Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta principalmente dalla da USDA catino AFRI 2013-67015-21236 e in parte da USDA catino AFRI 2015-67015-23216. Questo studio è stato sostenuto in parte da un appuntamento al agricole ricerca servizio ricerca partecipazione programma amministrato dall'Istituto Oak Ridge per scienza e formazione (ORISE) attraverso un accordo tra agenzie tra il dipartimento dell'energia ( DOE) e il dipartimento dell'agricoltura statunitense. ORISE è gestito da Oak Ridge Associated Università DOE contratto no. DE-AC05-06OR2310.
Vorremmo ringraziare il Dr. Kay Faaberg per i cloni infettivi HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier per il suo aiuto con gli animali coinvolti nell'esperimento e Sue Ohlendorf per assistenza di segreteria in preparazione del manoscritto.

Protocolli degli animali sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC).
1. raccolta di sangue suina campioni
<ol><li>Prelevare campioni di sangue in provette di RNA. Raccogliere ~2.5 mL o più, se più grandi tubi di raccolta sono disponibili.</li>
</ol>2. lavorazione del sangue suina campioni
<ol><li>Centrifugare le provette di sangue a 5.020 x g per 10 min a temperatura ambiente (15-25 ° C...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. 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New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Il primo passo fondamentale nel protocollo che rendeva ottimizzato inclusa la procedura di svuotamento della globina aggiunto, che ha permesso di ottenere letture di qualità da campioni di sangue intero. Una delle più grandi limitazioni sull'utilizzo di sangue intero in studi di sequenziamento sono il numero elevato di letture nel campione che mappa alle molecole della globina e ridurre le letture che potrebbero mappe ad altre molecole di interesse18. Pertanto, nell'ottimizzare il protocollo per...

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come un potente strumento per lo studio dei cambiamenti che si verificano a livello genomico di organismi biologici. Preparazione del campione per i metodi di NGS può essere variata a seconda del microrganismo, tipo di tessuto, e soprattutto le domande i ricercatori sono desiderosi di indirizzo. Molti studi sono rivolti a NGS come mezzo per studiare le differenze nell'espressione genica tra gli Stati come individui sani e malati1,2,3,4. Il sequenziamento di prendere posto su una base di intero genoma e consente un ricercatore di catturare la maggior parte, se non tutte, le informazioni genomiche per un marcatore genetico particolare in un momento indicano.
I marcatori più comuni dell'espressione osservati sono il RNA messaggero (mRNA). Le procedure più usate per le librerie durante la preparazione per RNA-seq sono ottimizzate per il recupero di molecole di mRNA mediante l'utilizzo di una serie di purificazioni, frammentazioni e legature5,6. Tuttavia, la decisione su come un protocollo dev'essere eseguito si basa pesantemente sul tipo di campione e le domande circa il campione ha detto. Nella maggior parte dei casi viene estratto il RNA totale; Eppure, non tutte le molecole di RNA sono di interesse e in casi come gli studi di espressione di mRNA eccessivamente abbondanti specie di RNA, come RNA ribosomiale (rRNA) devono essere rimossi per aumentare il numero di trascrizioni rilevabili connesso con i mRNA. Il metodo più popolare e ampiamente utilizzato per rimuovere le molecole di rRNA abbondante è la riduzione delle trascrizioni di poliadenilazione RNA denominato polyA svuotamento7. Questo approccio funziona bene per l'analisi dell'espressione di mRNA come non influenza i trascritti di mRNA. Tuttavia, negli studi che sono interessati a RNA non codificante o virale, deplezione di polyA rimuove anche queste molecole.
Molti studi scelgono di concentrarsi sulla preparazione libreria sequenza di RNA per esaminare sia espressione di mRNA (codifica) o una particolare classe di grande o piccolo RNA non codificanti. Anche se ci sono altre procedure8 come la nostra che consentono la preparazione di campioni doppi, molti studi preparano librerie da campioni separati per studi separati quando disponibile. Per uno studio come il nostro, ciò richiederebbe normalmente più campioni di sangue, aumentando il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. L'obiettivo del nostro studio è stato quello di essere in grado di utilizzare sangue intero da animali per identificare e quantificare le diverse classi di entrambi mRNA e RNA non codificanti espressi tra sano e patogenicità suina virus riproduttivo e respiratorio sindrome (HP-PRRSV) ha sfidato suini9,10 pur avendo solo un campione di sangue intero singolo (2,5 mL) da ogni suino. Per fare questo, abbiamo bisogno di ottimizzare l'estrazione tipica e protocolli di creazione di librerie per generare i dati appropriati per consentire analisi di mRNA e di non-codificanti RNA (ncRNA) espressione11 da un singolo campione.
Ciò ha richiamato la necessità di un protocollo che ha permesso per mRNA e analisi di RNA non codificante perché il kit standard disponibili e metodi per la creazione di estrazione del RNA e la biblioteca sono stati destinati principalmente al mRNA e utilizzano una deplezione di poly-A passaggio12. Questo passaggio avrebbe reso impossibile il recupero di RNA non codificante o trascrizioni virali dal campione. Di conseguenza, era necessario un metodo ottimizzato che ha permesso per estrazione di RNA totale senza svuotamento polyA campione. Il metodo presentato in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l'uso di sangue intero come tipo di campione e di costruire librerie di sequenziamento per sia mRNA che ncRNAs di piccole e grandi dimensioni. Il metodo è stato ottimizzato per consentire l'analisi di RNA non codificanti rilevabili tutti così come mantenere il RNA virale per successive indagini13. In tutto, il nostro protocollo di preparazione libreria ottimizzata consente per l'indagine di più molecole di RNA da un campione di sangue intero singolo.
L'obiettivo generale dietro l'uso di questo metodo era quello di sviluppare un processo che ha permesso per la raccolta di non-codificanti RNA sia mRNA da un campione di sangue intero. Questo ci permette di avere mRNA, ncRNA e RNA virale per ogni animale nel nostro studio provengono da un singolo campione9. Questo, in definitiva, consente più scientifico scoperta senza costi aggiuntivi di animale e dà un quadro più completo dell'espressione di ogni singolo campione. Il metodo descritto consente per l'esame dei regolatori dell'espressione genica, nonché a consentire per il completamento degli studi correlativi confrontando entrambi mRNA e l'espressione di RNA non codificanti utilizzando un campione di sangue intero singolo. Il nostro studio ha utilizzato questo protocollo per esaminare i cambiamenti nell'espressione genica e possibili regolatori epigenetici in viralmente infettato 9 - settimana-vecchi maschi maiali commerciali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
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identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

L'avvento di sempre più potenti e innovative tecniche di sequenziamento di generazione successiva ha aperto nuove strade nella capacità di esaminare l'espressione genica sottostanti relazionato ai processi biologici di interesse. Queste innovazioni non solo permettono ai ricercatori di osservare l'espressione delle sequenze di mRNA che codificano per geni che funzione cellulare di effetto, ma le molecole di RNA (ncRNA) non codificanti che rimangono non tradotte, ma ancora hanno anche funzioni di regolamentazione. Anche se i ricercatori hanno la possibilità di osservare l'espressione di mRNA e di ncRNA, era consuetudine per uno studio di concentrarsi su uno o l'altro. Tuttavia, quando gli studi sono interessati nell'espressione di mRNA e di ncRNA, molte volte usano campioni separati per esaminare o codifica o non-codificazione RNAs a causa della differenza nelle preparazioni di biblioteca. Questo può portare alla necessità di più campioni che può aumentare il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. Inoltre, può causare i ricercatori a decidere di preparare i campioni per sola analisi, solitamente il mRNA, limitando il numero di domande biologiche che possono essere studiate. Tuttavia, ncRNAs estendersi su più classi con ruoli regolatori che espressione di mRNA di effetto. Perché ncRNA sono importanti per i processi biologici fondamentali e disordine di questi processi in durante l'infezione, possono, pertanto, fare obiettivi attraenti per terapeutica. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo modificato per la generazione mRNA e non codificanti RNA librerie di espressione, tra cui RNA virale, da un singolo campione di sangue intero. Ottimizzazione del presente protocollo, migliorato purezza RNA, aumentata di legatura per recupero di RNAs metilato e omesso selezione di dimensioni, per consentire la cattura di altre specie di RNA.

I campioni rappresentativi nel nostro studio sono la globina e campioni di sangue intero di ribo-vuotati. Il risultato rappresentativo del protocollo è costituito da un esempio di libreria impoverito della globina con un numero di integrità di RNA (RIN) sopra 7 (Figura 1a) e rapporti di concentrazione di 260/280 nm pari o superiore a 2 (Figura 1b e c 1). Convalida dei risultati del campione è ...

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Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di codifica (mRNA) e non codificanti (ncRNA) globina ridotta RNA-seq librerie da un campione di sangue intero singolo.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nello studio delle interazioni ospite-patogeno consentendo l'esame dell'espressione codificante, non codificante e dell'RNA virale coinvolta nella risposta dell'amminoacido ospite e di come un agente patogeno può influenzare le funzioni biologiche dell'ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che presenta un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di mRNA e RNA non codificante da librerie RNAseq ridotte di globina da un singolo campione di sangue intero. A dimostrare la tecnica sarà Sarah Anderson, una tecnico del mio laboratorio.Inizia centrifugando le provette del sangue a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere otto millilitri di acqua priva di RNasi al pellet. Chiudere i tubi e vortice il pellet fino a quando non viene visibilmente sciolto, quindi centrifugare i tubi a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente per recuperare il pellet.Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, scartare il supernatante e salvare il pellet. Per isolare l'RNA totale, iniziare pipettando 300 microlitri di tampone legante di lisi al pellet. Dopo il vortice, trasferire la miscela da ogni tubo a un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri etichettato.Aggiungere 30 microlitri di additivo omogeneizzato dal kit di isolamento miRNA. Vortice i tubi e posizionare sul ghiaccio per 10 minuti. Lavorando in una cappa aspirante, rimuovere i tubi dal ghiaccio e aggiungere 300 microlitri del reagente cloroformio fenolo acido dal kit e dal vortice per mescolare di nuovo.Dopo aver centrifugato a 10.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura la fase acquosa in un nuovo tubo. In base alla quantità di recupero acquoso rispetto al passaggio precedente, aggiungere 1,25 volte il volume di etanolo al 100% al fago acquoso in ogni tubo e pipetta da mescolare. Preparare tubi di raccolta freschi contenenti una cartuccia filtrante per ogni campione.Pipetta circa 675 microlitri della miscela lysate-etanolo sulla cartuccia del filtro. Centrifugare brevemente a 10.000 volte G per passare il liquido attraverso il filtro. Scartare il flusso.Ripetere la miscela lysate-etanolo aggiungendo al filtro e alla centrifugazione fino a quando non è stata completamente utilizzata. Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio uno dal kit alla cartuccia filtrante. Centrifugare brevemente per tirare la soluzione attraverso i filtri.Scartare il flusso e conservare le stesse cartucce filtranti e i tubi di raccolta. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavaggio due-tre a ciascuna cartuccia filtrante. Dopo aver centrifugato di nuovo, scartare il flusso e ripetere il passaggio di lavaggio.Per rimuovere qualsiasi liquido residuo dalle cartucce filtranti, ruotarle di altri 60 secondi. Trasferire le cartucce in tubi di raccolta freschi. Aggiungere 100 microlitri di acqua preriscaldata senza nucleasi di 95 gradi Celsius al centro di ogni cartuccia filtrante.Centrifugare le cartucce per circa 20-30 secondi alla centrifuga da tavolo alla massima velocità. Per preformare l'ibridazione con oligo di riduzione della globina, prima denaturare l'RNA aggiungendo ogni campione estratto in un tubo di reazione senza nucleasi a parete sottile da 0,2 millilitri. Posizionare i tubi in un ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti.Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio per ottenere una qualità ottimale dell'RNA. Mentre i tubi si stanno raffreddando, preparare 400 microlitri di miscela di oligo di riduzione della globina 10X e tampone di ibridazione oligo 10X in un tubo a due millilitri. Per rendere la miscela di ibridazione, aggiungere sei microgrammi di campione di RNA, due microlitri della miscela di oligo di riduzione della globina 10X, un microlitro di tampone di ibridazione oligo 10X e acqua priva di nucleasi a un volume finale di 10 microlitri per ogni tubo di reazione a parete sottile a parete sottile da 0,2 millilitri.Posizionare i tubi nel ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio. Per eseguire la digestione RNasi H, diluire prima la RNasi H 10X in una X RNasi H con un tampone X RNasi H.Preparare la miscela di reazione RNasi H combinando due microlitri di tampone di RNasi 10X, un microlitro di inibitore della RNasi e due microlitri di una X RNasi H e cinque microlitri di acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione RNasi H ai campioni di ibridazione di riduzione della globina e mescolare accuratamente. Digerire questa reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi raffreddare a quattro gradi Celsius.Interrompere la digestione aggiungendo un microlitro di EDTA molare 0,5 al tubo e trasferire l'intero contenuto del tubo in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Subito dopo, aggiungere 80 microlitri di acqua priva di RNasi, 350 microlitri di tampone di lisi, quindi 250 microlitri di etanolo al 100% a ciascun tubo e mescolare bene mediante pipettazione. Trasferire ogni campione da 700 microlitri in una cartuccia di filtro di eluizione separata posta in un tubo di raccolta a due millilitri per raccogliere il flusso.Centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore e quindi scartare il flusso. Posizionare le stesse cartucce filtranti di eluizione in nuovi tubi di raccolta a due millilitri. Per lavare le membrane della cartuccia del filtro, aggiungere 500 microlitri del tampone di lavaggio delicato alle cartucce filtranti e centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore.Scartare il flusso. Quindi, utilizzando gli stessi tubi di raccolta, aggiungere 500 microlitri di 80%etanolo alle cartucce filtranti. Centrifuga per due minuti a 8.000 volte G e superiore.Scartare entrambi i tubi flow-through e collection e salvare le colonne di rotazione dell'eluizione. Posizionare ogni colonna di rotazione dell'eluizione in un nuovo tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga a tutta velocità per cinque minuti con il coperchio aperto sulle cartucce filtranti per asciugare le membrane della colonna di rotazione e prevenire il riporto dell'etanolo.Dopo aver scartato i tubi di raccolta, posizionare ogni cartuccia di filtro essiccata in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 14 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente al centro della membrana della cartuccia filtrante. Per elutare l'RNA, centrifugare i tubi per 60 secondi a tutta velocità e quindi continuare con ulteriori valutazione e preparazione dell'RNA.Il campione impoverito di globina può ora essere diviso e utilizzato per preparare le piccole librerie di RNA non codificanti, così come l'mRNA impoverito di ribo e le lunghe librerie di RNA non codificanti. Dopo aver preparato le librerie di espressioni dei campioni di sangue intero impoveriti di globina e ribo-impoveriti utilizzando questo protocollo, il riepilogo dell'esecuzione del file di elettroforesi ha mostrato un campione di libreria impoverito di globina con numeri di integrità dell'RNA che variava da 6,3 a 9,2. Questo si dimostrò un miglioramento rispetto ad altri studi che usavano metodi di esaurimento della globina e erano in grado di ottenere numeri RIN solo a sei o quasi.La riduzione della pre-globina e la post-globina di un singolo campione di sangue intero suino hanno mostrato che i rapporti di concentrazione da 260 a 280 nanometri sono o superiori a due. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti elettroferogrammi a base di chip di campioni di libreria di mRNA di sangue intero impoveriti di globina e ribo prima della messa in comune e del sequenziamento. Per le librerie di mRNA, l'elettroferogramma rappresentativo ha un picco di circa 280 coppie di basi.Per i piccoli ncRNA gli elettroferogrammi rappresentativi basati su chip contengono un intervallo di picchi da circa 100 a 400 coppie di basi. I picchi a circa 143 coppie di basi corrispondono ai miRNA, e i picchi a circa 153 coppie di basi corrispondono ai piRNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare ai tubi di ghiaccio immediatamente dove indicato.Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione dovrebbero essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'espressione differenziale, i cambiamenti epigenetici e il loro effetto sulle vie e sui processi biologici. Non dimenticare che lavorare con il reagente fenolo-cloroformio è estremamente pericoloso e devono essere prese precauzioni come lavorare in una cappa aspirante. Inoltre, quando si maneggiano sangue intero o organismi infettivi, il lavoro deve essere eseguito in un armadietto di sicurezza biologico prima di un'attivazione dell'organismo infettivo.

Research

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Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

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Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

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Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

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