationssættet. Vortex rørene og sted på isen i 10 minutter. Arbejde i en røghætte, fjerne rørene fra is og tilsæt 300 mikroliter af syre phenol chloroform reagens fra sættet og vortex igen at blande.Efter centrifugering ved 10,000 gange G i fem minutter ved stuetemperatur, fjernes vandig fase forsigtigt til et nyt rør. Baseret på mængden af vandige opsving fra det foregående trin, tilsættes 1,25 gange mængden af 100% ethanol til den vandige i hvert rør og pipette til at blande. Forbered nye opsamlingsrør med en filterpatron til hver prøve.Pipetter ca. 675 mikroliter af lysatethanolblandingen på filterpatronen. Centrifuge kort ved 10,000 gange G for at passere væske gennem filteret. Kassér gennemstrømningen.Lysatet-ethanolblandingen tilsættes filteret og centrifugering, indtil den er helt anvendt. Tilføj 700 mikroliter vaskeopløsning en fra sættet til filterpatronen. Centrifuge kort for at trække opløsningen gennem filtrene.Kassér gennemstrømningen, og opbevar de samme filterpatroner og opsamlingsrør. Tilføj 500 mikroliter vaskeopløsning to-tre til hver filterpatron. Efter centrifugering igen skal gennemstrømningen kasseres, og vasketrinnet gentages.Hvis du vil fjerne eventuel resterende væske fra filterpatronerne, skal du dreje dem i yderligere 60 sekunder. Overfør patronerne til nye opsamlingsrør. Tilføj 100 mikroliter på 95 grader Celsius forvarmet nukleasefrit vand til midten af hver filterpatron.Centrifuge patronerne i ca. 20 til 30 sekunder ved bordpladen centrifuge ved maksimal hastighed. At præforme hybridisering med globin reduktion oligos, første protese RNA ved at tilføje hver ekstraheret prøve i en 0,2 milliliter tyndvægget nukleos-fri reaktion rør. Placer rørene i en termisk cycler ved 70 grader Celsius i to minutter.Derefter skal rørene straks anbringes på is for at opnå optimal RNA-kvalitet. Mens rørene er køling, forberede 400 mikroliter af 10X globin reduktion oligo mix og 10X oligo hybridisering buffer i en to milliliter rør. For at gøre hybridisering mix, tilføje seks mikrogram RNA prøve, to mikroliter af 10X globin reduktion oligo mix, en microliter af 10X oligo hybridisering buffer, og nuklease frit vand til et endeligt volumen på 10 mikroliter til hver 0,2 milliliter tyndvæggede, nuklease-fri reaktion rør.Placer rørene i den termiske cycler ved 70 grader Celsius i to minutter. Derefter skal rørene straks anbringes på is. For at udføre RNase H fordøjelse, først fortyndes 10X RNase H til en X RNase H med en X RNase H buffer.Nease H-reaktionsblandingen klargøring ved at kombinere to mikroliter 10X RNase-buffer, en mikroliter RNase-hæmmer og to mikroliter på en X RNase H og fem mikroliter nukleasefrit vand til et samlet volumen på 10 mikroliter. Der tilsættes 10 mikroliter af RNase H-reaktionsblandingen til globinreduktionshybribiliseringsprøverne, og bland grundigt. Fordøje denne reaktion ved 37 grader Celsius i 10 minutter og derefter afkøles til fire grader Celsius.Stop fordøjelsen ved at tilføje en mikroliter på 0,5 molar EDTA til røret, og overføre hele indholdet af røret til en frisk 1,5 milliliter rør. Umiddelbart efter, at tilsættes 80 mikroliter RNase-fri vand, 350 mikroliter af lysis buffer, derefter 250 mikroliter af 100% ethanol til hvert rør og bland godt ved pipettering. Overfør hver 700 mikroliterprøve til en separat elution filterpatron placeret i to milliliteropsamlingsrør for at indsamle gennemstrømningen.Centrifuge i 15 sekunder ved 8,000 gange G eller derover og derefter kassere flow-through. Anbevis de samme elution filterpatroner i nye to milliliter opsamlingsrør. For at vaske filterpatronmembranerne skal der tilsættes 500 mikroliter af den milde vaskebuffer til filterpatronerne og centrifuge i 15 sekunder ved 8.000 gange G eller derover.Kassér gennemstrømningen. Derefter, ved hjælp af samme indsamling rør, tilføje 500 mikroliter af 80% ethanol til filterpatroner. Centrifuge i to minutter ved 8,000 gange G og derover.Kassér både gennemstrømnings- og opsamlingsrørene, og gem elution-spin-søjlerne. Placer hver elution spin kolonne i en ny to milliliter indsamling rør. Centrifuge ved fuld hastighed i fem minutter med det åbne låg på filterpatroner til at tørre spin kolonnemembraner og forhindre ethanol fremfør.Når opsamlingsrørene er kasseret, anbringes hver tørret filterpatron i et friskt opsamlingsrør på 1,5 milliliter. Der tilsættes 14 mikroliter RNase-frit vand direkte til midten af filterpatronens membran. For at elutere RNA'et centrifuger rørene i 60 sekunder ved fuld hastighed og fortsættes derefter med yderligere RNA-vurdering og -forberedelse.Den globin-forarmet prøve kan nu opdeles og bruges til at forberede de små, ikke-kodende RNA biblioteker samt ribo-forarmet mRNA og lange, ikke-kodning RNA biblioteker. Efter at have forberedt udtryksbiblioteker af de globin-forarmede og ribo-forarmede fuldblodsprøver ved hjælp af denne protokol viste elektroforesefilkørselsoversigten en globin-forarmet biblioteksprøve med RNA-integritetsnumre, der varierede fra 6,3 til 9,2. Dette viste sig at være en forbedring i forhold til andre undersøgelser, der anvendte globin udtyndingsmetoder og kun var i stand til at opnå RIN-tal ved eller i nærheden af seks.Pre-globin-reduktion og post-globin-reduktion af en enkelt svineblodprøve viste, at 260 til 280 nanometerkoncentrationsforhold er på eller over to. Ved hjælp af denne protokol blev der opnået chipbaserede elektroferogrammer af globin- og ribo-forarmet prøver fra hele50-biblioteket før pooling og sekvensering. For mRNA-bibliotekerne har det repræsentative elektroferogram et højdepunkt på ca. 280 basispar.For de små ncRNAs repræsentative chip-baserede elektrofærogram indeholder en række toppe fra ca. 100 til 400 basepar. Toppe på ca. 143 basispar svarer til miRNAs, og toppe ved ca. 153 basispar svarer til piRNAs. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at isrør straks hvor bemærket.Efter denne procedure bør der udføres andre metoder såsom næste generations sekvensering for at besvare yderligere spørgsmål såsom differentialudtryk, epigenetiske ændringer og deres indvirkning på biologiske veje og processer. Glem ikke, at arbejde med phenol-chloroform reagens er yderst farligt, og forholdsregler såsom at arbejde i en røghætte bør træffes. Når der håndteres fuldblod eller infektiøse organismer, bør arbejdet også udføres i et biologisk sikkerhedsskab forud for aktivering af den infektiøse organisme.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Optælling af Major perifert blod leukocytpopulationer for multicenter kliniske undersøgelser med en Whole Blood fænotypebestemmelse Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model for at studere samspillet mellem humant fuldblod og Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold Tillader hurtig identifikation af HIV-1 nucleocapsid inhibitorer

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Enkelt-celle analyse af Immunophenotype og cytokin produktion i perifere blod via masse flowcytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...