Name: identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Bu eser esas olarak tarafından desteklenmiştir USDA NIFA Engelleyeceğiz 2013-67015-21236 tarafından ve kısmen USDA NIFA Engelleyeceğiz 2015-67015-23216 tarafından. Bu çalışmada kısmen randevu Tarımsal Araştırma hizmet araştırma katılım bilim ve eğitim (ORISE) için bize Enerji Bakanlığı (arasında arası bir anlaşma ile Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen programı tarafından desteklenen DOE) ve ABD Tarım Bakanlığı. ORISE Hayır DOE sözleşme altında Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilir. DE-AC05-06OR2310.
Dr. Kay Faaberg HP-PRRSV bulaşıcı klonlar, Dr Susan Brockmeier için ona yardım hayvanlarla denemede yer ve Sue Ohlendorf yazının hazırlanmasında sekreterlik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan iletişim kuralları ulusal hayvan hastalığı Merkezi (USDA-ARS-NADC) hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. toplama domuz kan örnekleri
<ol><li>Kan örnekleri RNA tüpler içine toplamak. Büyük koleksiyon tüpler yoksa ~2.5 mL veya daha fazla toplama.</li>
</ol>2. domuz kan işleme örnekleri
<ol><li>5,020 x g (15-25 ° C) Oda sıcaklığında 10 dakika için de kan tüpler santrifüj kapasitesi. Eğer dondurulmuş iş...

<ol>
	<li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq:+challenges+and+strategies+for+data+analysis.">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li><li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature.">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084 (2014).</li><li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection.">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412 (2015).</li><li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli.">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity.">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection.">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li><li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+(HP-PRRSV).">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).</li><li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis.">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing.">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly(A)+RNA+Library.">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9 (2015).</li><li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples.">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TruSeq&#174;+Stranded+Total+RNA+Sample+Preparation+Guide.">TruSeq&#174; Stranded Total RNA Sample Preparation Guide.</a> Illumina. , (2018).</li><li>. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018)</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion.">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).</li><li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq.">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).</li><li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer.">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li></ol>

En iyi duruma getirilmiş yapılan protokolündeki ilk kritik adım kalite okuma tam kan örnekleri almak mümkün kılan eklenen globin tükenmesi adımları dahil. Bir tam kan sıralama çalışmalarda kullanma en büyük sınırlamalar globin moleküller için harita ve ilgi18diğer moleküller için harita okuma azaltmak okuma örnek sayısının fazlalığı vardır. Bu nedenle, bizim örnek türü için protokol optimize içinde en yüksek olası mRNA ve kodlamayan RNA aracılığıyla sıra...

Sonraki nesil sıralama (NGS) biyolojik organizmalar genomik düzeyinde meydana gelen değişiklikler incelenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. NGS yöntemleri için numune hazırlama organizma, doku türü, bağlı olarak değiştirilebilir ve daha da önemlisi sorular araştırmacılar adresine keskin burada. Birçok çalışma NGS için gen ekspresyonu hasta ve sağlıklı bireyler1,2,3,4gibi devletler arasındaki farklılıkları eğitim aracı olarak döndü. Sıralama bir bütün genom olarak yerleştirin ve en iyi yakalamak bir araştırmacı sağlar, değilse, genomik için tüm bilgileri belirli bir genetik marker teker teker gelin.
En yaygın veri işaretleyicilerini gözlenen ifade haberci RNA (mRNA) vardır. En çok kullanılan yordamlar prepping kitaplıkları için RNA-seq purifications, fragmentations ve d5,6bir dizi aracılığıyla mRNA molekülleri kurtarılması için optimize edilmiştir. Ancak, bir protokol yapılması için nasıl üzerinde karar ağır örnek türü ve dedi örnek hakkında yöneltilen sorular üzerine dayanmaktadır. Çoğu durumda toplam RNA elde edilir; henüz, tüm RNA molekülleri ilgi ve mRNA ifade çalışmaları gibi durumlarda ribozomal RNA (rRNA) gibi aşırı bol RNA tür tespit tutanakları mRNA'ların ile ilişkili sayısını artırmak için kaldırılması gerekir. Bol rRNA molekülleri kaldırmak için en popüler ve yaygın olarak kullanılan yöntem polyA tükenmesi7olarak anılacaktır poliadenile RNA transkript azalma var. Bu yaklaşım mRNA transkript etkilemez de mRNA ifade analizi için çalışır. Ancak, içinde ya da viral kodlamayan RNA'ların ilgilenen çalışmalarda polyA tükenmesi bu moleküller de kaldırır.
Birçok çalışma (kodlama) ya da mRNA ifade incelemek için RNA dizisi Kütüphane hazırlık veya küçük veya büyük kodlamayan RNA'ın belirli bir sınıfın odaklanmak seçin. Bizimki Çift numune hazırlama için izin gibi diğer yordamlar8 olsa da, birçok çalışma kitaplıkları ayrı örneklerinden ayrı çalışmalar ne zaman elde edilebilir için hazır olun. Bizimki gibi bir çalışma için bu normalde zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artan birden fazla kan örnekleri gerektirecektir. Çalışmamızın amacı belirlemek ve her iki mRNA farklı sınıflar ölçmek için tam kan hayvanlardan kullanmak mümkün olacaktı ve sağlıklı ve yüksek patojenik domuz üreme ve solunum Sendromu virüs (HP-PRRSV) arasında kodlamayan RNA ifade Sadece bir tek tam kan örneği (2.5 mL) her domuz olmasına rağmen domuz9,10 meydan. Bunu yapabilmek için biz tipik çıkarma ve kütüphane oluşturma protokolleri mRNA ve kodlamayan RNA (ncRNA) ifade11 tek bir örnek üzerinden analizi için izin vermek için uygun verileri oluşturmak için en iyi duruma getirmek için gerekli.
Bu mevcut standart kitleri ve RNA-ekstraksiyon ve kütüphane oluşturma yöntemlerini esas mRNA için amaçlanmıştır ve bir poli-A tükenmesi adım12kullanın çünkü mRNA ve kodlamayan RNA analizi için izin verilen bir iletişim kuralı için bir ihtiyaç istenir. Bu adımı kodlamayan RNA veya viral transkript alınan örneğin kurtarmak mümkün olurdu. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi ihtiyaç vardı bu izin olmadan örnek polyA tükenmesi toplam RNA çıkarılması için. Bu el yazması sunulan Yöntem mRNA ve ncRNA'lar küçük ve büyük boyutlarda için sıralama kitaplıkları oluşturmak için ve tam kan bir örnek türü olarak kullanmak için izin vermek için optimize edilmiştir. Yöntem, tüm tespit kodlamayan RNA'ların analiz için izin gibi daha sonra soruşturma13viral RNA'ların korumak için en iyi duruma getirilmiş. Toplamda, bir tek tam kan örneği üzerinden birden çok RNA molekülleri incelenmesi için bizim en iyi duruma getirilmiş Kütüphane hazırlık Protokolü sağlar.
Genel amacı, bu yöntemin kullanılması arkasında hem kodlamayan RNA ve mRNA koleksiyonundan bir tam kan örneği için izin verilen bir süreç geliştirmekti. Bu bir tek örnek9' dan kaynaklı çalışma mRNA, ncRNA ve her hayvan için viral RNA olmasını sağlar. Bu, sonuçta, ek hayvan maliyeti olmadan daha bilimsel keşif için izin verir ve daha kapsamlı bir resmi tek tek her örnek ifade verir. Gen ifadesinin yanı sıra her iki karşılaştırarak bağdaşık çalışmaların tamamlanması için izin düzenleyiciler incelenmesi için açıklanan yöntemi sağlar mRNA ve kodlamayan RNA ifade tek bütün kan örneği kullanarak. Bizim çalışma gen ekspresyonu değişiklikleri incelemek için bu protokolü kullanılan ve olası epigenetik düzenleyiciler virally 9 - hafta eski erkek ticari domuzları enfekte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:775px;" width="775">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">PAXgene Tubes</td>
			<td style="width:159px;">PreAnalytix</td>
			<td style="width:131px;">762165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM1560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rneasy MinElute Clean Up Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:159px;">Decon Labs, Inc.</td>
			<td style="width:131px;">2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">0.2 mL thin-walled tubes</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">98010540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1.5 mL RNase/DNase - free tubes</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Veriti 96-well Thermocycler</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4375786R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#945; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 1)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Globin Reduction Oligo (&#946; 2)</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X Oligo Hybridization Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">-KCl</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">60142-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10X RNase H Buffer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Tris-HCl, pH 7.6</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-DTT</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">Y00147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">&#160;-MgCl2</td>
			<td style="width:159px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">A351B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;-Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase H</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SUPERase-IN</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">AM2694</td>
			<td>Rnase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EDTA</td>
			<td style="width:159px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:131px;">E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">&#160;2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agilent High Sensitivity DNA&#160; Kit</td>
			<td style="width:159px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:131px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;">RS-122-2201</td>
			<td>mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A&#160; (48 samples, 12 indexes)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td>
			<td style="width:159px;">Illumina</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td>Available on-line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNAClean XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AMPure XP Beads</td>
			<td style="width:159px;">BeckmanCoulter</td>
			<td style="width:131px;">A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010580</td>
			<td>0.2 ml thin-walled tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N801-0535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">RNase/DNase - free reagent reservoirs</td>
			<td style="width:159px;">Any supplier</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical 96 well plates</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">N8010560</td>
			<td>These were used in place of .3mL plates as needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td style="width:159px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:131px;">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 1)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E73005</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&#174; (Set 2)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:131px;">E75805</td>
			<td>small RNA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">QIAQuick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:159px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:131px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">96S Super Magnet Plate</td>
			<td style="width:159px;">ALPAQUA</td>
			<td style="width:131px;">A001322</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of coding and non-coding rna classes expressed in swine whole blood

Yenilikçi ve giderek güçlü bir sonraki nesil sıralama teknikleri gelişiyle faiz biyolojik süreçleri ile ilgili temel gen ekspresyonu incelemek için yetenek içine yeni yollar açtı. Bu yenilikler sadece araştırmacılar ifade mRNA dizilerinden genler için bu etkin hücresel işlevi kod gözlemlemek için izin, ancak çevrilmeyen ama hala kalır kodlamayan RNA (ncRNA) molekülleri düzenleyici fonksiyonları da mevcuttur. Araştırmacılar mRNA ve ncRNA ifade gözlemlemek yeteneği olmasına rağmen alışılmış odaklanmak bir veya diğer bir çalışma oldu. Çalışmalar mRNA ve ncRNA ifadede ilgileniyor musunuz, ancak, birçok kez onlar ayrı örnekleri kodlama veya RNA'ların Kütüphane hazırlıklar farklılığı nedeniyle kodlamayan incelemek için kullanın. Bu zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artırabilir daha fazla örnek için gereken yol açabilir. Ayrıca, araştırmacılar örnekleri tek bir analizi için genellikle mRNA soruşturma olması biyolojik soru sayısını sınırlama, hazırlamak karar vermek neden olabilir. Ancak, ncRNA'lar o etkisi mRNA ifade düzenleyici rollere sahip birden çok sınıf span. NcRNA olduğundan temel biyolojik süreçler ve bu süreçlerin bozukluğu için önemli enfeksiyon sırasında bu nedenle, tedavi için çekici hedefler hale getirebilir. Bu el yazması değiştirilmiş bir protokol oluşturmak için gösterir mRNA ve tam kan tek bir örnek üzerinden viral RNA da dahil olmak üzere kodlamayan RNA ifade kütüphaneler,. Bu protokol optimizasyon RNA saflık geliştirilmiş, ligasyonu metillenmiş RNA'ların kurtarılması için arttı ve boyut seçimi, daha fazla RNA türlerin yakalama izin vermek için ihmal.

Bizim çalışma temsilcisi örneklerinde globin ve ribo tükenmiş tam kan örnekleri vardır. Globin tükenmiş Kütüphane örneği bir sayıyla RNA bütünlüğü (RIN) 7 (Şekil 1bir) ve 260/280 nm konsantrasyon oranlarının ya da 2 (Şekil 1b ve 1 c) üzerinde yukarıda protokol temsilcisi sonucu oluşur. Doğrulama örnek sonucu her kitaplık son konsantrasyonu vermek için spektrofotomet...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood at JoVE.com

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Burada, biz (mRNA) kodlama işlem için optimize edilmiş bir iletişim kuralı mevcut ve (ncRNA) globin kodlamayan RNA-seq kitaplıkları bir tek tam kan örneğinden azaltılmış.

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Bu yöntem, konak amino yanıtında yer alan kodlama, kodlamama ve viral RNA ekspresyonunun incelenmesine ve bir patojenin konakçının biyolojik fonksiyonlarını nasıl etkileyebileceğine izin vererek konak-patojen etkileşimlerinin incelenmesinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, globin azaltılmış RNAseq kütüphanelerinden mRNA ve kodlamayan RNA'nın tek bir tam kan örneğinden işlenmesi için optimize edilmiş bir protokol sunmasıdır. Tekniği gösteren Sarah Anderson, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 50 20 kez G'de kan tüplerini santrifüj ederek başlayın. Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışan, supernatant çıkardıktan sonra, pelet için RNase içermeyen su sekiz mililitre ekleyin. Tüpleri kapatın ve pelet görünür cereyana kadar girdap, sonra 50 20 kez G'deki tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin ve peleti geri verin.Biyolojik bir güvenlik kabininde çalışarak, süpernatant'ı atın ve peleti kurtarın. Toplam RNA'yı izole etmek için, 300 mikrolitre likis bağlama tamponunun pelete boruile titreştirilerek başlayın. Girdap sonra, yeni etiketli 1.5 mililitre santrifüj tüp için her tüp karışımı aktarın.miRNA izolasyon kitinden 30 mikrolitre homojen katkı maddesi ekleyin. Tüpleri girdap ve 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Bir duman kaputunda çalışan, buz tüpleri kaldırmak ve tekrar karıştırmak için kiti ve girdap asit fenol kloroform reaktif 300 mikrolitre ekleyin.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10,000 kez G santrifüj ettikten sonra, sulu fazı yeni bir tüpe dikkatlice çıkarın. Önceki adımdaki sulu geri kazanım miktarına bağlı olarak, karıştırmak için her tüp ve pipet sulu faj için% 100 etanol hacmi 1,25 kat ekleyin. Her numune için filtre kartuşunu içeren yeni toplama tüpleri hazırlayın.Pipet yaklaşık 675 mikrolitre lysate-etanol karışımı filtre kartuşuna. Filtreden sıvı geçirmek için 10.000 kez G'de kısaca santrifüj edin. Akışı atın.Tamamen kullanılana kadar filtre ve santrifüj ekleyerek lysate-etanol karışımı tekrarlayın. 700 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin bir kitten filtre kartuşu için. Çözeltiyi filtrelerden geçirmek için kısa bir süre santrifüj edin.Akış tan atın ve aynı filtre kartuşları ve toplama tüplerini saklayın. Her filtre kartuşu için 500 mikrolitre yıkama çözeltisi iki-üç ekleyin. Tekrar santrifüj den sonra, akış tan atın ve yıkama adımını tekrarlayın.Filtre kartuşlarından kalan sıvıyı çıkarmak için 60 saniye daha döndürün. Kartuşları yeni toplama tüplerine aktarın. Her filtre kartuşunun ortasına 100 mikrolitre 95 derece santigrat önceden ısıtılmış nükleaziçermeyen su ekleyin.Kartuşları masa üstü santrifüjünde maksimum hızda yaklaşık 20-30 saniye santrifüj edin. Globin azaltma oligoları ile melezleşmeyi sağlamak için, ilk olarak alınan her numuneyi 0,2 mililitre ince duvarlı çekirdeksiz reaksiyon tüpüne ekleyerek RNA'yı denatüre edin. Tüpleri 70 derecede bir termal döngüye iki dakika yerleştirin.Bundan sonra, optimum RNA kalitesini elde etmek için tüpleri hemen buza yerleştirin. Tüpler soğurken, 400 mikrolitre 10X globin azaltma oligo karışımı ve 10X oligo hibridizasyon tamponiki mililitretüp hazırlayın. Hibridizasyon karışımı yapmak için, RNA örnek altı mikrogram ekleyin, 10X globin azaltma oligo karışımı iki mikrolitre, 10X oligo hibridizasyon tampon bir mikrolitre, ve her 10 mikrolitre son hacmine çekirdeksiz su 0.2 mililitre ince duvarlı, çekirdeksiz reaksiyon tüpü.Tüpleri termal döngüye 70 derecede iki dakika yerleştirin. Bundan sonra, hemen buz tüpleri yerleştirin. RNase H sindirimini gerçekleştirmek için, ilk olarak 10X RNase H'yi bir X RNase H tamponuyla bir X RNase H'ye seyreltin.10X RNase tamponunun iki mikrolitresini, bir mikrolitre RNase inhibitörünün ve bir X RNase H'nin iki mikrolitresini ve toplam 10 mikrolitre lik çekirdeksiz suyun beş mikrolitresini birleştirerek RNase H reaksiyon karışımını hazırlayın. Globin azaltma hibridizasyon örneklerine 10 mikrolitre RNase H reaksiyon karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. Bu reaksiyonu 37 derecede 10 dakika sindirin ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun.Tüpe bir mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyerek sindirimi durdurun ve tüpün tüm içeriğini 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın. Bundan hemen sonra, 80 mikrolitre RNase içermeyen su, 350 mikrolitre lysis tampon, sonra her tüpe %100 etanol 250 mikrolitre ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Her 700 mikrolitrelik numuneyi, akış tanzimi için iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirilen ayrı bir elüsyon filtresi kartuşuna aktarın.8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj ve sonra akış atmak. Aynı elution filtresi kartuşlarını yeni iki mililitrelik toplama tüplerine yerleştirin. Filtre kartuş membranlarını yıkamak için, filtre kartuşlarına 500 mikrolitre hafif yıkama tamponu ekleyin ve 8, 000 kez G veya daha fazla 15 saniye santrifüj yapın.Akışı atın. Daha sonra, aynı toplama tüplerini kullanarak, filtre kartuşlarına %80 etanol 500 mikrolitre ekleyin. 8, 000 kez G ve daha büyük iki dakika santrifüj.Hem akış ve toplama tüplerini atın ve elüsasyon spin sütunlarını kaydedin. Her elution spin sütunu yeni bir iki mililitretoplama tüpü neyer. Spin kolon membranlarını kurutmak ve etanol taşımasını önlemek için filtre kartuşlarının açık kapağı yla beş dakika boyunca tam hızda santrifüj yapın.Toplama tüplerini attıktan sonra, kurutulmuş filtre kartuşuher bir 1,5 mililitrelik toplama tüpü içine yerleştirin. Doğrudan filtre kartuş membranının ortasına 14 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin. RNA'yı elemek için tüpleri tam hızda 60 saniye santrifüj edin ve daha fazla RNA değerlendirmesi ve hazırlığıyla devam edin.Globin tükenmiş örnek şimdi bölünmüş ve küçük hazırlamak için kullanılabilir, kodlamayan RNA kütüphaneleri yanı sıra ribo-tükenmiş mRNA ve uzun, kodlamaolmayan RNA kütüphaneleri. Bu protokolü kullanarak globin tükenmiş ve ribo-tükenmiş tam kan örneklerinin ekspresyon kütüphaneleri hazırlandıktan sonra, elektroforez dosya çalışma özeti 6.3 ile 9.2 arasında değişen RNA bütünlüğü numaraları ile globin tükenmiş kütüphane örneği gösterdi. Bu globin tükenme yöntemleri kullanılan ve sadece altı veya yakın RIN numaraları elde edebildi diğer çalışmalara göre bir gelişme olduğunu kanıtladı.Tek bir domuz tam kan örneğinin globin öncesi ve globin sonrası indirgeme oranı nın 260-280 nanometre konsantrasyon oranlarının iki veya üzerinde olduğunu göstermiştir. Bu protokol kullanılarak havuzlama ve sıralama öncesinde globin ve riboz-tükenmiş tam kan mRNA kütüphane örneklerinin çip bazlı elektropherogramları elde edildi. mRNA kütüphaneleri için temsili elektrofegram yaklaşık 280 baz çifti ile zirveye sahiptir.Küçük ncRNA'lar için temsili çip bazlı elektropogramlar yaklaşık 100 ila 400 baz çifti arasında bir dizi tepe içerir. Yaklaşık 143 baz çifti ndeki zirveler miRNA'lara karşılık gelir ve yaklaşık 153 baz çifti ndeki zirveler piRNA'lara karşılık gelir. Bu prosedürü çalışırken, hemen nerede belirtildiği buz tüpleri hatırlamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, diferansiyel ifade, epigenetik değişiklikler ve bunların biyolojik yollar ve süreçler üzerindeki etkileri gibi ek soruları cevaplamak için yeni nesil sıralama gibi başka yöntemler de uygulanmalıdır. Fenol-kloroform reaktifile çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve duman kaputunda çalışma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Ayrıca, tam kan veya enfeksiyöz organizmalar ele alırken, çalışma bulaşıcı organizmanın aktivasyonu önce biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Hızlı Bakteriyel Teşhis ve Antibiyotik Duyarlılık Testi için bir Kan Kültürü Peleti hazırlanması

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...