Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado principalmente por el por el USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 y en parte por el USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Este estudio fue apoyado en parte por una cita a la agrícola servicio investigación participación programa de investigación administrado por el Instituto Oak Ridge para la ciencia y educación (ORISE) a través de un acuerdo interagencial entre el Departamento de energía ( DOE) y el Departamento de agricultura de Estados Unidos. ORISE es administrada por Oak Ridge Associated universidades bajo contrato DOE no. DE-AC05-06OR2310.
Nos gustaría dar las gracias a Dr. Kay Faaberg para los clones infecciosos HP-PRRS, el Dr. Susan Brockmeier por su ayuda con los animales involucrados en el experimento y Sue Ohlendorf para asistencia secretarial en la preparación del manuscrito.

Protocolos animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de cuidado de animales del Centro Nacional de enfermedad Animal (USDA-ARS-NADC).
1. colección de sangre porcina muestras
<ol><li>Obtener muestras de sangre en tubos de RNA. Recoger ~2.5 mL o más si se dispone de tubos más grandes.</li>
</ol>2. procesamiento de sangre porcina muestras
<ol><li>Centrifugar los tubos de sangre a 5.020 x g por 10 min a temperatura ambiente (15-25 ° C). Si muestra...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. 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New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

El primer paso crítico en el protocolo que ha optimizado incluye los pasos de agotamiento de la globina añadido, que permite obtener lecturas de calidad de muestras de sangre entera. Una de las más grandes limitaciones sobre el uso de sangre entera en los estudios de secuenciación son los altos números de Lee en la muestra que se asignan a las moléculas de globina y reducirá la lee que puede asignar a otras moléculas de interés18. Por lo tanto, optimizar el protocolo para nuestro tipo de ...

Secuencia de la generación siguiente (NGS) ha surgido como una poderosa herramienta para la investigación de los cambios que ocurren a nivel genómico de organismos biológicos. Preparación de muestras para métodos NGS puede variar dependiendo del organismo, tipo de tejido, y lo más importante las preguntas de los investigadores están deseosos de dirección. Muchos estudios han recurrido a NGS como medio de estudiar las diferencias en la expresión génica entre Estados como individuos sanos y enfermos1,2,3,4. La secuencia coloque sobre una base de todo el genoma y permite a un investigador capturar la mayoría, si no todos, de la información genómica para un determinado marcador genético a la vez el punto.
Los marcadores más comunes de expresión observados son el Mensajero RNAs (mRNAs). Los procedimientos más utilizados para preparar las bibliotecas para RNA-seq se optimizan para la recuperación de las moléculas de mRNA mediante el uso de una serie de purificaciones, fragmentaciones y trompas5,6. Sin embargo, la decisión sobre cómo un protocolo debe realizarse depende en gran medida el tipo de muestra y las preguntas sobre dicha muestra. En la mayoría de los casos se extrajo ARN total; sin embargo, no todas las moléculas de ARN son de interés y en casos como los estudios de expresión de mRNA excesivamente abundantes especies de RNA, como el ARN ribosómico (ARNr) necesitan ser removidas para aumentar el número de transcripciones perceptibles asociados con los mRNAs. El método más popular y ampliamente utilizado para eliminar las abundantes moléculas de rRNA es la reducción de las transcripciones de cofia RNA conocido como polyA agotamiento7. Este enfoque funciona bien para el análisis de la expresión de mRNA como no afecta a los transcritos de ARNm. Sin embargo, en estudios que están interesados en RNAs no codificantes o virales, agotamiento de polyA también elimina estas moléculas.
Muchos estudios deciden centrarse en la preparación de biblioteca de secuencia de RNA para examinar cualquier expresión del mRNA (codificación) o una clase determinada de ARN no codificante de pequeño o grande. Aunque hay otros procedimientos8 como la nuestra que permiten la preparación de la muestra doble, muchos estudios preparan bibliotecas de muestras independientes para estudios por separado cuando esté disponible. Para un estudio como el nuestro, esto requeriría normalmente múltiples muestras de sangre, aumentando el tiempo, consumibles y el estrés animal. El objetivo de nuestro estudio era ser capaz de usar sangre de animales para identificar y cuantificar las diferentes clases de ambos mRNA y RNA no codificante expresó entre disgenésico sano y altamente patógena y virus del síndrome respiratorio (HP-PRRS) desafió a cerdos9,10 a pesar de tener sólo una muestra de sangre entera sola (2,5 mL) de cada cerdo. Para ello, necesitábamos optimizar la extracción típica y protocolos de creación de biblioteca para generar los datos adecuados para permitir análisis de mRNA y no codificante del RNA (ncRNA) expresión11 de una sola muestra.
Esto impulsó la necesidad de un protocolo que permitió mRNA y análisis de ARN no codificante porque los kits estándar disponibles y métodos para la extracción de RNA y biblioteca de la creación fueron pensados principalmente para mRNA y utilizan un agotamiento poly-A paso12. Este paso habría hecho imposible recuperar ARN no codificante o transcripciones virales de la muestra. Por lo tanto, era necesario un método optimizado que permite para la extracción de RNA total sin agotamiento de polyA la muestra. El método presentado en este manuscrito se ha optimizado para permitir el uso de sangre entera como un tipo de muestra y construir bibliotecas de la secuencia de mRNA y ncRNAs de tamaños pequeños y grandes. El método ha sido optimizado para permitir el análisis de todos detectables no-codificación RNAs como retener RNAs virales para posterior investigación13. En todos, nuestro protocolo de preparación de biblioteca optimizada permite la investigación de múltiples moléculas de RNA de una muestra de sangre entera solo.
El objetivo detrás del uso de este método fue desarrollar un proceso que permitió la colección no codificante del RNA tanto de ARNm de una muestra de sangre entera. Esto nos permite tener ncRNA y mRNA y RNA viral para cada animal en nuestro estudio de una sola muestra9. Esto, en última instancia, permite el descubrimiento científico más sin costes adicionales de animales y da una imagen más completa de la expresión de cada muestra individual. El método descrito permite la examinación de los reguladores de expresión génica así como permitiendo estudios correlativos comparando ambos de mRNA y la expresión de RNA no codificante con una muestra de sangre entera sola. Nuestro estudio utiliza este protocolo para examinar los cambios en la expresión génica y posibles reguladores epigenéticos en viralmente infectaron cerdos comerciales masculinos 9 - semanas de edad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

La llegada del innovador y cada vez más potentes técnicas de secuenciación siguiente de generación ha abierto nuevos caminos en la capacidad de examinar la expresión de genes subyacentes relacionadas con procesos biológicos de interés. Estas innovaciones no sólo permiten a los investigadores observar la expresión de las secuencias de ARNm que codifican para los genes función celular efecto, pero también las no codificantes (ncRNA) las moléculas de ARN que permanecen sin traducir, pero todavía tienen funciones reguladoras. Aunque los investigadores tienen la capacidad de observar la expresión de mRNA y ncRNA, ha sido habitual para un estudio que se centran en uno o el otro. Sin embargo, cuando los estudios están interesados en la expresión de mRNA y ncRNA, muchas veces utilizan las muestras separadas para examinar la codificación o no-codificación RNAs debido a la diferencia en la preparación de la biblioteca. Esto puede conducir a la necesidad de más muestras que puede aumentar el tiempo, consumibles y el estrés animal. Además, puede causar los investigadores deciden preparar muestras para análisis sólo uno, generalmente el mRNA, limitar el número de cuestiones biológicas que pueden ser investigadas. Sin embargo, ncRNAs abarcan múltiples clases con funciones reguladoras expresión de mRNA de efecto. Porque ncRNA son importantes para los procesos biológicos fundamentales y desorden de estos procesos en durante la infección, por lo tanto, pueden, hacer objetivos atractivos para la terapéutica. Este manuscrito muestra un protocolo modificado para la generación de mRNA y no codificante del RNA expresión bibliotecas, incluyendo el ARN viral, de una sola muestra de sangre entera. Optimización del presente Protocolo, mejora la pureza del RNA mayor ligadura para recuperación de RNAs metilados y omite la selección del tamaño, para permitir la captura de las especies de RNA más.

Las muestras representativas en nuestro estudio son la globina y muestras de sangre entera ribo-agotado. El resultado representativo del protocolo consiste en una muestra de biblioteca empobrecido de la globina con un número de la integridad del RNA (RIN) por encima de 7 (figura 1a) y cocientes de concentración 260/280 nm en o por encima de 2 (figura 1b y 1 c). Validación de los resultados de ...

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Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para el proceso de codificación (mRNA) y no codificantes (ncRNA) globina reducida RNA-seq bibliotecas de una muestra de sangre entera sola.

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las interacciones huésped-patógeno al permitir el examen de la codificación, la no codificación y la expresión de ARN viral implicada en la respuesta de aminoácidos del huésped, así como cómo un patógeno puede afectar las funciones biológicas del huésped. La principal ventaja de esta técnica es que presenta un protocolo optimizado para el procesamiento de ARNm y ARN no codificantes de bibliotecas RNAseq reducidas por globina a partir de una sola muestra de sangre entera. Demostrando la técnica estará Sarah Anderson, una técnico de mi laboratorio.Comience por centrifugar los tubos sanguíneos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Trabajando en un armario de seguridad biológica, después de retirar el sobrenadante, añadir ocho mililitros de agua libre de RNase al pellet. Cierre los tubos y vórtice el pellet hasta que se disuelva visiblemente, luego centrifuga los tubos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente para recuperar el pellet.Trabajando en un armario de seguridad biológica, deseche el sobrenadante y guarde el pellet. Para aislar el ARN total, comience por pipetear 300 microlitros de tampón de unión de lisis al pellet. Después del vórtice, transfiera la mezcla de cada tubo a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Añadir 30 microlitros de aditivo homogeneado del kit de aislamiento miRNA. Vórtice los tubos y colóquelos en el hielo durante 10 minutos. Trabajando en una campana de humo, retire los tubos del hielo y agregue 300 microlitros del reactivo de cloroformo de fenol ácido del kit y el vórtice de nuevo para mezclar.Después de centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la fase acuosa a un tubo nuevo. Sobre la base de la cantidad de recuperación acuosa del paso anterior, añadir 1,25 veces el volumen de 100%etanol al fago acuoso en cada tubo y pipeta para mezclar. Prepare tubos de recogida nuevos que contengan un cartucho de filtro para cada muestra.Pipeta aproximadamente 675 microlitros de la mezcla de izado y etanol en el cartucho del filtro. Centrifugar brevemente a 10.000 veces G para pasar líquido a través del filtro. Deseche el flujo a través.Repita la mezcla de izado-etanol añadiendo al filtro y centrifugación hasta que se haya utilizado por completo. Agregue 700 microlitros de solución de lavado uno del kit al cartucho del filtro. Centrifugar brevemente para tirar de la solución a través de los filtros.Deseche el flujo y mantenga los mismos cartuchos de filtro y tubos de recogida. Agregue 500 microlitros de solución de lavado dos-tres a cada cartucho de filtro. Después de centrifugar de nuevo, deseche el flujo y repita el paso de lavado.Para eliminar cualquier líquido residual de los cartuchos de filtro, gírelos 60 segundos adicionales. Transfiera los cartuchos a tubos de recogida frescos. Agregue 100 microlitros de agua sin nucleasa precalentada de 95 grados Celsius al centro de cada cartucho de filtro.Centrifugar los cartuchos durante aproximadamente 20 a 30 segundos en la centrífuga de sobremesa a la velocidad máxima. Para preformar la hibridación con oligos de reducción de globina, primero desnaturalizar el ARN añadiendo cada muestra extraída en un tubo de reacción sin nucleasa de 0,2 mililitros de paredes delgadas. Coloque los tubos en un ciclor térmico a 70 grados Centígrados durante dos minutos.Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo para obtener una calidad óptima de ARN. Mientras los tubos se enfrían, prepare 400 microlitros de mezcla de oligo de reducción de globina 10X y tampón de hibridación de oligo 10X en un tubo de dos mililitros. Para hacer la mezcla de hibridación, agregue seis microgramos de muestra de ARN, dos microlitros de la mezcla de oligo de reducción de 10X de globina, un microlitro de tampón de hibridación de oligonú 10X y nuclese agua libre a un volumen final de 10 microlitros a cada tubo de reacción de paredes delgadas de 0,2 mililitros, sin nucleasas.Coloque los tubos en el ciclor térmico a 70 grados centígrados durante dos minutos. Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo. Para realizar la digestión RNase H, primero diluya 10X RNase H a un X RNase H con un búfer X RNase H.Prepare la mezcla de reacción RNase H combinando dos microlitros de tampón 10X RNase, un microlitro de inhibidor de la ARNa y dos microlitros de un X RNase H, y cinco microlitros de agua libre de nucleasas a un volumen total de 10 microlitros. Agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción RNase H a las muestras de hibridación de reducción de globina y mezcle bien. Digerir esta reacción a 37 grados celsius durante 10 minutos y luego enfriar a cuatro grados Celsius.Detenga la digestión añadiendo un microlitro de EDTA molar a la sonda y transfiera todo el contenido del tubo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Inmediatamente después de eso, añadir 80 microlitros de agua libre de RNase, 350 microlitros de tampón de lelisis, luego 250 microlitros de 100% etanol a cada tubo y mezclar bien por pipeteo. Transfiera cada muestra de 700 microlitros a un cartucho de filtro de elución separado colocado en un tubo de recolección de dos mililitros para recoger el flujo a través.Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 veces G o superior y luego deseche el flujo a través. Coloque los mismos cartuchos de filtro de elución en nuevos tubos de recogida de dos mililitros. Para lavar las membranas del cartucho de filtro, agregue 500 microlitros del tampón de lavado suave a los cartuchos de filtro y centrífuga durante 15 segundos a 8.000 veces G o más.Deseche el flujo a través. A continuación, utilizando los mismos tubos de recogida, agregue 500 microlitros de 80% de etanol a los cartuchos de filtro. Centrifugar durante dos minutos a 8.000 veces G y más.Deseche los tubos de flujo y de recogida y guarde las columnas de giro de elución. Coloque cada columna de giro de elución en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros. Centrifugar a toda velocidad durante cinco minutos con la tapa abierta en los cartuchos de filtro para secar las membranas de la columna de centrifugado y evitar el arrastre de etanol.Después de desechar los tubos de recogida, coloque cada cartucho de filtro seco en un tubo de recogida fresco de 1,5 mililitros. Agregue 14 microlitros de agua libre de RNase directamente al centro de la membrana del cartucho del filtro. Para eluir el ARN, centrifugar los tubos durante 60 segundos a toda velocidad y luego continuar con la evaluación y preparación de ARN.La muestra agotada por globina ahora se puede dividir y utilizar para preparar las pequeñas bibliotecas de ARN no codificantes, así como el ARNm agotado en ribo y las bibliotecas de ARN largas y no codificantes. Después de preparar las bibliotecas de expresiones de las muestras de sangre entera agotadas por globinas y agotadas por ribo utilizando este protocolo, el resumen de la ejecución del archivo de electroforesis mostró una muestra de biblioteca agotada por globina con números de integridad de ARN que oscilaban entre 6.3 y 9.2. Esto resultó ser una mejora en comparación con otros estudios que utilizaron métodos de agotamiento de la globina y sólo fueron capaces de lograr números rin en o cerca de seis.La reducción previa a laglobina y la reducción posterior a la globina de una sola muestra de sangre entera porcina mostraron que las relaciones de concentración de 260 a 280 nanómetros están en o por encima de dos. Mediante este protocolo, se obtuvieron electroferogramas basados en chip de muestras de la biblioteca de ARNm de sangre entera agotadas por globina y ribo antes de la agrupación y la secuenciación. Para las bibliotecas de ARNm, el electroferograma representativo tiene un pico de aproximadamente 280 pares base.Para los pequeños ncRNAs, los electroferogramas representativos basados en chip contienen una gama de picos de aproximadamente 100 a 400 pares base. Los picos en aproximadamente 143 pares base corresponden a miRNAs, y los picos en aproximadamente 153 pares base corresponden a piRNAs. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los tubos de hielo inmediatamente donde se indica.Siguiendo este procedimiento, se deben realizar otros métodos como la secuenciación de próxima generación para responder a preguntas adicionales como la expresión diferencial, los cambios epigenéticos y su efecto en las vías y procesos biológicos. No olvide que trabajar con reactivo de fenol-cloroformo es extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones como trabajar en una campana de humo. Además, al manipular sangre entera u organismos infecciosos, se debe trabajar en un gabinete de seguridad biológica antes de la activación del organismo infeccioso.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

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Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

La enumeración de las principales poblaciones de leucocitos de sangre periférica en ensayos clínicos multicéntricos utilizando un ensayo de sangre entera Fenotipado

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Una Novela<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para el estudio de las interacciones entre Whole Sangre humana y del endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...