Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Dette arbeidet var hovedsakelig støttes av den av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne studien ble støttet delvis av utnevnelsen Agricultural Research Service deltakelse forskningsprogrammet administrert av Oak Ridge Institutt for vitenskap og utdanning (ORISE) gjennom en interagency avtale mellom US Department of Energy ( DOE) og det amerikanske Landbruksdepartementet. ORISE administreres av Oak Ridge tilknyttet universiteter DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gjerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smittsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier hennes hjelp med dyr involvert i forsøket, og Sue Ohlendorf sekretær hjelp med utarbeidelse av manuskriptet.

Dyr protokollene ble godkjent av National Animal sykdom Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care og bruk komiteen.
1. innsamling av svin blod prøver
<ol><li>Samle blodprøver i RNA rør. Samle ~2.5 mL eller mer hvis større samling rør.</li>
</ol>2. behandling av svin blod prøver
<ol><li>Sentrifuge blod rør 5,020 x g i 10 min ved romtemperatur (15-25 ° C). Hvis behandlingen frosne prøvene ruge rør ved romtemperatur for et minimum på 2 tim...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Det første kritiske trinnet i protokollen som gjorde det optimalisert inkludert lagt globin uttømming trinnene, som gjorde det mulig å få kvalitet leser fra hele blodprøver. En av de største begrensningene på bruk fullblod i sekvensering studier er det høye antallet leser i utvalget som tilordnes globin molekyler og redusere lest som kan tilordnes til andre molekyler rundt18. Derfor optimalisere protokollen for vår eksempel type, trengte vi å innlemme en globin uttømming trinn for å si...

Neste generasjons sekvensering (NGS) har dukket opp som et kraftig verktøy for etterforskningen av endringene som oppstår på genomisk nivå biologiske organismer. Eksempel forberedelse til NGS metoder kan endres avhengig av organismen, vev type, og enda viktigere spørsmålene forskerne er opptatt av å adresse. Mange studier har slått til NGS som studerer forskjellene i genekspresjon mellom stater som sunn og syke individer1,2,3,4. Sekvensering ta plass på hele genomet basis og lar forsker å fange mest, om ikke alle, genomisk informasjon for en bestemt genetisk markør gangen pek.
Den vanligste markører uttrykksformer observert er messenger RNAs (mRNAs). Mest brukte prosedyrene for fikse biblioteker for RNA-seq er optimalisert for utvinning av mRNA molekyler ved hjelp av en rekke renselser, fragmentations og ligations5,6. Men avhenger beslutningen om hvordan en protokoll er utført svært mye på prøvetype og spørsmålene som stilles om sa prøven. I de fleste tilfeller trekkes totale RNA; Likevel, ikke alle RNA molekyler er av interesse og i slike tilfeller mRNA uttrykk studier altfor rikelig RNA arter, som ribosomal RNAs (rRNA) må fjernes for å øke antall synlig transkripsjoner knyttet til mRNAs. Den mest populære og brukte metoden for å fjerne rikelig rRNA molekylene er reduksjonen av polyadenylated RNA transkripsjoner kalles polyA uttømming7. Denne tilnærmingen fungerer godt for analyse av mRNA uttrykk som påvirker mRNA transkripsjoner. Men i studier som er interessert i ikke-koding eller viral RNAs, fjerner polyA uttømming også disse molekyler.
Mange studier vil fokusere på RNA sekvens biblioteket utarbeidelse undersøke enten mRNA uttrykk (koding) eller en bestemt klasse av små eller store ikke-koding. Selv om det er andre prosedyrer8 som vår at to utvalg forberedelse, forberede mange studier biblioteker fra separate prøver separate studier når tilgjengelig. For en studie som vår krever dette vanligvis flere blodprøver øke tid, forbruksvarer og dyr stress. Målet med vår studie var å kunne bruke hele blod fra dyr til å identifisere og telle de forskjellige klassene av både mRNA og ikke-koding RNA uttrykt mellom sunn og svært patogene svin reproduksjons- og åndedretts syndrome virus (HP-PRRSV) utfordret griser9,10 til tross for at bare en enkelt hele blodprøve (2.5 mL) fra hver gris. For dette, måtte vi optimalisere typisk utvinning og biblioteket etablering protokoller generere riktige data å tillate analyse av både mRNA og ikke-koding RNA (ncRNA) uttrykk11 fra et enkelt utvalg.
Dette bedt om et behov for en protokoll som er tillatt for mRNA og ikke-koding RNA analyse fordi tilgjengelig standard kits og metoder for oppretting av RNA-utvinning og biblioteket var ment hovedsakelig for mRNA og bruke en poly-A uttømming trinn12. Denne steg ville ha gjort det umulig å gjenopprette ikke-koding RNA eller viral transkripsjoner fra utvalget. Derfor en optimalisert metode var nødvendig som tillatt for totale RNA utvinning uten prøve polyA uttømming. Metoden presentert i dette manuskriptet er blitt optimert å tillate bruk av fullblod som en prøve og bygge sekvensering biblioteker for både mRNA og ncRNAs av små og store størrelser. Metoden har blitt optimalisert for å tillate for analyse av alle oppdages ikke-koding RNAs samt beholde viral RNAs for senere undersøkelser13. I alle tillater våre optimalisert biblioteket forberedelse protokollen for etterforskningen av flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede målet bak bruken av denne metoden var å utvikle en prosess som er tillatt for innsamling av både ikke-koding RNA og mRNA fra et utvalg av hele blod. Dette tillater oss å ha mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vår studie fra en enkelt prøve9. Dette til slutt gir mer vitenskapelige funn uten tilleggskostnader dyr og gir et mer komplett bilde av uttrykk for hver enkelte eksempel. Metoden beskrevet tillater undersøkelse av regulatorer av genuttrykk samt tillater gradering av correlative sammenligne begge mRNA og ikke-koding RNA uttrykk ved hjelp av en enkelt hele blodprøve. Vår studie brukt denne protokollen til å undersøke endringer i genuttrykk og mulig epigenetic regulatorer i virally infiserte 9 - uke gamle mannlige kommersielle griser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Advent innovativ og stadig kraftigere neste generasjons sekvensering teknikker har åpnet nye muligheter i muligheten til å undersøke det underliggende genuttrykk knyttet til biologiske prosesser rundt. Disse nyvinningene gjør ikke forskere å observere uttrykk fra mRNA sekvensene som kode for gener som effekten cellulære funksjoner, men også ikke-koding RNA (ncRNA) molekyler som forbli uoversatt, men likevel har regulatoriske funksjoner. Selv om forskere har muligheten til å observere både mRNA og ncRNA, har det vært vanlig for en studie for å fokusere på ett eller annet. Men når studier er interessert i både mRNA og ncRNA uttrykk, bruker mange ganger de separate prøver for å undersøke koding eller ikke-koding RNAs på grunn av forskjellen i biblioteket forberedelser. Dette kan føre til behovet for flere prøver som kan øke tid, forbruksvarer og dyr stress. I tillegg kan det føre forskerne å avgjøre å forberede prøver eneste analyse, vanligvis mRNA, begrense antall biologiske spørsmål som kan bli undersøkt. Men ncRNAs spenner over flere klasser med regulatoriske roller effekt mRNA uttrykket. Fordi ncRNA er viktig grunnleggende biologiske prosesser og forstyrrelse av disse prosessene i under infeksjon, kan de derfor gjøre attraktiv mål for therapeutics. Dette manuskriptet viser en endret protokoll for generasjon mRNA og ikke-koding RNA uttrykk biblioteker, inkludert viral RNA, fra et enkelt utvalg av fullblod. Optimalisering av denne protokollen, forbedret RNA renhet, økt ligation for utvinning av denaturert RNAs og utelatt størrelse utvalg, for å tillate fangst av flere RNA arter.

De representative utvalgene i vår undersøkelse er globin og ribo-utarmet hele blodprøver. Representant utfallet av protokollen består av en globin utarmet biblioteket prøve med en RNA integritet nummer (RIN) over 7 (figur 1en) og 260/280 nm konsentrasjon forholdstall på eller over 2 (figur 1b og 1 c). Validering av prøven utfallet ble utført med spektrofotometer for å gi endelige konsent...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Her presenterer vi en protokollen optimert for behandling av koding (mRNA) og ikke-koding (ncRNA) globin redusert RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.

Identifikasjon av koding og ikke-koding RNA klasser uttrykt i svin fullblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i studien av vertspatogeninteraksjoner ved å tillate undersøkelse av koding, ikke-koding og viral RNA-uttrykk involvert i vertens aminorespons, samt hvordan et patogen kan påvirke vertens biologiske funksjoner. Den største fordelen med denne teknikken er at den presenterer en protokoll optimalisert for behandling av mRNA og ikke-koding RNA fra globin-reduserte RNAseq biblioteker fra en enkelt full blodprøve. Å demonstrere teknikken vil være Sarah Anderson, en tekniker fra laboratoriet mitt.Start med å sentrifugere blodrørene ved 50 20 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur. Arbeide i et biologisk sikkerhetsskap, etter å ha fjernet det supernatante, tilsett åtte milliliter RNase-fritt vann til pelleten. Lukk rørene og vortex pelleten til den er synlig oppløst, og sentrifug rørene ved 50 20 ganger G i 10 minutter ved romtemperatur for å gjenopprette pelleten.Arbeide i et biologisk sikkerhetsskap, kast supernatant og lagre pellet. For å isolere total RNA, start med pipettering 300 mikroliter lysisbindingsbuffer til pelleten. Etter vortexing, overfør blandingen fra hvert rør til et nytt merket 1,5 milliliter sentrifugerør.Tilsett 30 mikroliter homogene tilsetningsstoffer fra miRNA-isolasjonssettet. Vortex rørene og legg på isen i 10 minutter. Arbeide i en røykhette, fjern rørene fra is og tilsett 300 mikroliter av syrefenolklorformreagensen fra settet og virvelen igjen for å blande.Etter sentrifugering ved 10.000 ganger G i fem minutter ved romtemperatur, fjern forsiktig vandig fase til et nytt rør. Basert på mengden vandig utvinning fra forrige trinn, legg til 1,25 ganger volumet av 100% etanol til vandig phage i hvert rør og pipette å blande. Klargjør ferske oppsamlingsrør som inneholder en filterkassett for hver prøve.Pipette ca 675 mikroliter av lysat-etanol blandingen på filterpatronen. Sentrifuge kort ved 10 000 ganger G for å passere væske gjennom filteret. Kast gjennomstrømningen.Gjenta lysate-etanolblandingen som legger til filteret og sentrifugasjonen til den er helt brukt. Tilsett 700 mikroliter vaskeoppløsning fra settet til filterpatronen. Sentrifuge kort for å trekke løsningen gjennom filtrene.Kast gjennomstrømningen og behold de samme filterkassettene og oppsamlingsrørene. Tilsett 500 mikroliter vaskeoppløsning to-tre i hver filterkassett. Etter sentrifugering igjen, kast gjennomstrømningen og gjenta vasketrinnet.Hvis du vil fjerne restvæske fra filterpatronene, snurrer du dem ytterligere 60 sekunder. Overfør patronene til friske oppsamlingsrør. Tilsett 100 mikroliter på 95 grader Celsius forvarmet kjernefritt vann til midten av hver filterpatron.Sentrifuger patronene i ca. 20 til 30 sekunder ved bordplaten sentrifuge ved maksimal hastighet. For å forhåndsforme hybridisering med globinreduksjon oligos, først denature RNA ved å legge hver ekstrahert prøve i en 0,2 milliliter tynnvegget kjerner-fri reaksjonsrør. Plasser rørene i en termisk cycler på 70 grader Celsius i to minutter.Deretter plasserer du umiddelbart rørene på isen for å oppnå optimal RNA-kvalitet. Mens rørene kjøler, klargjør du 400 mikroliter med 10X globinreduksjon oligo mix og 10X oligo hybridiseringbuffer i et to milliliter rør. For å gjøre hybridiseringsblandingen, legg til seks mikrogram RNA-prøve, to mikroliter av 10X globinreduksjon oligo mix, en mikroliter på 10X oligo hybridiseringbuffer, og kjernefritt vann til et endelig volum på 10 mikroliter til hver 0,2 milliliter tynnvegget, nukleasefri reaksjonsrør.Plasser rørene i den termiske cycleren ved 70 grader Celsius i to minutter. Deretter plasserer du umiddelbart rørene på is. For å utføre RNase H fordøyelsen, først fortynne 10X RNase H til en X RNase H med en X RNase H buffer.Forbered RNase H reaksjonsblanding ved å kombinere to mikroliter med 10X RNase buffer, en mikroliter RNase-hemmer og to mikroliter av en X RNase H, og fem mikroliter kjernefritt vann til et totalt volum på 10 mikroliter. Tilsett 10 mikroliter av RNase H reaksjonsblandingen til globinreduksjonshybridiseringsprøvene og bland godt. Fordøy denne reaksjonen ved 37 grader Celsius i 10 minutter og deretter avkjøles til fire grader Celsius.Stopp fordøyelsen ved å legge til en mikroliter på 0,5 molar EDTA til røret, og overfør hele innholdet i røret til et friskt 1,5 milliliter rør. Umiddelbart etter det, tilsett 80 mikroliter RNase-fritt vann, 350 mikroliter lysisbuffer, deretter 250 mikroliter med 100% etanol til hvert rør og bland godt ved pipettering. Overfør hver 700 mikroliterprøve til en separat elutionfilterpatron plassert i to milliliter oppsamlingsrør for å samle gjennomstrømningen.Sentrifuge i 15 sekunder ved 8 000 ganger G eller høyere, og kast deretter gjennomstrømningen. Plasser de samme elutionfilterpatronene i nye to milliliter oppsamlingsrør. For å vaske filterpatronmembranene, tilsett 500 mikroliter av den milde vaskebufferen i filterkassettene og sentrifugen i 15 sekunder ved 8 000 ganger G eller høyere.Kast gjennomstrømningen. Deretter, ved hjelp av de samme oppsamlingsrørene, legger du til 500 mikroliter med 80% etanol i filterpatronene. Sentrifuge i to minutter ved 8, 000 ganger G og høyere.Kast både gjennomstrømnings- og oppsamlingsrørene, og lagre elutionspinnkolonnene. Plasser hver elutionspintkolonne i et nytt to milliliter oppsamlingsrør. Sentrifuge i full hastighet i fem minutter med det åpne lokket på filterpatroner for å tørke spin-kolonnemembranene og forhindre etanoloverførning.Etter at oppsamlingsrørene er kastet, plasserer du hver tørkede filterkassett i et friskt oppsamlingsrør på 1,5 milliliter. Tilsett 14 mikroliter RNasefritt vann direkte til midten av filterpatronmembranen. For å elute RNA, sentrifuger rørene i 60 sekunder med full hastighet og fortsett deretter med ytterligere RNA-vurdering og forberedelse.Den globin-utarmet prøven kan nå deles og brukes til å forberede de små, ikke-koding RNA biblioteker samt ribo-utarmet mRNA og lange, ikke-koding RNA biblioteker. Etter å ha forberedt uttrykksbiblioteker av globin-utarmet og ribo-utarmet fullblodsprøver ved hjelp av denne protokollen, elektroforese filkjøring sammendrag viste en globin-utarmet bibliotek prøve med RNA integritet tall som varierte fra 6,3 til 9,2. Dette viste seg å være en forbedring sammenlignet med andre studier som brukte globinuttømmingsmetoder og bare var i stand til å oppnå RIN-tall på eller nær seks.Pre-globin-reduksjon og post-globin-reduksjon av en enkelt svin full blodprøve viste at 260 til 280 nanometer konsentrasjonsforhold er på eller over to. Ved hjelp av denne protokollen ble chipbaserte elektrofrogrammer av globin- og ribo-utarmet mRNA-bibliotekprøver i fullblod før pooling og sekvensering oppnådd. For mRNA-bibliotekene har det representative elektroferogramet en topp på ca. 280 basispar.For de små ncRNAs representative chipbaserte elektroferogrammer inneholder en rekke topper fra ca. 100 til 400 basispar. Topper på ca. 143 basispar tilsvarer miRNAs, og topper på ca. 153 basispar tilsvarer piRNAer. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å isrør umiddelbart der det er angitt.Etter denne prosedyren bør andre metoder som neste generasjons sekvensering utføres for å svare på flere spørsmål som differensialuttrykk, epigenetiske endringer og deres effekt på biologiske veier og prosesser. Ikke glem at det å arbeide med fenolklorformreagens er ekstremt farlig, og forholdsregler som å jobbe i en røykhette bør tas. Også ved håndtering av fullblod eller smittsomme organismer, bør arbeidet utføres i et biologisk sikkerhetsskap før aktivering av den smittsomme organismen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Telling av Store perifert blod leukocytter populasjoner multisenter kliniske studier med en Fullblod fenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Utarbeidelse av en blodkultur Pellet for Rapid Bakteriell Identifisering og antibiotika resistenstesting

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler fra Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Én celle analyse av Immunophenotype og cytokin produksjon i eksterne fullblod via masse cytometri

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...