Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

עבודה זו בעיקר נתמך על ידי על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2013-67015-21236, וכן על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2015-67015-23216. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות חקלאית מחקר שירות מחקר השתתפות בתוכנית מנוהל על ידי המכון אוק רידג על מדע, חינוך (ORISE) דרך הסוכנויות הסכם בין (משרד האנרגיה של ארה DOE), מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ORISE מנוהלת על ידי אלון רכס Associated אוניברסיטאות תחת חוזה דו. לא. דה-AC05-06OR2310.
ברצוננו להודות ד ר קיי Faaberg HP-PRRSV זיהומיות שיבוטים, ד ר סוזן Brockmeier עזרה עם חיות מעורב בניסוי, סו Ohlendorf עבור שירותי מזכירות בהכנה של כתב היד.

פרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי המרכז הלאומי חיה המחלה (USDA-ARS-NADC) חיה אכפת ועל שימוש הוועדה.
1. דם חזיר חנקן נוזלי
<ol><li>לאסוף דגימות דם לתוך צינורות RNA. איסוף ~2.5 mL ומעלה אם צינורות אוסף גדול יותר זמינים.</li>
</ol>2. עיבוד של דם חזיר דגימות
<ol><li>Centrifuge צינורות הדם ב x 5,020 ...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול כי עשה את זה אופטימיזציה כלל הצעדים דלדול נוסף גלובין, שהפכו אותו ניתן לקבל איכות קריאות מדגימות דם מלא. אחת המגבלות הגדולות על השימוש דם במחקרים רצף המספרים גבוהה הקריאות במדגם זה יהיה למפות גלובין מולקולות להפחית את הקורא את יכולת למפות את מולקולות אחרות הר?...

רצף הדור הבא (הגדרות) התפתחה כלי רב עוצמה עבור החקירה של השינויים המתרחשים ברמת גנומית של אורגניזם ביולוגי. הכנת הדוגמא לשיטות המיתרים יכולים להיות מגוונים בהתאם האורגניזם, סוג הרקמה, והם וחשוב השאלות החוקרים להוטים כתובת. מחקרים רבים פנו המיתרים כאמצעי של הלומדים את ההבדלים בביטוי הגנים בין מדינות כגון אנשים בריאים וחולים1,2,3,4. קח רצף במקום על בסיס כל הגנום ומאפשר חוקר ללכוד את רוב, אם לא כל, של המידע גנומית סמן גנטי מסוים בכל פעם הצבע.
הסימנים הנפוצים ביותר הביטוי נצפו הן RNAs שליח (mRNAs). ההליכים הנפוצה ביותר עבור ספריות מכין עבור ה-RNA-seq ממוטבים עבור ההתאוששות של מולקולות ה-mRNA באמצעות סדרה של purifications, fragmentations ו-5,ligations6. עם זאת, ההחלטה על איך פרוטוקול נמצא שיבוצע מסתמכת במידה רבה על סוג הדגימה ואת השאלות להיות דיגמנה על הדגימה האמורה. ברוב המקרים מופק RNA הכולל; ובכל זאת, לא כל מולקולות RNA עניין, במקרים כמו ה-mRNA ביטוי מחקרים מופרזת שופע מינים RNA, כמו ribosomal RNAs (rRNA) צורך להסיר כדי להגדיל את מספר תעתיקים לזיהוי המשויך את mRNAs. שיטת ביותר פופולריים והשימוש בהם נפוץ עבור הסרת מולקולות rRNA שופע היא הפחתת polyadenylated RNA תעתיקים המכונה תיקים עשויים דלדול7. גישה זו עובד היטב עבור הניתוח של mRNA ביטוי זה אינו משפיע על התרשימים mRNA. עם זאת, מחקרים הם מעוניינים RNAs ללא קידוד או ויראלי, תיקים עשויים דלדול מסיר גם מולקולות אלה.
מחקרים רבים בחרו להתמקד ההכנה ספריית רצף הרנ א לבחון אחד מהביטויים mRNA (קידוד) או שיעור מסוים ללא קידוד RNA קטנות או גדולות. למרות שיש אחרים הליכים8 כמו שלנו המאפשרים הכנת הדוגמא כפול, מחקרים רבים להכין ספריות מדגימות נפרדת ללימודים נפרדים כאשר היא זמינה. עבור מחקר כמו שלנו, זה בדרך כלל דורש מספר דגימות דם הגדלת זמן, מתכלים, מתח בעלי חיים. מטרת המחקר שלנו היה להיות מסוגל להשתמש דם מבעלי כדי לזהות ולכמת את מחלקות שונות של שני mRNA והביע ללא קידוד RNA בין הרבייה חזירי פתוגני ובריאה תסמונת נשימתית וירוס (HP-PRRSV) תגר חזירים9,,10 , למרות שיש רק דגימת דם כל יחיד (2.5 מ ל) של חזיר אחד. כדי לעשות זאת, היינו צריכים למטב את החילוץ אופייני והפרוטוקולים ספריית יצירה כדי ליצור את הנתונים המתאימים כדי לאפשר ניתוח של mRNA והן ללא קידוד RNA (ncRNA) ביטוי11 מתוך מדגם בודד.
הנחיה זו צורך פרוטוקול המותר עבור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ניתוח כי ערכות סטנדרטיים זמינים ושיטות ליצירת RNA-חילוץ וספריה היו מיועדות בעיקר mRNA ולהשתמש עם דלדול poly-A בשלב12. שלב זה הייתה בלתי אפשרי לשחזר ללא קידוד RNA או ויראלי תעתיקים מדגם. לכן, שיטת אופטימיזציה היה צורך זה מותר לחילוץ RNA הכולל ללא מדגם תיקים עשויים דלדול. השיטה המובאת כתב יד זה מוטבה כדי לאפשר לשימוש של דם מלא כסוג לדוגמה, להקים ספריות רצפי mRNA והן ncRNAs בגדלים קטנים וגדולים. השיטה מוטבה כדי לאפשר הניתוח של כל לזיהוי אי קידוד RNAs, כמו גם לשמר RNAs נגיפי עבור חקירה מאוחר יותר13. בסך הכל, פרוטוקול הכנה שלנו ספריית ממוטבת מאפשר החקירה של מספר מולקולות RNA מתוך דגימת דם כל יחיד.
המטרה הכוללת מאחורי השימוש בשיטה זו הייתה לפתח תהליך איפשרה לאוסף ללא קידוד RNA וגם mRNA דוגמא אחת של דם מלא. זה מאפשר לנו יש mRNA, ncRNA ו- RNA נגיפי עבור כל בעל חיים במחקר שלנו הטרייה דוגמה יחידה9. זה, בסופו של דבר, מאפשר גילוי מדעי יותר ללא עלויות נוספות חיות ונותן תמונה שלמה יותר של הביטוי של כל דגימה בודדת. השיטה המתוארת מאפשרת הבחינה של הרגולטורים של ביטוי גנים, כמו גם לאפשר את השלמת correlative מחקרים שהשוו את שניהם mRNA וביטוי ללא קידוד RNA באמצעות דגימת דם כל יחיד. המחקר שלנו להשתמש בפרוטוקול זה לבחון השינויים בביטוי הגנים, הרגולטורים epigenetic ניתן ב נגוע לשווק 9 - בן שבועיים חזירים מסחרי זכרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

כניסתו של יותר ויותר חזקים וחדשניים הבא הדור רצף טכניקות פתחה דרכים חדשות היכולת לבחון בביטוי הגן הבסיסי הקשור תהליכים ביולוגיים של עניין. חידושים אלה מאפשרים לא רק חוקרים לבחון ביטוי מ רצפי mRNA זה הקוד של הגנים את תפקוד התאים השפעה, אך גם מולקולות RNA (ncRNA) ללא קידוד שנותרו לא מתורגם, אבל עדיין יש פונקציות רגולטוריות. למרות חוקרים יש את היכולת להתבונן ביטוי mRNA והן ncRNA, זה כבר מקובל מחקר להתמקד אחת או אחרת. עם זאת, כאשר מחקרים מעוניינים בביטוי mRNA והן ncRNA, פעמים רבות הם משתמשים דגימות נפרד לבחון קידוד או ללא קידוד RNAs לאור ההבדל בהכנות ספריה. זה יכול להוביל הצורך לקבלת דוגמאות נוספות, אשר יכול להגביר הזמן, מתכלים, והלחץ בעלי חיים. בנוסף, הוא עלול לגרום חוקרים להחליט להכין דגימות לבדיקה אחת בלבד, בדרך כלל mRNA, הגבלת מספר שאלות ביולוגי יכול ייחקרו. עם זאת, ncRNAs להקיף כמה מחלקות רגולטוריות תפקידים עם הביטוי הזה mRNA אפקט. כי ncRNA חשובים היסוד תהליכים ביולוגיים, הפרעה של תהליכים אלה ב במהלך זיהום, הם עשויים, לכן, לבצע יעדים אטרקטיביים עבור הרפוי. כתב יד זה מדגים פרוטוקול ששונה לדור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ביטוי ספריות, כולל RNA נגיפי, מתוך מדגם יחיד של דם מלא. אופטימיזציה של פרוטוקול זה, שיפור טוהר RNA, גדל מצדו להתאוששות של RNAs מפוגל, הושמט גודל הבחירה, כדי לאפשר לכידה של RNA יותר מינים.

הדגימות נציג במחקר שלנו הם גלובין דגימות דם כל מדולדל ribo. התוצאה נציג של הפרוטוקול מורכב מדגם ספריית מדולדל גלובין עם מספר שלמות RNA (RIN) מעל 7 (איור 1) ו- 260/280 nm ריכוז יחסי או מעל 2 (איור 1ב' וג' 1). אימות של התוצאה מדגם בוצעה באמצע...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור העיבוד של קידוד (mRNA) האופטימיזציות גלובין (ncRNA) ללא קידוד RNA-seq ספריות של דגימת דם כל יחיד.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן על ידי מתן אפשרות בדיקה של קידוד, אי קידוד, ביטוי RNA ויראלי מעורב בתגובת האמינו המארח, כמו גם איך פתוגן יכול להשפיע על הפונקציות הביולוגיות של המארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציגה פרוטוקול אופטימיזציה לעיבוד של mRNA ו- RNA ללא קידוד מספריות RNAseq מופחת גלובין מדגם דם שלם יחיד. הפגנת הטכניקה תהיה שרה אנדרסון, טכנאית מהמעבדה שלי.התחל על ידי צנטריפוגה צינורות הדם ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. עבודה בארון בטיחות ביולוגי, לאחר הסרת supernatant, להוסיף שמונה מיליליטר של מים ללא RNase לכדור. סגור את הצינורות ואת המערבולת את גלולה עד שהוא מומס בעליל, ואז צנטריפוגה הצינורות ב 50 20 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשחזר את גלולה.עובד בארון בטיחות ביולוגי, להשליך את העל טבעי ולשמור את גלולה. כדי לבודד את ה- RNA הכולל, התחל על-ידי צינורות 300 מיקרוליטרים של מאגר איגוד תזה לכדור. לאחר המערבולת, מעבירים את התערובת מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר.הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תוסף הומוגנטי בערכת הבידוד miRNA. מערבולת הצינורות ומ מניחים על הקרח במשך 10 דקות. עובדים במכסה המנוע של אדים, מסירים את הצינורות מקרח ומוסיפים 300 מיקרוליטרים של ריאגנט החומצה פנול כלורופורם מהערכות והמערבולת שוב כדי לערבב.לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בזהירות שלב מיוודי לצינור חדש. בהתבסס על כמות ההחלמה המעונה מהשלט הקודם, להוסיף 1.25 פעמים את הנפח של 100%אתנול פאג' מים בכל צינור פיפטה לערבב. הכן צינורות איסוף טריים המכילים מחסנית סינון עבור כל דגימה.פיפטה כ 675 microliters של תערובת ליסט-אתנול על מחסנית המסנן. צנטריפוגה לזמן קצר ב 10, 000 פעמים G להעביר נוזל דרך המסנן. השלך את הזרימה דרך.חזור על תערובת lysate-אתנול הוספת המסנן צנטריפוגה עד שהוא שימש לחלוטין. הוסף 700 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה אחד מההערכה למחסנית המסנן. צנטריפוגה בקצרה כדי למשוך את הפתרון דרך המסננים.השלך את הזרימה דרך ולשמור את אותן מחסניות מסנן וצינורות איסוף. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון שטיפה 2-3 לכל מחסנית סינון. לאחר צנטריפוגה שוב, להשליך את הזרימה דרך ולחזור על צעד לשטוף.כדי להסיר כל נוזל שיורית ממחסניות הסינון, סובב אותן 60 שניות נוספות. מעבירים את המחסניות לצינורות איסוף טריים. הוסיפו למרכז כל מחסנית מסנן 100 מיקרוליטרים של 95 מעלות צלזיוס שחומם מראש.צנטריפוגה את המחסניות במשך כ 20 עד 30 שניות על צנטריפוגה השולחן במהירות המרבית. כדי ליצור מראש הכלאה עם אוליגוס הפחתת גלובין, תחילה denature RNA על ידי הוספת כל מדגם שחולצו לתוך צינור תגובה דק קירות דקים 0.2 מיליליטר ללא גרעין. מניחים את הצינורות במחזור תרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.לאחר מכן, מיד למקם את הצינורות על קרח כדי לקבל איכות RNA אופטימלית. בעוד הצינורות מתקררים, הכינו 400 מיקרוליטרים של תערובת אוליגו להפחתת גלובין פי 10 וחוצץ הכלאה אוליגו פי 10 בצינור שני מיליליטר. כדי להפוך את תערובת ההכלאה, להוסיף שישה מיקרוגרם של מדגם RNA, שני microliters של תערובת אוליגו הפחתת 10X גלובין, מיקרוליטר אחד של חיץ הכלאה אוליגו 10X, ומים ללא גרעין לנפח סופי של 10 microliters לכל 0.2 מיליליטר דק קירות, צינור תגובה ללא גרעין.מניחים את הצינורות במחזור התרמי ב 70 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר מכן, מיד מניחים את הצינורות על קרח. כדי לבצע עיכול RNase H, תחילה לדלל 10X RNase H אחד X RNase H עם אחד X RNase H מאגר.הכן RNase H תגובה לערבב על ידי שילוב של שני microliters של חיץ RNase 10X, מיקרוליטר אחד של מעכב RNase, ושני microliters של אחד X RNase H, וחמישה microliters של מים ללא גרעין לנפח כולל של 10 microliters. הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תערובת התגובה RNase H לדגימות ההכלאה להפחתת גלובין ומערבבים היטב. לעכל תגובה זו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן להתקרר עד ארבע מעלות צלזיוס.לעצור את העיכול על ידי הוספת microliter אחד של 0.5 EDTA טוחן לצינור, ולהעביר את כל התוכן של הצינור לצינור טרי 1.5 מיליליטר. מיד לאחר מכן, להוסיף 80 microliters של מים ללא RNase, 350 microliters של חיץ תיזה, אז 250 microliters של 100% אתנול לכל צינור ומערבבים היטב על ידי צינור. מעבירים כל דגימת 700 מיקרוליטר למחסנית נפרדת של מסנן אלוט שהונחה בצינור איסוף של שני מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה.צנטריפוגה במשך 15 שניות ב 8, 000 פעמים G או יותר ולאחר מכן להשליך את הזרימה דרך. מניחים את אותן מחסניות מסנן אלוטיון לתוך צינורות איסוף חדשים של שני מיליליטר. כדי לשטוף את קרום מחסנית המסנן, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר הכביסה המתון למחסניות הסינון ולצנטריפוגה למשך 15 שניות במהירות של 8,000 גרם ומעלה.השלך את הזרימה דרך. לאחר מכן, באמצעות אותם צינורות איסוף, להוסיף 500 microliters של 80% אתנול מחסניות המסנן. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 8, 000 פעמים G וגדול יותר.השלך הן את צינורות הזרימה והן את צינורות האיסוף, ושמור את עמודי הסיבוב של elution. מניחים כל עמוד ספין אלוטיון לתוך צינור איסוף חדש של שני מיליליטר. צנטריפוגה במהירות מלאה במשך חמש דקות עם המכסה הפתוח על מחסניות מסנן לייבש את קרום עמוד ספין ולמנוע נשיאת אתנול.לאחר השלכת צינורות האיסוף, מניחים כל מחסנית מסנן מיובשת לתוך צינור איסוף טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף 14 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ישירות למרכז קרום מחסנית המסנן. כדי לחמק RNA, צנטריפוגה את הצינורות במשך 60 שניות במלוא המהירות ולאחר מכן להמשיך עם הערכת RNA נוספת והכנה.כעת ניתן לפצל את המדגם המדולדל של גלובין ושמש להכנת ספריות ה- RNA הקטנות והלא-קידוד, כמו גם את ה- mRNA המדולדל בריבו וספריות RNA ארוכות ולא קידוד. לאחר הכנת ספריות ביטוי של דגימות דם שלם מדולדל גלובין ריבו באמצעות פרוטוקול זה, סיכום הפעלת קובץ אלקטרופורזה הראה מדגם ספרייה דלדול גלובין עם מספרי תקינות RNA שנע בין 6.3 ל 9.2. זה הוכיח להיות שיפור בהשוואה למחקרים אחרים שהשתמשו בשיטות דלדול גלובין היו מסוגלים להשיג רק מספרי RIN ב או קרוב לשישה.הפחתת טרום גלובין וירידה שלאחר גלובין של דגימת דם שלמה פורצ'ין יחיד הראו כי 260 עד 280 יחסי ריכוז ננומטר הם מעל או מעל שניים. באמצעות פרוטוקול זה, אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים של דגימות ספריית mRNA של דם שלם מרוקן גלובין ואריבו לפני אסיפת ותיבה הושגו. עבור ספריות mRNA, האלקטרופרוגרמה הייצוגית יש שיא בערך 280 זוגות בסיס.עבור אלקטרופרוגרמות מבוססות שבבים מייצגות ncRNAs קטנות מכילות מגוון פסגות מכ- 100 עד 400 זוגות בסיסים. פסגות בכ- 143 זוגות בסיסים תואמות ל- miRNAs, ופסגות בכ- 153 זוגות בסיסים תואמות ל- piRNAs. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור צינורות קרח מיד שם צוין.בעקבות הליך זה, יש לבצע שיטות אחרות כגון רצף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כגון ביטוי דיפרנציאלי, שינויים אפיגנטיים והשפעתם על מסלולים ותהליכים ביולוגיים. אל תשכח כי עבודה עם ריאגנט פנול-כלורופורם הוא מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון עבודה ברדס אדים יש לנקוט. כמו כן, בעת טיפול בדם שלם או אורגניזמים זיהומיות, העבודה צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגי לפני הפעלת האורגניזם הזיהומי.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...