Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado principalmente pela pelo USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 e em parte pelo USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Este estudo foi suportado em parte por uma nomeação para o agrícola pesquisa serviço programa de participação de pesquisa administrada pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação (ORISE) através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia ( DOE) e o departamento de agricultura dos EUA. ORISE é gerido pela Oak Ridge Associated universidades sob contrato DOE não. DE-AC05-06OR2310.
Gostaríamos de agradecer o Dr. Kay Faaberg para os clones HP-PRRSV infecciosos, Dr. Susan Brockmeier por sua ajuda com animais envolvidos no experimento e Sue Ohlendorf para secretariado em preparação do manuscrito.

Protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado do Animal centro de doença Animal nacional (USDA-ARS-NADC).
1. coleta de sangue de porco amostras
<ol><li>Colete amostras de sangue em tubos de RNA. Colete ~2.5 mL ou mais, se a maior coleção de tubos está disponíveis.</li>
</ol>2. processamento de sangue de porco amostras
<ol><li>Centrifuga os tubos de sangue em 5.020 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (15-25 ° C). Se amo...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. 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New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

O primeiro passo crítico no protocolo que foi otimizado incluiu as etapas de depleção de globina adicionado, que tornou possível obter leituras de qualidade de amostras de sangue total. Uma das maiores limitações sobre o uso de sangue total em estudos de sequenciamento são o elevado número de leituras na amostra que irão mapear para moléculas de globina e reduzir as leituras que poderiam mapear para outras moléculas de interesse18. Portanto, na otimização do protocolo para o nosso tip...

Sequenciamento de próxima geração (NGS) emergiu como uma poderosa ferramenta para a investigação das alterações que ocorrem no nível genômico de organismos biológicos. Preparação da amostra para métodos NGS pode variar dependendo do organismo, tipo de tecido, e mais importante as perguntas os pesquisadores fazem questão de endereço. Muitos estudos se voltaram para NGS como um meio de estudar as diferenças na expressão do gene entre Estados como indivíduos sãos e doentes,1,2,3,4. O sequenciamento tomar lugar numa base de genoma inteiro e permite que um pesquisador capturar a maioria, se não todos, a informação genômica para um marcador genético específico cada vez apontam.
Os marcadores mais comuns de expressão observadas são os RNAs mensageiro (mRNAs). Os procedimentos mais utilizados para preparar as bibliotecas para RNA-seq são otimizados para a recuperação das moléculas de mRNA através do uso de uma série de purificações, fragmentações e ligadura5,6. No entanto, a decisão sobre como um protocolo é para ser realizado depende muito do tipo de amostra e as questões sendo colocadas sobre amostra disse. Na maioria dos casos, o RNA total é extraído; ainda, nem todas as moléculas de RNA são de interesse e em casos tais como estudos de expressão de RNAm excessivamente abundantes espécies de RNA, como RNA ribossómico (rRNA) precisam ser removidos para aumentar o número de transcrições detectáveis associado com os mRNAs. O método mais popular e amplamente utilizado para a remoção das moléculas de RNA ribossomal abundante é a redução do polyadenylated RNA transcrições referidas como polyA depleção7. Essa abordagem funciona bem para a análise da expressão do mRNA como não afeta as transcrições do mRNA. No entanto, em estudos que estão interessados em RNAs virais ou não-codificantes, polyA depleção também remove essas moléculas.
Muitos estudos optar por focar a preparação de biblioteca de sequência de RNA para examinar qualquer expressão de RNAm (codificação) ou uma determinada classe de RNA não-codificante de pequena ou grande. Apesar de existirem outros procedimentos8 como a nossa que permitem a preparação da amostra dupla, muitos estudos preparem bibliotecas de amostras separadas para estudos separados quando disponível. Para um estudo como o nosso, isso normalmente exigiria várias amostras de sangue, aumentando o tempo, consumíveis e estresse animal. O objetivo do nosso estudo era ser capaz de usar todo o sangue de animais para identificar e quantificar as diferentes classes de ambos mRNA e RNA não-codificante expressas entre saudável e altamente patogénica reprodutiva suína e o vírus da síndrome respiratória (HP-PRRSV) desafiou os porcos9,10 , apesar de ter apenas uma unidade de sangue total de amostra (2,5 mL) de cada porco. Para isso, precisávamos para otimizar a extração típica e protocolos de criação de biblioteca para gerar os dados apropriados para permitir a análise de mRNA e não-codificantes do RNA (ncRNA) expressão11 de uma única amostra.
Isto levou a uma necessidade de um protocolo que permitiu mRNA e a análise de RNA não-codificante porque os kits de padrão disponíveis e métodos para criação de biblioteca e extração de RNA-destinavam-se principalmente para mRNA e usam uma depleção de poli-A etapa12. Esta etapa que tornaram impossível recuperar de RNA não-codificante ou transcrições virais da amostra. Portanto, um método otimizado era necessário que permitido para extração de RNA total sem esgotamento de polyA amostra. O método apresentado neste manuscrito foi otimizado para permitir o uso de sangue como um tipo de amostra e construir bibliotecas de sequenciamento para mRNA e ncRNAs de tamanhos pequenos e grandes. O método foi otimizado para permitir a análise de todos os RNAs detectáveis não-codificantes, bem como reter RNAs virais para posterior investigação13. Ao todo, nosso protocolo de preparação de biblioteca otimizado permite para a investigação de várias moléculas de RNA de uma amostra da unidade de sangue total.
O objetivo geral por trás o uso desse método foi desenvolver um processo que permitiu para a coleção de não-codificantes do RNA e mRNA de uma amostra de sangue total. Isto nos permite ter mRNA, ncRNA e RNA viral para cada animal em nosso estudo, originário de uma única amostra9. Isto, em última análise, permite a descoberta científica mais sem custos adicionais de animais e dá uma imagem mais completa da expressão de cada amostra individual. O método descrito permite o exame dos reguladores da expressão gênica, bem como permitindo a conclusão dos estudos correlativos comparando ambos mRNA e expressão de RNA não-codificante usando uma amostra da unidade de sangue total. Nosso estudo utilizou este protocolo para examinar as alterações na expressão gênica e possíveis epigenéticos reguladores em Viralmente infectado comerciais de suínos machos 9 - semana de idade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

O advento da inovadora e cada vez mais poderosas técnicas de sequenciamento próxima geração abriu novos caminhos para a capacidade de examinar a expressão de gene subjacente relacionada a processos biológicos de interesse. Essas inovações não só permitem que os pesquisadores a observar a expressão das sequências de mRNA que codificam genes essa função celular do efeito, mas também as moléculas de RNA (ncRNA) não-codificantes que permanecem untranslated, mas ainda têm funções reguladoras. Embora os pesquisadores têm a capacidade de observar a expressão tanto do mRNA e ncRNA, tem sido habitual para um estudo para se concentrar em um ou outro. No entanto, quando estudos estão interessados na expressão tanto do mRNA e ncRNA, muitas vezes eles usam amostras separadas para examinar ou codificação ou não-codificantes RNAs devido à diferença de preparações de biblioteca. Isso pode levar à necessidade de mais amostras que pode aumentar o tempo, consumíveis e estresse animal. Além disso, pode causar pesquisadores decidir para preparar amostras para análise de apenas um, geralmente o mRNA, limitando o número de questões biológicas que podem ser investigados. No entanto, ncRNAs abrangem várias classes com funções reguladoras aquela expressão de RNAm de efeito. Porque ncRNA são importantes para processos biológicos fundamentais e desordem destes processos em durante a infecção, eles podem, portanto, possam ser alvos para terapêutica. Este manuscrito demonstra um protocolo modificado para a geração do mRNA e não-codificantes do RNA expressão bibliotecas, incluindo o RNA viral, de uma única amostra de sangue total. Otimização do presente protocolo, melhorou a pureza do RNA, aumentou a ligadura para recuperação de RNAs metilados e omitido a seleção de tamanho, para permitir a captura de mais espécies de RNA.

Em nosso estudo, as amostras representativas são a globina e amostras de sangue de todo ribo-esgotada. O resultado representativo do protocolo consiste em uma amostra de biblioteca empobrecido de globina com um número de integridade do RNA (RIN) acima de proporções de concentração de nm 260/280 igual ou superior a 2 (Figura 1b e 1C) e 7 (Figura 1um). Validação dos resultados da amostra fo...

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Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para o processamento de codificação (mRNA) e não-codificantes (ncRNA) globina reduzido RNA-seq bibliotecas de uma amostra da unidade de sangue total.

Identificação de codificação e Classes de RNA não-codificante expressa em suínos, sangue total

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo das interações hospedeiro-patógeno, permitindo o exame da expressão de codificação, não codificação e RNA viral envolvida na resposta aminosa hospedeira, bem como como um patógeno pode afetar as funções biológicas do hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é que ela apresenta um protocolo otimizado para o processamento de RNA mRNA e não codificação de bibliotecas RNAseq reduzidas de globin de uma única amostra de sangue. Demonstrando a técnica estará Sarah Anderson, uma técnica do meu laboratório.Comece por centrifugar os tubos de sangue a 50 20 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Trabalhando em um gabinete de segurança biológica, depois de remover o supernaspe, adicione oito mililitros de água sem RNase à pelota. Feche os tubos e o vórtice da pelota até que esteja visivelmente dissolvida, depois centrifufique os tubos a 50 20 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente para recuperar a pelota.Trabalhando em um armário de segurança biológica, descarte o supernasce e salve a pelota. Para isolar o RNA total, comece por tubos de 300 microliters de tampão de ligação de lise à pelota. Após o vórtice, transfira a mistura de cada tubo para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro rotulado.Adicione 30 microliters de aditivo homogeneizante do kit de isolamento miRNA. Vórtice os tubos e coloque no gelo por 10 minutos. Trabalhando em uma capa de fumaça, remova os tubos do gelo e adicione 300 microliters do reagente de clorofórmio ácido do kit e vórtice novamente para misturar.Depois de centrifugar a 10.000 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente, remova cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo. Com base na quantidade de recuperação aquosa da etapa anterior, adicione 1,25 vezes o volume de 100% de etanol ao phage aquoso em cada tubo e pipeta para misturar. Prepare tubos de coleta frescos contendo um cartucho de filtro para cada amostra.Pipeta aproximadamente 675 microliters da mistura lysate-etanol no cartucho do filtro. Centrifugar brevemente a 10.000 vezes G para passar líquido através do filtro. Descarte o fluxo.Repita a mistura de etanol-de-lise adicionando ao filtro e centrifugação até que tenha sido completamente utilizada. Adicione 700 microliters de solução de lavagem um do kit ao cartucho do filtro. Centrifugar brevemente para puxar a solução através dos filtros.Descarte o fluxo e mantenha os mesmos cartuchos de filtro e tubos de coleta. Adicione 500 microliters de solução de lavagem dois-três para cada cartucho de filtro. Depois de centrifuging novamente, descarte o fluxo-through e repita a etapa de lavagem.Para remover qualquer líquido residual dos cartuchos do filtro, gire-os por mais 60 segundos. Transfira os cartuchos para tubos de coleta frescos. Adicione 100 microlitadores de 95 graus Celsius de água pré-aquecido sem nuclease ao centro de cada cartucho de filtro.Centrifugar os cartuchos por aproximadamente 20 a 30 segundos na centrífuga de mesa em velocidade máxima. Para pré-formar a hibridização com oligos de redução de globin, primeiro desnatura o RNA adicionando cada amostra extraída em um tubo de reação sem nuclease de 0,2 mililitro. Coloque os tubos em um ciclor térmico a 70 graus Celsius por dois minutos.Depois disso, coloque imediatamente os tubos no gelo para obter a qualidade ideal do RNA. Enquanto os tubos estão esfriando, prepare 400 microliters de mistura de oligo de redução de globina de 10X e tampão de hibridização oligo de 10X em um tubo de dois mililitros. Para fazer a mistura de hibridização, adicione seis microgramas de amostra de RNA, dois microliters da mistura de oligo de redução de globina de 10X, um microliter de tampão de hibridização oligo de 10X e água livre de nuclease a um volume final de 10 microliters a cada tubo de reação de parede fina de 0,2 mililitros.Coloque os tubos no ciclo de calor a 70 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, coloque imediatamente os tubos no gelo. Para realizar a digestão RNase H, primeiro diluir 10X RNase H para um X RNase H com um buffer X RNase H.Prepare a mistura de reação RNase H combinando dois microliters de tampão RNase 10X, um microliter do inibidor RNase e dois microliters de um X RNase H, e cinco microliters de água sem nuclease a um volume total de 10 microliters. Adicione 10 microliters da mistura de reação RNase H às amostras de hibridização de redução de globina e misture bem. Digerir essa reação a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois esfriar a quatro graus Celsius.Pare a digestão adicionando um microliter de 0,5 molar EDTA ao tubo, e transfira todo o conteúdo do tubo para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Imediatamente depois disso, adicione 80 microliters de água livre de RNase, 350 microliters de tampão de lise, depois 250 microliters de 100% etanol a cada tubo e misture bem por pipetação. Transfira cada amostra de 700 microliter para um cartucho separado de filtro de eluição colocado em dois tubos de coleta de mililitros para coletar o fluxo.Centrifugar por 15 segundos a 8.000 vezes G ou superior e, em seguida, descartar o fluxo-through. Coloque os mesmos cartuchos de filtro de elução em novos dois tubos de coleta de mililitros. Para lavar as membranas do cartucho do filtro, adicione 500 microliters do tampão de lavagem leve aos cartuchos do filtro e centrífuga por 15 segundos a 8.000 vezes G ou superior.Descarte o fluxo. Em seguida, utilizando os mesmos tubos de coleta, adicione 500 microliters de 80% de etanol aos cartuchos do filtro. Centrifugar por dois minutos a 8.000 vezes G e maior.Descarte os tubos de fluxo e coleta e salve as colunas de rotação de eluição. Coloque cada coluna de rotação de elução em um novo tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugar a toda velocidade por cinco minutos com a tampa aberta nos cartuchos do filtro para secar as membranas da coluna de giro e evitar a transferência do etanol.Depois de descartar os tubos de coleta, coloque cada cartucho de filtro seco em um tubo fresco de coleta de 1,5 mililitro. Adicione 14 microliters de água livre de RNase diretamente ao centro da membrana do cartucho do filtro. Para elutar o RNA, centrifugar os tubos por 60 segundos a toda velocidade e, em seguida, continuar com mais avaliação e preparação de RNA.A amostra esgotada por globina agora pode ser dividida e usada para preparar as pequenas bibliotecas de RNA não codificadas, bem como o mRNA com esgotamento de ribo e bibliotecas de RNA longas e não codificadas. Depois de preparar bibliotecas de expressão das amostras de sangue inteiros esgotadas e esgotadas por ribo-ribo-esgotados usando este protocolo, o resumo de execução de arquivos de eletroforese mostrou uma amostra de biblioteca esgotada por globin com números de integridade de RNA que variavam de 6,3 a 9,2. Isso provou ser uma melhoria em comparação com outros estudos que utilizaram métodos de esgotamento da globina e só foram capazes de alcançar números de RIN em ou perto de seis.A redução pré-globina e a redução pós-globina de uma única amostra de sangue suíno mostraram que as relações de concentração de 260 a 280 nanômetros estão em ou acima de duas. Usando este protocolo, foram obtidos eletroferogramas à base de chip de amostras de biblioteca de mRNA de sangue de globina e ribo-esgotadas antes da coleta e sequenciamento. Para as bibliotecas mRNA, o eletroferograma representativo tem um pico de aproximadamente 280 pares de base.Para os pequenos eletroferogramas à base de chip ncRNAs, contêm uma gama de picos de aproximadamente 100 a 400 pares de base. Picos em aproximadamente 143 pares de base correspondem a miRNAs, e picos em aproximadamente 153 pares de base correspondem a piRNAs. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de tubos de gelo imediatamente onde observado.Após esse procedimento, outros métodos como o sequenciamento de próxima geração devem ser realizados para responder a questões adicionais como expressão diferencial, alterações epigenéticas e seu efeito sobre vias e processos biológicos. Não se esqueça que trabalhar com reagente fenol-clorofórmio é extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um capô de fumaça devem ser tomadas. Além disso, ao manusear sangue inteiro ou organismos infecciosos, o trabalho deve ser realizado em um gabinete de segurança biológica antes de uma ativação do organismo infeccioso.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

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Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Imunologia e Infecção

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocápside Annealing-Mediated Eletroforese (NAME) ensaio permite a identificação rápida de HIV-1 Nucleocápside Inibidores

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...