Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Эта работа была главным образом поддержана USDA НИФА AFRI 2013-67015-21236 и частично путем USDA НИФА AFRI 2015-67015-23216. Это исследование отчасти поддержали назначение сельскохозяйственных исследований службы участие программа исследований ведении Окриджская институт науки и образования (ORISE) через межучрежденческое соглашение между (Министерство энергетики США Доу) и Департамент сельского хозяйства США. ORISE управляется Оук Ридж ассоциированных университетов по контракту Доу нет. ДЕ AC05-06OR2310.
Мы хотели бы поблагодарить д-р Кей Faaberg для HP-PRRSV инфекционные клоны, д-р Сьюзен Brockmeier за ее помощь с животными, участвующих в эксперименте и Сью Ohlendorf для секретарской помощи в подготовке рукописи.

Животных протоколы были утверждены Национальным животных заболеваний центр (USDA-ARS-NADC) животное уход и использование Комитетом.
1. сбор свиной крови образцов
<ol><li>Соберите образцы крови в РНК трубы. Соберите ~2.5 mL или больше, если большие коллекции трубки доступны.</li>
</ol><p cla...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

Первым важным шагом в протоколе, что сделал это оптимизированный включали добавлен Глобин истощения шаги, которые позволили получить качество читает пробах цельной крови. Одним из крупнейших ограничений на использование цельной крови в последовательности исследования являются боль?...

Следующего поколения последовательности (НГС) стала мощным инструментом для изучения изменений, которые происходят на уровне генома биологических организмов. Пробоподготовка для NGS методы можно варьировать в зависимости от организма, тип ткани, и что более важно вопросы исследователи стремятся адрес. Многие исследования обратились к NGS как средство изучения различий в экспрессии генов между государствами таких здоровых и больных лиц1,2,3,4. Последовательности занять место на основе всего генома и позволяет исследователь захватить наиболее, если не все, геномной информации для конкретного генетический маркер в то время.
Наиболее распространенными маркеры выражения наблюдается являются Посланник РНК (мРНК). Наиболее часто используемые процедуры prepping библиотек для РНК seq оптимизированы для восстановления молекул мРНК с помощью серии очищения, образовавшиеся и перешнуровок5,6. Однако решение о том, как протокол будет выполняться полагается на образец типа и вопросы о сказал образца. В большинстве случаев всего РНК добывается; Тем не менее не все молекулы РНК представляют интерес и в тех случаях, таких как исследования выражение mRNA чрезмерно обильные видов РНК, как рибосомная РНК (рРНК) должны быть удалены, чтобы увеличить количество обнаруживаемых стенограммы, связанные с мРНК. Наиболее популярным и широко используемым методом для удаления обильные молекул рРНК является сокращение polyadenylated РНК стенограммы, именуемый поля истощения7. Этот подход хорошо работает для анализа экспрессии мРНК, он не влияет на мРНК стенограммы. Однако в исследованиях, которые заинтересованы в некодирующих или вирусной РНК, истощение поля также удаляет эти молекулы.
Многие исследования решили сосредоточиться на подготовке библиотеки РНК последовательности изучить либо выражение mRNA (кодирование) или определенного класса малых или больших РНК-кодирования. Хотя есть другие процедуры8 , как наша, которые позволяют для двойной пробоподготовки, многие исследования готовиться отдельные исследования при наличии библиотек от отдельных образцов. Для исследования, как наша это обычно требуется несколько образцов крови увеличение времени, расходных материалов и животных стресс. Целью нашего исследования было чтобы иметь возможность использовать цельную кровь от животных для выявления и количественной оценки различных классов обоих мРНК и выразил РНК-кодирования между здоровым и высоко патогенного репродуктивно и вирус атипичной пневмонии (HP-PRRSV) оспорено свиней9,10 несмотря на наличие только одного состава крови (2,5 мл) от каждой свиньи. Чтобы сделать это, нам необходимо оптимизировать типичная добыча и протоколы создание библиотеки для создания правильных данных для анализа мРНК и некодирующих РНК (ncRNA) выражение11 от одного образца.
Это вызвало необходимость в протоколе, который позволил мРНК и анализа РНК-кодирования потому что доступны стандартные комплекты и методов для создания РНК добыча и библиотека были предназначены главным образом для мРНК и использовать поли А слоя шаг12. Этот шаг было бы невозможно восстановить некодирующих РНК или вирусный стенограммы из образца. Поэтому было необходимо оптимизированный метод что позволило общее извлечение RNA без истощения поля образец. Метод, представленный в этой рукописи была оптимизирована для использования цельной крови в качестве образца типа и для построения библиотек последовательность мРНК и ncRNAs малых и больших размеров. Этот метод был оптимизирован для анализа всех обнаружить РНК-кодирования, а также сохранить вирусной РНК для последующего расследования13. Во всех наши оптимизированные библиотеки подготовка протокол предусматривает расследование нескольких молекул РНК из одной цельной крови образца.
Общая цель за использование этого метода было разработать процесс, который позволил для коллекции некодирующих РНК и мРНК из одной пробы цельной крови. Это позволяет нам иметь мРНК, ncRNA и вирусной РНК для каждого животного в нашем исследовании, получены от одного образца9. Это, в конечном счете, позволяет более научное открытие без дополнительных затрат животных и дает более полную картину выражение каждого индивидуального образца. Описан метод позволяет для изучения регуляторов экспрессии генов, а также позволяет для завершения корреляционного исследования, сравнивающие оба мРНК и некодирующих РНК выражение с помощью одного состава крови. Наши исследования использовали этот протокол для изучения изменения в экспрессии генов и возможных эпигеномные регуляторы в вирусно зараженных 9 - неделя старый коммерческих хряков.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Появление новаторских и более мощный следующего поколения последовательности методов открыла новые направления в способности для изучения базовых экспрессии генов, связанных с биологическими процессами интерес. Эти нововведения позволяют не только исследователи соблюдать выражение из последовательности мРНК, которые код для генов клеточную функцию этот эффект, но также молекулы РНК (ncRNA)-кодирования, которые остаются без перевода, но все еще имеют функции регулирования. Хотя исследователи имеют возможность наблюдать за выражение mRNA и ncRNA, он был обычным для исследования сосредоточиться на одной или другой. Однако когда исследования заинтересованы экспрессии мРНК и ncRNA, во много раз они используют отдельные образцы для изучения кодирования или некодирующих РНК за счет разницы в библиотеке препаратов. Это может привести к необходимости более образцов, которые может увеличить время, расходных материалов и животных стресс. Кроме того это может привести к исследователи решили подготовить образцы для анализа только один, обычно мРНК, ограничивая количество биологических вопросов, которые могут быть исследованы. Однако ncRNAs охватывают несколько классов с нормативной роли это выражение mRNA эффект. Потому что во время инфекции являются важными для основных биологических процессов и расстройство этих процессов в ncRNA, они могут таким образом, сделать привлекательной цели для терапии. Эта рукопись демонстрирует изменение протокола для поколения мРНК и некодирующих РНК выражение библиотек, в том числе вирусной РНК, от одного образца цельной крови. Оптимизации этого протокола, улучшение чистоты РНК, увеличение перевязки для восстановления метилированной РНК и опустить выбор размера, чтобы разрешить захват более видов РНК.

Глобин и истощены Рибо цельной крови образцы репрезентативных выборок в нашем исследовании. Итоги представитель протокола состоит из Глобин обедненного библиотеки образца с номером целостности РНК (Рин) выше 7 (Рисунок 1) и 260/280 Нм показателям?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Здесь мы представляем протокол, оптимизированный для обработки кодирования (мРНК), и -кодирования (ncRNA) Глобин снижена РНК seq библиотек из одного состава крови.

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении взаимодействия хозяина-патогена, позволяя изучить кодирование, некодирование и вирусное выражение РНК, участвующих в ответе на аминокислоты хозяина, а также как патоген может повлиять на биологические функции хозяина. Основным преимуществом этого метода является то, что он представляет протокол, оптимизированный для обработки мРНК и некодирующей РНК из библиотек RNAseq с пониженным глобином из одного образца крови. Демонстрация техники будет Сара Андерсон, техник из моей лаборатории.Начните с центрифугирования труб крови при температуре 50 20 Г в течение 10 минут при комнатной температуре. Работая в кабинете биологической безопасности, после удаления супернатанта, добавьте в гранулы восемь миллилитров воды без RNase. Закройте трубки и вихрь гранулы, пока он явно растворяется, а затем центрифуги труб при 50 20 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы восстановить гранулы.Работая в кабинете биологической безопасности, отбросьте супернатант и сохраните гранулы. Чтобы изолировать общую РНК, начните с трубопроводов 300 микролитров лиза, связывающих буфер с гранулами. После вихря перенесите смесь из каждой трубки в новую помеченную 1,5 миллилитровую центрифугу.Добавьте 30 микролитров гомогенатной добавки из изоляционные комплекты miRNA. Вихрь труб и место на льду в течение 10 минут. Работая в дымовом капоте, снимите трубки со льда и добавьте 300 микролитров кислотного фенола хлороформного реагента из комплекта и вихрь снова перемешать.После центрифугирования в 10 000 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре, тщательно удалите aqueous фазы в новую трубку. Основываясь на количестве aqueous восстановления от предыдущего шага, добавить 1,25 раза объем 100% этанола в aqueous фага в каждой трубке и пипетки для смешивания. Подготовь свежие трубки для сбора, содержащие фильтр картридж для каждого образца.Pipette приблизительно 675 микролитров смеси лизате-этанола на картридж фильтра. Центрифуга кратко в 10 000 раз G, чтобы пройти жидкость через фильтр. Отбросьте поток через.Повторите лисатно-этаноловую смесь, добавляя к фильтру и центрифугации, пока она не будет полностью использована. Добавьте 700 микролитров раствора для мытья один из комплекта в картридж фильтра. Центрифуга кратко вытащить раствор через фильтры.Откажитесь от протекаемого потока и храните те же фильтры картриджей и трубки для сбора. Добавьте 500 микролитров раствора для мытья по два-три к каждому фильтру картриджу. После центрифугирования снова, отбросить поток через и повторить шаг мытья.Чтобы удалить остаточную жидкость из картриджей фильтра, закрутите их еще 60 секунд. Перенесите картриджи в свежие трубки сбора. Добавьте 100 микролитров 95 градусов по Цельсию, разогретых без ядра воды в центр каждого картриджа фильтра.Центрифуга картриджей в течение примерно 20 до 30 секунд на столешнице центрифуги на максимальной скорости. Для преформизации гибридизации с глобин сокращения олиго, сначала денатурации РНК, добавив каждый извлеченный образец в 0,2 миллилитров тонкостенных нуклеазы свободной реакции трубки. Поместите трубки в тепловой циклер при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут.После этого немедленно поместите трубки на лед, чтобы получить оптимальное качество РНК. В то время как трубы охлаждения, подготовить 400 микролитров 10X глобина сокращения олиго смеси и 10X олиго гибридизации буфера в двух миллилитровой трубки. Чтобы сделать смесь гибридизации, добавьте шесть микрограммов образца РНК, два микролитера 10X глобина сокращения олиго смеси, один микролитр 10X олиго гибридизации буфера, и nuclease свободной воды до конечного объема 10 микролитров на каждые 0,2 миллилитров тонкостенной, нуклеазы свободной реакции трубки.Поместите трубки в тепловой циклер при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут. После этого сразу же поместите трубки на лед. Для выполнения RNase H пищеварения, сначала разбавить 10X RNase H до одного X RNase H с одним X RNase H буфера.Подготовьте смесь реакции RNase H, объединив два микролитера буфера 10X RNase, один микролитер ингибитора RNase и два микролитера одного X RNase H и пять микролитров нуклеазной воды общим объемом 10 микролитров. Добавьте 10 микролитров смеси реакции RNase H в образцы гибридизации сокращения глобина и тщательно перемешайте. Переварить эту реакцию при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем остыть до четырех градусов по Цельсию.Остановите пищеварение, добавив один микролитр 0,5 молярной ЭДТА в трубку, и перенесите все содержимое трубки в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Сразу после этого добавьте 80 микролитров воды без RNase, 350 микролитров буфера лиза, затем 250 микролитров 100% этанола в каждую трубку и хорошо перемешайте с помощью трубок. Перенесите каждый образец микролитра на отдельный картридж фильтра elution, помещенный в две миллилитровые трубки для сбора протека.Центрифуга в течение 15 секунд при 8000 раз G или больше, а затем отбросить поток через. Поместите те же картриджи фильтра elution в новые две трубки коллекции миллилитров. Чтобы промыть мембраны картриджа фильтра, добавьте 500 микролитров мягкого буфера для мытья фильтра к картриджам и центрифуге в течение 15 секунд при 8000 раз G или больше.Отбросьте поток через. Затем, используя те же трубки сбора, добавьте 500 микролитров 80% этанола к картриджам фильтра. Центрифуга в течение двух минут при 8000 раз G и больше.Отбросьте как протекаемые, так и коллекционые трубки, а также сохраните столбцы elution spin. Поместите каждую колонку elution spin в новую двухми миллилитровую трубку для сбора. Центрифуга на полной скорости в течение пяти минут с открытой крышкой на картриджах фильтра, чтобы высушить мембраны спиновой колонки и предотвратить перенос этанола.После отбрасывания трубки сбора, поместите каждый высушенный картридж фильтра в свежую трубку сбора 1,5 миллилитров. Добавьте 14 микролитров воды без RNase непосредственно к центру мембраны картриджа фильтра. Чтобы утаить РНК, центрифуга труб в течение 60 секунд на полной скорости, а затем продолжить дальнейшую оценку РНК и подготовки.Образец, исчерпанный глобином, теперь можно разделить и использовать для подготовки небольших, некодирующих РНК-библиотек, а также риборазрушаемой мРНК и длинных, некодирующих РНК библиотек. После подготовки библиотек выражения глобина истощенных и рибо истощенных целых образцов крови с помощью этого протокола, электрофорез файл запустить резюме показал глобин истощенный образец библиотеки с РНК целостности номера, которые варьировались от 6,3 до 9,2. Это оказалось улучшение по сравнению с другими исследованиями, которые использовали методы истощения глобина и были только в состоянии достичь RIN номера на уровне или около шести.Предварительное снижение глобина и постглобин-сокращение одного свиного образца всей крови показали, что соотношение концентрации 260-280 нанометров находится на уровне или выше двух. С помощью этого протокола были получены чип-электроферограммы глобина и рибо-истощенных образцов библиотеки всей крови мРНК до объединения и секвенирования. Для библиотек мРНК репрезентативная электроферограмма имеет пик примерно в 280 базовых парах.Для небольших ncRNAs репрезентативные чип-электроферограммы содержат диапазон пиков от примерно 100 до 400 базовых пар. Пики примерно на 143 базовых парах соответствуют миРНК, а пики примерно в 153 базовых парах соответствуют пиРНК. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы ледяные трубы сразу же, где отметил.После этой процедуры следует использовать другие методы, такие как секвенирование следующего поколения, с тем чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как дифференциальное выражение, эпигенетические изменения и их влияние на биологические пути и процессы. Не забывайте, что работа с фенол-хлороформ реагент является чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как работа в дымовой капот должны быть приняты. Кроме того, при обработке всей крови или инфекционных организмов, работа должна быть выполнена в кабинете биологической безопасности до активации инфекционного организма.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

1,5 час порядок идентификации Enterococcus Виды Непосредственно из культуры крови

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Перечень основных периферической крови популяции лейкоцитов для многоцентровых клинических испытаний с использованием полного анализа крови Фенотипирование

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...