Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vor allem von unterstützt die von der USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 und zum Teil durch USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Diese Studie wurde zum Teil durch einen Termin, um die landwirtschaftliche Forschung Service Teilnahme Forschungsprogramm verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung (ORISE) durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem US-Department of Energy (unterstützt DOE) und das US-Landwirtschaftsministerium. ORISE wird von Oak Ridge verbundene Universitäten DOE vertraglich nicht verwaltet. DE-AC05-06OR2310.
Wir möchten Dr. Kay Faaberg für die HP-PRRSV infektiöse Klone, Dr. Susan Brockmeier für ihre Hilfe mit Tieren an dem Experiment beteiligt und Sue Ohlendorf für Sekretariatsaufgaben in der Manuskripterstellung danken.

Tier-Protokolle wurden vom National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Sammlung von Schweine Blut Proben
<ol><li>Sammeln Sie Blutproben in RNA Röhrchen. Sammeln Sie ~2.5 mL oder mehr, wenn größere Röhrchen zur Verfügung stehen.</li>
</ol>2. Verarbeitung von Schweinen Blut Proben
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Blut-Röhrchen 5.020 x g für 10 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C). Wenn Verarbeitung gefrorene ...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. 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New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Der erste wichtige Schritt in das Protokoll, das es optimiert gemacht enthalten die zusätzlichen Globin Erschöpfung Schritte, die es möglich gemacht, Qualität liest aus Vollblut-Proben zu erhalten. Eine der größten Einschränkungen zur Verwendung von Vollblut in Sequenzierung Studien sind die hohe Anzahl der Lesevorgänge in der Probe, die Globin Moleküle ordnen und reduziert das liest, die andere Moleküle Interesse18zuordnen könnte. Daher mussten wir bei der Optimierung des Protokolls f?...

Sequenzierung der nächsten Generation entstanden (NGS) als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Veränderungen, die auf Genomebene von biologischen Organismen auftreten. Probenvorbereitung für die NGS Methoden variiert werden, je nach Organismus, Gewebetyp, und vor allem die Fragen die Forscher wollen Adresse. Viele Studien haben NGS als Mittel zur Untersuchung der Unterschiede in der Genexpression zwischen Staaten wie gesunde und kranke Personen1,2,3,4geworden. Die Sequenzierung legen Sie auf ein ganzes Genom-Basis und ermöglicht ein Forscher, der meisten zu erfassen, wenn nicht alle, die genomische Informationen für einen bestimmten genetischen Marker zu einem Zeitpunkt zeigen.
Die am häufigsten verwendeten Marker des Ausdrucks beobachtet sind der Messenger-RNAs (mRNAs). Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur prepping Bibliotheken für RNA-Seq sind optimiert für die Erholung der mRNA-Moleküle durch den Einsatz einer Reihe von Reinigungen, Fragmentierungen und grundsätzlich5,6. Die Entscheidung darüber, wie ein Protokoll durchgeführt werden stützt sich jedoch auf Probentyp und die Fragen über diese Probe. In den meisten Fällen wird die Gesamt-RNS extrahiert; Doch nicht alle RNA-Moleküle sind von Interesse und in Fällen wie mRNA Ausdruck Studien allzu reichlich RNA-Spezies, wie ribosomale RNA (rRNA) müssen entfernt werden, um die Zahl der nachweisbaren Abschriften der mRNAs zugeordnet. Die beliebtesten und am weitesten verbreitete Methode zur Entfernung der reichlich rRNA Moleküle ist die Reduzierung von Polyadenylated RNA-Transkripte als PolyA Erschöpfung7bezeichnet. Dieser Ansatz funktioniert gut für die Analyse der mRNA Ausdruck, da es die mRNA Transkripte nicht beeinträchtigt wird. In Studien, die in nicht-kodierenden oder viralen RNAs interessiert sind, entfernt jedoch auch PolyA Erschöpfung dieser Moleküle.
Viele Studien wählen, um auf die RNA-Sequenz Bibliothek Vorbereitung mRNA Expression (Codierung) zu untersuchen oder eine bestimmte Klasse von kleinen oder großen nicht-kodierender RNA zu konzentrieren. Zwar gibt es andere Verfahren8 wie der unsrigen, die für die duale Probenvorbereitung ermöglichen, bereiten viele Studien Bibliotheken aus gesonderten Proben für separate Studien wenn verfügbar. Für eine Studie wie der unsrigen erfordert dies normalerweise mehrere Blutproben, die Erhöhung der Zeit, Verbrauchsmaterialien und Tier Stress. Ziel unserer Studie war es, möglicherweise verwenden Vollblut von Tieren zu identifizieren und quantifizieren die verschiedenen Klassen der beiden mRNA und nicht-kodierender RNA ausgedrückt zwischen gesunden und hochpathogenen Porcines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus (HP-PRRSV) Schweine-9,-10 trotz des Habens von nur einer einzigen Vollblut-Probe (2,5 mL) von jedem Schwein in Frage gestellt. Um dies zu tun, mussten wir zur Optimierung der typischen Extraktion und Bibliothek erstellen Protokolle, die richtigen Daten für die Analyse von mRNA und nicht-kodierende RNA (NcRNA) Ausdruck11 aus einer einzigen Probe ermöglichen zu generieren.
Dies veranlasste eine Notwendigkeit für ein Protokoll, das für mRNA und nicht-kodierende RNA Analyse zulässig, da die verfügbaren standard-Kits und Methoden für die Erstellung RNA-Extraktion und Bibliothek hauptsächlich für mRNA bestimmt wurden und ein Poly-A Erschöpfung Schritt12 verwenden. Dieser Schritt würde es wieder nicht-kodierender RNA oder viralen Transkripte aus der Probe unmöglich gemacht haben. Daher bedurfte es eine optimierte Methode, die für insgesamt RNA-Extraktion ohne Probe PolyA Erschöpfung zulässig. In diesem Manuskript vorgestellte Methode wurde für den Einsatz von Vollblut als Probentyp ermöglichen und Sequenzierung Bibliotheken für mRNA und NcRNAs von kleinen und großen Größen zu bauen optimiert. Die Methode wurde optimiert, um für die Analyse von allen nachweisbar nicht-kodierende RNAs sowie virale RNA für spätere Untersuchung13zu behalten. Alles in allem ermöglicht unsere optimierte Bibliothek-Vorbereitung-Protokoll für die Untersuchung mehrere RNA-Moleküle aus einer einzigen Blutprobe ganz.
Das übergeordnete Ziel hinter der Verwendung dieser Methode war, ein Verfahren zu entwickeln, die für die Sammlung von nicht-kodierende RNA und mRNA aus einer Stichprobe von Vollblut zulässig. Dies ermöglicht es uns, mRNA, NcRNA und virale RNA für jedes Tier in unserer Studie, die aus einer einzigen Probe9bezogen haben. Dies, letztlich ermöglicht weitere wissenschaftliche Entdeckung ohne Zusatzkosten Tier und gibt ein vollständigeres Bild des Ausdrucks von jeder einzelnen Probe. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Regulierungsbehörden der gen-Expression als auch für den Abschluss der korrelative Studien zum Vergleich beide mRNA und nicht-kodierende RNA-Ausdruck mit Hilfe einer einzigen Vollblut-Stichprobe. Unserer Studie dieses Protokoll verwendet, um die Änderungen in der Genexpression zu untersuchen und mögliche epigenetische Regulatoren in Viral infiziert 9 - Wochen alten männlichen kommerzielle Schweine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Das Aufkommen von innovativer und leistungsfähiger nächste Generation Sequenzierung Techniken eröffnet neue Wege in der Fähigkeit, die zugrunde liegenden Genexpression im Zusammenhang mit biologischen Prozesse von Interesse zu untersuchen. Diese Innovationen ermöglichen nicht nur Forscher, Ausdruck aus der mRNA-Sequenzen zu beobachten, die diesen Effekt zelluläre Funktion für Gene kodieren, aber auch die nicht-kodierende RNA (NcRNA) Moleküle, die nicht übersetzten, aber dennoch bleiben regulatorische Funktionen. Obwohl Forscher die Fähigkeit haben, mRNA und NcRNA Ausdruck zu beobachten, wurde es üblich, dass eine Studie, die auf eine oder die andere zu konzentrieren. Jedoch wenn Studien an mRNA und NcRNA Ausdruck interessiert sind, verwenden viele Male sie separate Proben, um Codierung oder nicht-kodierende RNAs aufgrund der Differenz in Bibliothek Vorbereitungen zu untersuchen. Das führt zu der Notwendigkeit mehr Proben die Zeit, Verbrauchsmaterialien und tierischen Stress erhöhen können. Darüber hinaus kann es kommen Forscher zu entscheiden, zur Vorbereitung von Proben für nur eine Analyse, in der Regel die mRNA, Begrenzung der Zahl der biologischen Fragestellungen, die untersucht werden können. Allerdings umfassen NcRNAs mehrere Klassen mit regulatorischen Rollen diesen Effekt mRNA Ausdruck. Da NcRNA sind wichtig, grundlegende biologische Prozesse und Störung dieser Prozesse in während der Infektion, können sie daher attraktive Ziele für Therapeutika vornehmen. Diese Handschrift zeigt eine geänderte Protokoll für die Generation mRNA und nicht-kodierende RNA Ausdruck Bibliotheken, einschließlich der viralen RNA aus einer einzigen Stichprobe von Vollblut. Optimierung dieses Protokolls RNA Reinheit verbessert, erhöht Ligatur für die Wiederherstellung der methylierten RNAs und ausgelassen Größenauswahl, um Erfassung von mehr RNA-Spezies zu ermöglichen.

Die repräsentativen Proben in unserer Studie sind die Globin und Ribo-abgereicherte Vollblut-Proben. Das repräsentative Ergebnis des Protokolls besteht aus einer Globin abgereichertem Bibliothek Probe mit einer RNA-Integrität-Anzahl (RIN) über 7 (Abbildung 1(ein) und 260/280 nm Konzentrationsverhältnis bei oder über 2 (Abbildung 1b und 1 c). Validierung der Probe Ergebnisse erfolgte mittels...

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Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verarbeitung der Codierung (mRNA) optimiert und nicht-kodierenden (NcRNA) Globin reduziert RNA-Seq-Bibliotheken von einer einzigen Vollblut-Probe.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen bei der Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu beantworten, indem sie die Untersuchung der kodierenden, nicht-kodierenden und viralen RNA-Expression ermöglicht, die an der Resonanz auf das Wirt-Amino-Response beteiligt ist, sowie wie ein Erreger die biologischen Funktionen des Wirts beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein Protokoll präsentiert, das für die Verarbeitung von mRNA und nicht-kodierender RNA aus globinreduzierten RNAseq-Bibliotheken aus einer einzigen Vollblutprobe optimiert ist. Die Technik wird Sarah Anderson demonstrieren, eine Technikerin aus meinem Labor.Beginnen Sie mit der Zentrifugierung der Blutröhrchen bei 50 20 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wenn Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank arbeiten, fügen Sie nach dem Entfernen des Überstandes acht Milliliter RNase-freies Wasser in das Pellet ein. Schließen Sie die Rohre und wirbeln Sie das Pellet, bis es sichtbar gelöst ist, zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 50 20 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um das Pellet zurückzugewinnen.Arbeiten Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank, entsorgen Sie den Überstand und retten Sie das Pellet. Um die gesamte RNA zu isolieren, beginnen Sie mit der Pipettierung von 300 Mikroliterlysebindungspuffer an das Pellet. Nach dem Wirbeln das Gemisch aus jedem Rohr in ein neu beschriftetes 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.Fügen Sie 30 Mikroliter homogenaten Additiv aus dem miRNA Isolationkit hinzu. Wirbeln Sie die Rohre und legen Sie auf dem Eis für 10 Minuten. In einer Dunstabzugshaube arbeiten, die Schläuche vom Eis entfernen und 300 Mikroliter des Säurephenolchlorformreagenzes aus dem Kit hinzufügen und wieder wirbeln.Nach zentrifugieren bei 10.000 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, vorsichtig wässrige Phase zu einem neuen Rohr entfernen. Basierend auf der Menge der wässrigen Erholung aus dem vorherigen Schritt, fügen Sie das 1,25-fache des Volumens von 100%Ethanol zu dem wässrigen Phagen in jedem Rohr und Pipette zu mischen. Bereiten Sie frische Sammelrohre vor, die eine Filterpatrone für jede Probe enthalten.Pipetten Sie ca. 675 Mikroliter des Lysat-Ethanol-Gemischs auf die Filterpatrone. Zentrifuge kurz bei 10.000 mal G, um Flüssigkeit durch den Filter zu leiten. Entsorgen Sie den Durchfluss.Wiederholen Sie das Lysat-Ethanol-Gemisch, das dem Filter und der Zentrifugation zufügt, bis es vollständig verwendet wurde. Fügen Sie 700 Mikroliter Waschlösung eins aus dem Kit in die Filterpatrone. Zentrifuge kurz, um die Lösung durch die Filter zu ziehen.Entsorgen Sie den Durchfluss und bewahren Sie die gleichen Filterpatronen und Sammelrohre auf. Fügen Sie 500 Mikroliter Waschlösung zwei-drei zu jeder Filterpatrone. Nach dem zentrieren den Durchfluss abwerfen und den Waschschritt wiederholen.Um Restflüssigkeit aus den Filterpatronen zu entfernen, drehen Sie sie zusätzlich 60 Sekunden. Übertragen Sie die Patronen in frische Sammelrohre. Fügen Sie 100 Mikroliter 95 Grad Celsius vorgeheiztes nukleasefreies Wasser in die Mitte jeder Filterpatrone hinzu.Zentrifugieren Sie die Patronen ca. 20 bis 30 Sekunden lang an der Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit. Um die Hybridisierung mit Globinreduktionsoligos zu preformieren, denaturiert man zunächst die RNA, indem jede extrahierte Probe in ein 0,2 Milliliter dünnwandiges Nuklease-freies Reaktionsrohr eingebracht wird. Legen Sie die Rohre in einem thermischen Cycler bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten.Danach die Röhren sofort auf Eis legen, um eine optimale RNA-Qualität zu erhalten. Während die Rohre abkühlen, bereiten Sie 400 Mikroliter 10X Globin Reduktion Oligo-Mix und 10X Oligo Hybridisierung Puffer in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Um den Hybridisierungsmix zu machen, fügen Sie sechs Mikrogramm RNA-Probe, zwei Mikroliter des 10X Globin-Reduktions-Oligo-Mix, einen Mikroliter 10X Oligo-Hybridisierungspuffer und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern zu jedem 0,2 Milliliter dünnwandigen, nukleasefreien Reaktionsrohr hinzu.Legen Sie die Rohre in den thermischen Cycler bei 70 Grad Celsius für zwei Minuten. Danach sofort die Rohre auf Eis legen. Um die RNase H-Verdauung durchzuführen, verdünnen Sie zunächst 10X RNase H zu einem X RNase H mit einem X RNase H Puffer.Bereiten Sie den RNase H-Reaktionsmix vor, indem Sie zwei Mikroliter 10-fachen RNase-Puffer, einen Mikroliter RNase-Inhibitor und zwei Mikroliter einer X RNase H und fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern kombinieren. 10 Mikroliter des RNase H-Reaktionsmixes zu den Globin-Reduktions-Hybridisierungsproben hinzufügen und gründlich mischen. Diese Reaktion bei 37 Grad Celsius 10 Minuten verdauen und dann auf vier Grad Celsius abkühlen lassen.Beenden Sie die Verdauung, indem Sie dem Rohr einen Mikroliter 0,5 Molaren EDTA hinzufügen, und übertragen Sie den gesamten Inhalt der Röhre in ein frisches 1,5-Milliliter-Rohr. Unmittelbar danach 80 Mikroliter RNase-freies Wasser, 350 Mikroliter Lysepuffer, dann 250 Mikroliter 100% Ethanol in jedes Rohr geben und durch Pipettieren gut vermischen. Übertragen Sie jede 700-Mikroliter-Probe in eine separate Elutionsfilterpatrone, die in ein Zwei-Milliliter-Sammelrohr gelegt wird, um den Durchfluss zu erfassen.Zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 8.000 mal G oder mehr und entsorgen Sie dann den Durchfluss. Legen Sie die gleichen Elutionsfilterpatronen in neue Zwei-Milliliter-Sammelrohre. Um die Filterpatronenmembranen zu waschen, fügen Sie 500 Mikroliter des milden Waschpuffers für 15 Sekunden bei 8.000 mal G oder mehr in die Filterpatronen und Zentrifuge ein.Entsorgen Sie den Durchfluss. Dann, mit den gleichen Sammelrohren, fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol zu den Filterpatronen. Zentrifuge für zwei Minuten bei 8 000 mal G und größer.Entsorgen Sie sowohl die Durchfluss- als auch die Sammelrohre, und speichern Sie die Elutionspin-Säulen. Platzieren Sie jede Elutionspin-Spalte in ein neues Zwei-Milliliter-Sammelrohr. Zentrifuge mit voller Geschwindigkeit für fünf Minuten mit dem offenen Deckel auf Filterpatronen, um die Spinsäulenmembranen zu trocknen und Ethanol-Übertragung zu verhindern.Nach dem Entsorgen der Sammelrohre jede getrocknete Filterpatrone in ein frisches 1,5-Milliliter-Sammelrohr geben. Fügen Sie 14 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt in die Mitte der Filterpatronenmembran. Um die RNA zu elute, zentrifugieren Sie die Röhren für 60 Sekunden bei voller Geschwindigkeit und dann mit der weiteren RNA-Bewertung und -Vorbereitung fortfahren.Die globin-depleted Probe kann nun geteilt und zur Vorbereitung der kleinen, nicht-kodierenden RNA-Bibliotheken sowie der ribo-depleted mRNA und langen, nicht-kodierenden RNA-Bibliotheken verwendet werden. Nach der Vorbereitung von Expressionsbibliotheken der globin-depleted und ribo-depleted Vollblutproben mit diesem Protokoll, Electrophorese File Run Zusammenfassung zeigte eine globin-depleted Bibliothek Probe mit RNA-Integritätsnummern, die von 6,3 bis 9,2. Dies erwies sich als eine Verbesserung im Vergleich zu anderen Studien, die Globin-Depletion-Methoden verwendeten und nur bei oder bei sechs RIN-Zahlen erreichten.Die Präglobin-Reduktion und die Post-Globin-Reduktion einer einzigen Schweine-Vollblutprobe zeigten, dass 260 bis 280 Nanometer Konzentrationsverhältnisse bei oder über zwei liegen. Mit diesem Protokoll wurden chipbasierte Elektropherogramme von globin- und ribo-erschöpften MRNA-Bibliotheksproben vor dem Pooling und der Sequenzierung erhalten. Für die mRNA-Bibliotheken hat das repräsentative Elektropherogramm einen Spitzenwert von etwa 280 Basenpaaren.Für die kleinen ncRNAs enthalten repräsentative Chip-basierte Elektropherogramme eine Reihe von Peaks von ca. 100 bis 400 Basenpaaren. Spitzen bei etwa 143 Basenpaaren entsprechen miRNAs, und Spitzen bei etwa 153 Basenpaaren entsprechen piRNAs. Beim Versuch dieses Verfahrens, Ist es wichtig, sich daran zu erinnern, Eisröhren sofort zu erinnern, wo festgestellt.Nach diesem Verfahren sollten andere Methoden wie die Sequenzierung der nächsten Generation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Differentialexpression, epigenetische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf biologische Bahnen und Prozesse zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol-Chlorform-Reagenz extrem gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer Dunstabzugshaube getroffen werden sollten. Auch beim Umgang mit Vollblut oder infektiösen Organismen sollten Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank vor einer Aktivierung des infektiösen Organismus durchgeführt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

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Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...