Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Dit werk werd vooral ondersteund door de door USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, en gedeeltelijk door NIFA AFRI 2015-67015-23216 van de USDA. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een afspraak aan de landbouw onderzoek onderzoek deelname serviceprogramma beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs (ORISE) door een interdepartementale overeenkomst tussen de ons Department of Energy ( DOE) en het Amerikaanse ministerie van landbouw. ORISE wordt beheerd door Oak Ridge Associated Universities DOE arbeidsovereenkomst niet. DE-AC05-06OR2310.
We zouden graag bedanken Dr Kay Faaberg voor de besmettelijke klonen van HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier voor haar hulp bij dieren die betrokken zijn bij het experiment, en Sue Ohlendorf voor secretariële assistentie ter voorbereiding van het manuscript.

Dierlijke protocollen werden goedgekeurd door het National dier ziekte Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care en gebruik Comité.
1. verzameling van varkens bloed monsters
<ol><li>Bloedmonsters in RNA buizen verzamelen. Verzamelen ~2.5 mL of meer als grotere collectie buizen beschikbaar zijn.</li>
</ol>2. verwerking van varkens bloed monsters
<ol><li>Centrifugeer de buisjes bloed bij 5,020 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C). Als de verwe...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

De eerste kritieke stap in het protocol dat het geoptimaliseerd maakte opgenomen de toegevoegde globine uitputting stappen, waardoor het mogelijk is om kwaliteit leest van volbloed monsters. Een van de grootste beperkingen op het gebruik van volbloed in sequencing studies zijn het hoge aantal leest in de steekproef die zal toewijzen aan globine moleculen en verminderen de leest die naar andere moleculen van belang18 verwijzen kunnen. Daarom, in het optimaliseren van het protocol voor onze steekpro...

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de veranderingen die zich op het genomisch niveau van biologische organismen voordoen. Bereiding van de monsters voor NGS methoden kan gevarieerd worden afhankelijk van het organisme, weefseltype, en wat nog belangrijker is het vragen de onderzoekers graag adres. Vele studies hebben aan NGS gedraaid als een middel van het bestuderen van de verschillen in genuitdrukking tussen staten zoals gezonde en zieke personen1,,2,,3,4. De sequencing nemen plaats op basis van de hele genoom en laat een onderzoeker te vangen de meeste, zoniet alle, genomische informatie voor een bepaalde genetische marker tegelijkertijd wijs.
De meest voorkomende markeringen van meningsuiting waargenomen zijn de messenger RNAs (mRNAs). De meest gebruikte procedures voor prepping bibliotheken voor RNA-seq zijn geoptimaliseerd voor het herstel van mRNA moleculen door middel van een reeks van zuivering, breukpatroon en ligations5,6. Echter afhankelijk het besluit over de wijze waarop een protocol worden uitgevoerd sterk van het type van de steekproef en de vragen over het genoemde monster. In de meeste gevallen wordt de totale RNA geëxtraheerd; echter niet alle RNA-moleculen zijn van belang en in gevallen zoals mRNA expressie studies al te overvloedige RNA-soorten, zoals ribosomaal RNAs (rRNA) moet worden verwijderd om het aantal detecteerbare afschriften die is gekoppeld aan de mRNAs verhogen. De meest populaire en meest gebruikte methode voor het verwijderen van de overvloedige rRNA moleculen is de vermindering van de polyadenylated RNA afschriften polyA uitputting7hierna. Deze aanpak werkt goed voor de analyse van mRNA uitdrukking zoals doet geen afbreuk aan de transcripten van mRNA. Echter in studies die geïnteresseerd zijn in niet-coderende of virale RNAs polyA uitputting verwijdert u ook deze moleculen.
Veel studies verkiezen te concentreren op de RNA reeks bibliotheek voorbereiding om te onderzoeken of mRNA uitdrukking (coderen) of een bepaalde categorie van kleine of grote niet-coderende RNA. Hoewel er andere procedures8 als de onze die het mogelijk voor de bereiding van de monsters van de dual maken, bereiden veel studies bibliotheken van afzonderlijke monsters voor afzonderlijke studies beschikbaar. Voor een studie als de onze, zou dit normaal gesproken meerdere bloedmonsters stijgende tijd, verbruiksartikelen, en dieren stress vereisen. Het doel van deze studie was om het gebruik van bloed van dieren te identificeren en kwantificeren van de verschillende klassen van beide mRNA te kunnen en niet-coderende RNA uitgesproken tussen gezonde en hoogpathogene varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus (HP-PRRSV) uitgedaagd varkens9,10 ondanks het feit dat slechts een enkele volbloed steekproef (2,5 mL) van elk varken. Om dit te doen, die we nodig hadden om de typische extractie en bibliotheek creatie protocollen voor het genereren van de juiste gegevens te voorzien van analyse van mRNA zowel niet-coderende RNA (ncRNA) expressie11 van één sample te optimaliseren.
Dit leidde tot een behoefte aan een protocol dat is toegestaan voor mRNA en analyse van niet-coderende RNA omdat de beschikbare standaard kits en de methoden voor RNA-extractie en bibliotheek creëren bestemd waren voornamelijk voor mRNA en gebruik een poly-A uitputting stap12. Deze stap zou hebben gemaakt het onmogelijk om te herstellen van niet-coderende RNA of virale afschriften uit het monster. Dus, een geoptimaliseerde methode nodig was dat toegestaan voor totale RNA extractie zonder monster polyA uitputting. De methode voorgesteld in dit manuscript is geoptimaliseerd voor het gebruik van volbloed als een monster type toestaan en sequencing bibliotheken te bouwen voor zowel mRNA en ncRNAs voor kleine en grote maten. De methode is geoptimaliseerd om te voorzien in de analyse van alle aantoonbaar niet-coderende RNAs evenals virale RNAs voor later onderzoek13behouden. In alle zorgt ons geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding protocol voor het onderzoek van meerdere RNA-moleculen uit een monster van één volbloed.
Het algehele doel achter het gebruik van deze methode was een proces dat is toegestaan voor de collectie van zowel niet-coderende RNA en mRNA uit één monster van volbloed te ontwikkelen. Daardoor kunnen we in onze studie afkomstig uit een monster9mRNA, ncRNA, en virale RNA voor elk dier hebben. Dit, uiteindelijk zorgt voor meer wetenschappelijke ontdekking zonder dierlijke meerkosten en geeft een completer beeld van de expressie van elk individuele monster. De beschreven methode geschikt is voor het onderzoek van de regelgevers van genexpressie, alsook het zodat voor voltooiing van oereenstemming studies vergelijken beide mRNA en niet-coderende RNA expressie met behulp van een enkel geheel bloedmonster. Onze studie gebruikt dit protocol te onderzoeken van de wijzigingen in genexpressie en mogelijk epigenetische regelgevers in viraal geïnfecteerde 9 - weken oude mannelijke commerciële varkens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

De komst van innovatieve en steeds meer krachtige volgende generatie sequencing technieken heeft nieuwe wegen geopend in de mogelijkheid te onderzoeken van de onderliggende genexpressie gerelateerde biologische processen van belang. Deze innovaties kunnen niet alleen onderzoekers te observeren-expressie aan vanaf het mRNA-sequenties die voor de genen die cellulaire functie effect code, maar ook de niet-coderende (ncRNA) molecules van RNA die onvertaald, maar toch blijven hebben regelgevende taken. Hoewel onderzoekers de mogelijkheid hebben om zowel ncRNA als mRNA uitdrukking te observeren, is het gebruikelijk dat een studie te richten op de ene of de andere geweest. Als echter studies zijn zowel ncRNA als mRNA uitdrukking kochten, vele malen ze gebruiken afzonderlijke monsters te onderzoeken niet-coderende RNAs vanwege het verschil in bibliotheek preparaten of codering. Dit kan leiden tot de noodzaak van meer monsters die tijd, verbruiksartikelen en dieren stress kan verhogen. Bovendien kan het onderzoekers om te beslissen voor te bereiden op monsters slechts één analyse, meestal de mRNA, beperking van het aantal biologische vragen die kunnen worden onderzocht. Echter omspannen ncRNAs meerdere klassen met regelgevende functies die effect mRNA uitdrukking. Omdat ncRNA zijn belangrijk voor fundamentele biologische processen en wanorde van deze processen in tijdens de infectie, kunnen ze daarom aantrekkelijk dedoelenvoorde therapeutics doen. Dit manuscript toont een gewijzigd protocol voor de generatie mRNA en niet-coderende RNA expressie bibliotheken, met inbegrip van de virale RNA, van een enkel bloedmonster geheel. Optimalisatie van dit protocol, verbeterd RNA zuiverheid, verhoogd afbinding voor herstel van gemethyleerd RNAs en maat keuze, zodat de vangst van de meer RNA soorten weggelaten.

De representatieve monsters als in onze studie zijn de globine en geheel bloedmonsters ribo-uitgeput. De representatieve resultaten van het protocol bestaat uit een globine verarmd bibliotheek monster met een RNA integriteit nummer (RIN) boven 7 (Figuur 1een) en 260/280 nm concentratie ratio's op of boven 2 (Figuur 1b en 1 c). Validatie van de resultaten van de steekproef is uitgevoerd met behulp...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Hier presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de verwerking van codering (mRNA) en niet-coderende (ncRNA) globine verminderd RNA-seq bibliotheken uit een monster van één volbloed.

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van gastheer-pathogen interacties door het mogelijk te maken onderzoek van de codering, niet-codering, en virale RNA expressie die betrokken zijn bij de gastheer amino respons, alsmede hoe een ziekteverwekker kan invloed hebben op de biologische functies van de gastheer. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het presenteert een protocol geoptimaliseerd voor de verwerking van mRNA en niet-codering RNA uit globine-verminderde RNAseq bibliotheken uit een enkel volledig bloedmonster. Het aantonen van de techniek zal Sarah Anderson zijn, een technicus van mijn laboratorium.Begin met het centrifugeren van de bloedbuizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Werken in een biologische veiligheidskast, na het verwijderen van de supernatant, voeg acht milliliter RNase-vrij water aan de pellet. Sluit de buizen en vortex de pellet totdat deze zichtbaar is opgelost, dan centrifugeren de buizen op 50 20 keer G gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de pellet te herstellen.Werken in een biologische veiligheidskast, gooi de supernatant weg en red de pellet. Om het totale RNA te isoleren, begin met het pipetteren van 300 microliters lysisbindingsbuffer aan de pellet. Breng na het vortexen het mengsel van elke buis over naar een nieuwe gelabelde 1,5 milliliter centrifugebuis.Voeg 30 microliter homogenaat van de miRNA isolatie kit. Vortex de buizen en plaats op het ijs voor 10 minuten. Werken in een rookkap, verwijder de buizen uit ijs en voeg 300 microliter van het zure fenol chloroform reagens uit de kit en vortex weer te mengen.Na het centrifugeren op 10.000 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, voorzichtig verwijderen waterige fase van een nieuwe buis. Op basis van de hoeveelheid waterig herstel van de vorige stap, voeg 1,25 keer het volume van 100% ethanol toe aan de waterige faag in elke buis en pipet om te mengen. Bereid voor elk monster verse opvangbuizen met een filtercartridge.Pipette ongeveer 675 microliter van het mengsel van lysaat-ethanol op de filtercartridge. Centrifuge kort bij 10.000 keer G om vloeistof door het filter te laten gaan. Gooi de doorstroom weg.Herhaal het mengsel van lysaat-ethanol dat het filter en de centrifugatie toevoegt totdat het volledig is gebruikt. Voeg 700 microliter wasoplossing toe, één van de kit aan de filtercartridge. Centrifuge kort om de oplossing door de filters te trekken.Gooi de doorstroom weg en bewaar dezelfde filtercartridges en opvangbuizen. Voeg 500 microliter wasoplossing twee-drie toe aan elke filtercartridge. Nadat u opnieuw hebt gecentrifugeren, moet u de doorstroom verwijderen en de wasstap herhalen.Als u de resterende vloeistof uit de filtercartridges wilt verwijderen, draait u ze nog eens 60 seconden. Breng de cartridges over op verse inzamelbuizen. Voeg 100 microliter van 95 graden Celsius voorverwarmd nuclease-vrij water toe aan het midden van elke filtercartridge.Centrifugeren de cartridges gedurende ongeveer 20 tot 30 seconden op het tafelblad centrifuge op maximale snelheid. Om hybridisatie voor te vormen met globinereductie oligo's, eerst denatureren het RNA door het toevoegen van elk geëxtraheerd monster in een 0,2 milliliter dunwandige nuclease-vrije reactiebuis. Plaats de buizen in een thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten.Plaats daarna onmiddellijk de buizen op ijs om een optimale RNA-kwaliteit te verkrijgen. Terwijl de buizen koelen, bereid 400 microliter van 10X globin reductie oligo mix en 10X oligo hybridisatie buffer in een twee milliliter buis. Om de hybridisatie mix te maken, voeg zes microgram RNA monster, twee microliters van de 10X globin reductie oligo mix, een microliter van 10X oligo hybridisatie buffer, en nuclease gratis water aan een laatste volume van 10 microliters aan elke 0,2 milliliter dunwandige, nuclease-vrije reactiebuis.Plaats de buizen in de thermische cycler op 70 graden Celsius gedurende twee minuten. Daarna, onmiddellijk zet de buizen op ijs. Om RNase H-vertering uit te voeren, verdun je eerst 10X RNase H tot één X RNase H met één X RNase H-buffer.Bereid RNase H-reactiemix voor door twee microliter van 10X RNase-buffer, een microliter RNase-remmer en twee microliters van één X RNase H en vijf microliter nuclease-vrij water te combineren tot een totaal volume van 10 microliter. Voeg 10 microliter van de RNase H-reactiemix toe aan de globinreductiehybrideisatiemonsters en meng grondig. Verteren deze reactie op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten en vervolgens afkoelen tot vier graden Celsius.Stop de spijsvertering door een microliter van 0,5 molaire EDTA aan de buis toe te voegen en breng het volledige gehalte aan de buis over naar een verse buis van 1,5 milliliter. Voeg onmiddellijk daarna 80 microliter RNase-vrij water, 350 microliter lysebuffer, dan 250 microliter van 100% ethanol toe aan elke buis en meng goed door pipetting. Breng elk monster van 700 microliter over naar een aparte elutiefiltercartridge die in twee milliliter-inzamelbuis wordt geplaatst om de doorstroom te verzamelen.Centrifugeren gedurende 15 seconden op 8,000 keer G of groter en gooi de flow-through weg. Plaats dezelfde elutiefiltercartridges in nieuwe twee milliliter opvangbuizen. Om de filtercartridgemembranen te wassen, voegt u 500 microliter van de milde wasbuffer toe aan de filtercartridges en centrifuge gedurende 15 seconden bij 8, 000 keer G of meer.Gooi de doorstroom weg. Voeg vervolgens met dezelfde opvangbuizen 500 microliter van 80% ethanol toe aan de filtercartridges. Centrifuge twee minuten op 8.000 keer G en groter.Gooi zowel de flow-through en collectie buizen, en sla de elutie spin kolommen. Plaats elke elution spin kolom in een nieuwe twee milliliter collectie buis. Vijf minuten op volle snelheid centrifugeren met het open deksel op filterpatronen om de spinkolommembranen te drogen en ethanoloverdracht te voorkomen.Na het weggooien van de opvangbuizen plaatst u elke gedroogde filtercartridge in een verse opvangbuis van 1,5 milliliter. Voeg 14 microliter RNase-vrij water direct toe aan het midden van het filtercartridgemembraan. Om het RNA te ontwijken, centrifugeren de buizen gedurende 60 seconden op volle snelheid en ga dan verder met verdere RNA-beoordeling en voorbereiding.Het globine-uitgeputte monster kan nu worden gesplitst en gebruikt om de kleine, niet-codering RNA-bibliotheken voor te bereiden, evenals de ribo-uitgeputte mRNA en lange, niet-coderende RNA-bibliotheken. Na het voorbereiden van expressiebibliotheken van de globine-uitgeputte en ribo-uitgeputte volbloedmonsters met behulp van dit protocol, toonde de samenvatting van de elektroforese bestandsloop een globine-uitgeput bibliotheekmonster met RNA-integriteitsnummers die varieerden van 6,3 tot 9,2. Dit bleek een verbetering ten opzichte van andere studies die globine uitputtingsmethoden gebruikt en waren alleen in staat om RIN nummers te bereiken op of in de buurt van zes.Uit de preglobinereductie en postglobinereductie van één enkel enkel bloedmonster van varkens bleek dat de concentratieverhoudingen van 260 tot 280 nanometer op of boven de twee liggen. Met behulp van dit protocol werden op chips gebaseerde elektroferogrammen van globine- en ribo-uitgeputte mRNA-bibliotheekmonsters verkregen voorafgaand aan het bundelen en sequencing. Voor de mRNA-bibliotheken heeft het representatieve elektropherogram een piek van ongeveer 280 basisparen.Voor de kleine ncRNAs bevatten representatieve chipgebaseerde elektroferogrammen een bereik van pieken van ongeveer 100 tot 400 basisparen. Pieken bij ongeveer 143 basisparen komen overeen met miRNAs, en pieken bij ongeveer 153 basisparen komen overeen met piRNAs. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ijs buizen onmiddellijk waar opgemerkt.Na deze procedure moeten andere methoden worden uitgevoerd, zoals de volgende generatie sequencing om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals differentiële expressie, epigenetische veranderingen en hun effect op biologische trajecten en processen. Vergeet niet dat het werken met fenol-chloroform reagens uiterst gevaarlijk is en voorzorgsmaatregelen zoals werken in een rookkap moet worden genomen. Ook moet bij de behandeling van volbloed of infectieuze organismen het werk worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast voorafgaand aan een activering van het besmettelijke organisme.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...