Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5R01MH094705-04 و R01MH109665-01 إلى Z.J.H.)، كشل روبرتسون علم الأعصاب الصندوق (Z.J.H.)، ونارساد شواغر زمالة (أ فب).

جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية أقرها IACUC في "الربيع الباردة ميناء المختبر"، نيويورك (IACUC #16-13-09-8).
1-دليل فرز الخلايا العصبية الماوس المسمى فلوريسسينتلي
<ol><li>سحب الزجاج ميكروكابيلاريس (انظر الجدول للمواد) إلى 10 – 15 ميكرون خروج القطر باستخدام ساحبة شعرية م...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

دليل الفرز البروتوكول مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي تحت إشراف العصبية المسمى في الدماغ الفئران السكان التي أما أن تكون قليلة أو التي تمثل سكان خلية نادرة أن خلاف ذلك ليس عمليا لدراسة استخدام الخلية الفائق الحالية أساليب الفرز والتضخيم. الخلايا التي تخضع لنظام مراقبة الأصول الميداني?...

وقد تحول خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) دراسات ترانسكريبتوميك. وفي حين يمكن إجراء رناسيق خلية واحدة على نطاق واسع باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، مثل قطرات1،2، ميكروفلويديكس3، نانوجريدس4و5من ميكروويلس، معظم الأساليب لا يمكن فرز أنواع الخلايا المحددة أن التعبير عن فلوروفوريس وراثيا المرمزة. لعزل سكان تحديد خلية، غالباً fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفرز الخلايا المسماة في وضع خلية واحدة. ومع ذلك، نظام مراقبة الأصول الميدانية بعض قيود ويتطلب خطوات تجهيز العينة الدقيق. أولاً، عدد كبير من خلايا الإدخال عادة حاجة (غالباً عدة ملايين الخلايا كل مل)، مع جزء كبير (> 15 – 20%) التي تحتوي على السكان المسمى. ثانيا، قد تتطلب استعدادات خلية جولات متعددة من كثافة الطرد المركزي التدرج الخطوات لإزالة جزء الدبقية، والحطام، وكتل الخلايا التي قد تسد إلا الخلية فوهة أو تدفق. ثالثا، نظام مراقبة الأصول الميدانية توظف عادة تلطيخ وديستاينينج خطوات للعيش/الميت تلطيخ (مثلاً من 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، يوديد propidium (PI)، والأصباغ سيتوتراكير)، الذي يستغرق وقتاً إضافيا. الرابع، كما أن هناك حاجة إلى قاعدة عامة اللونين الفرز (مثل DAPI والبروتين الأخضر الأحمر نيون (التجارة والنقل/RFP))، عادة ما تكون العينتين وعنصر تحكم واحد، التي تتطلب عينة غير مسمى بحيث تتم معالجتها بالإضافة إلى سلالة الماوس المطلوب. خامسا، تصفية غالباً ما تتم عدة مرات قبل وأثناء الفرز عينة شكل استباقي منع الأسطر عينة انسداد في جهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية. سادسا، يجب تخصيص وقت في الأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية الأكثر استخداماً تهيئة واستقرار تدفق السوائل وإجراء المعايرة الحبرية. مراقبة السابعة، يتم عادة تشغيل عينات في تسلسل قبل جمع العينة الفعلية لإعداد مصفوفات التعويض، ورفض يبنوا، تعيين غيتس، مستخدمين إلخ أما ستة وسبعة أنفسهم قبل الموعد المحدد بالخطوات أو تتطلب مساعدة فني بالتوازي. وأخيراً، وظيفة-نظام مراقبة الأصول الميدانية، غالباً ما تكون هناك خطوات للتأكد من أن فقط تسمية واحدة خلايا موجودة في كل بئر؛ على سبيل المثال، بفحص عينات في إعداد فحص محتوى عالية مثل تصوير لوحة سريع.
للتحايل على الخطوات المذكورة أعلاه وتيسير سريعة نسبيا، تستهدف تتابعها من عدد صغير من السكان من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحد، يصف لنا دليل الفرز الإجراء متبوعاً بجولتين من درجة عالية من الحساسية في المختبر بروتوكول التضخيم، دعا مزدوجة في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq). الجيش الملكي النيبالي التضخيم وكدنا توليد المكتبة مقتبسة من أبرون et al. 6 وهاشيمشوني et al. 7، مع إجراء بعض التعديلات لتناسب إينتيرنيورونس الماوس التي لديها كميات أصغر الخلوية؛ وعلاوة على ذلك، وجدنا أيضا أن من المفيد أيضا للخلايا العصبية الهرمية عليه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) الآن أداة تنفذ على نطاق واسع للمعايرة التعبير الجيني. منصات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة متاحة تجارياً عملية خلايا الإدخال جميعا دون تمييز. في بعض الأحيان، يتم استخدام الخلية المنشط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) المنبع لعزل سكان على وجه التحديد مسمى للفائدة. حد من نظام مراقبة الأصول الميدانية هو الحاجة إلى إعداد كبيرة من خلايا الإدخال مع كسور المسمى إلى حد كبير، وغير عملي لجمع وتوصيف السكان العصبية نادرة أو قليلة مسماة من الدماغ الماوس. هنا، نحن تصف طريقة يدوياً جمع متفرق المسمى فلوريسسينتلي واحدة من الخلايا العصبية من طازجة نات بأنسجة المخ الماوس. تسمح هذه العملية لالتقاط المسمى واحد الخلايا العصبية مع درجة نقاء عالية والتكامل اللاحقة مع بروتوكولا تضخيم المستندة إلى النسخ في المختبر أن يحافظ على نسب النسخة المحلية. يمكننا وصف أسلوب تضخيم خطي مزدوج يستخدم معرفات فريدة من نوعها جزيء (أوميس) لتوليد الفرد مرناً التهم. جولتين من نتائج التضخيم في درجة عالية من اكتشاف الجينات كل خلية مفردة.

استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، جابايرجيك الخلايا العصبية كانت يدوياً فرز (الشكل 1) والحمض النووي الريبي تم تضخيمه، ثم إلى مكتبة كدنا (الشكل 2) ومتسلسلة في عمق ارتفاع8. المنتجات تضخيم الحمض النووي الريبي (ارنا) تراوحت بين 20...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)

ويصف هذا البروتوكول دليل الفرز الداخلي لعزل الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحدة تليها في المختبر على أساس النسخ التضخيم مرناً لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عالية والعمق.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في حل عقبة رئيسية في مجال عزل الخلايا العصبية الواحدة والتسلسل. مثل جمع سكان محدد أو مجموعة فرعية من الخلايا العصبية المسماة الفلورسنت من منطقة الدماغ المعرفة من قبل المستخدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تضمن القبض على الخلايا العصبية ذات الاهتمام الواحد دون تلويث الحطام.كما أنها لطيفة نسبيا, وهو أمر مهم لأنواع الخلايا العصبية الهشة التي تموت بسرعة عندما تتعرض لضغوط السوائل من الفرز FACS التقليدية. تبدأ من خلال إعداد الزجاج المسحوب microcapillaries مع 10 إلى 15 ميكرون قطر الخروج باستخدام سحب شعري. استخدام مقص غرامة لقطع غيض من الشعرية للحصول على قطر المجلس المطلوب.ثم استخدام وصلات أنابيب لإرفاق 120-150 سم طول أنابيب السيليكون مرنة مع 0.8 ملليمتر داخل القطر إلى 0.2 ميكرون PVDF غشاء محاقن مرشح وصمام أنابيب في اتجاهين. إعداد 500 ملليلتر من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المبرد أو ACSF والأكسجين عن طريق محتدما 5٪ ثاني أكسيد الكربون الأكسجين متوازنة من خلال Airstone لمدة 15 دقيقة أو حتى الحل يمسح تماما. إعداد ثلاثة 150 ملليلتر قارعة تحتوي كل منها على 100 ملليلتر من ACSF.إلى واحد، إضافة مزيج من حاصرات النشاط. إلى آخر، إضافة كسر المكورات العقدية للبروتيز إلى تركيز نهائي من مليغرام واحد لكل ملليلتر. إلى الكأس النهائي، إضافة FBS إلى تركيز النهائي من 1٪، والأكسجين مع 5٪ الأكسجين متوازنة ثاني أكسيد الكربون من خلال Airstone.وأخيرا، جعل ثلاثة ماصات باستور طويلة ينبع مع انخفاض أقطار الخروج عن طريق المتداول لهم على لهب مفتوح. تشريح الدماغ من فأر القتل الرحيم عن طريق فتح الجمجمة مع مقص صغير واستخراج الدماغ الطازج باستخدام ملقط غرامة دون الإضرار القشرة. ضع الدماغ في ACSF المبرد والأكسجين وترك Airstone متصل بالأكسجين المتوازن من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪خلال مدة القسم بأكملها.ضع الدماغ على تشاك هزلي وقطع أقسام الإكلالي أو القوس في 300 ميكرون سمك. جمع العديد من المقاطع حسب الحاجة للحصول على الحد الأدنى من 10 إلى 50 الخلايا المسماة. وضع شرائح على حامل شريحة القطن المتشابكة وضعت داخل منقار حتى يتم استحمها في ACSF المؤكسج.حرك الشرائح إلى القارس التي تحتوي على ACSF مع حاصرات النشاط وكتلة لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين محتدما الأكسجين باستخدام Airstone. حرك الشرائح إلى القارس التي تحتوي على ACSF مع محلول البروتياز لإجراء عملية الهضم المعتدل في درجة حرارة الغرفة. بعد الهضم، اغسل البروتياز عن طريق تحريك الشرائح إلى الجزء الذي يحتوي على ACSF مع محلول مانع النشاط لمدة تتراوح بين خمس إلى عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.الحفاظ على الأكسجين محتدما. المقبل، وإعداد 100 ملليمتر بتري طبق يحتوي على ACSF مع 1٪ FBS في درجة حرارة الغرفة ونقل المقاطع الفردية في القرص للmicrodissection. تحت نطاق تشريح الفلورسنت، استخدم زوج من ملقط غرامة لتشريح المناطق الدقيقة وطبقات من الفائدة وجود ما لا يقل عن 10 إلى 50 الخلايا.باستخدام ماصة باستور، نقل القطع تشريح الصغرى إلى أنبوب microcentuge 2 ملليلتر التي تحتوي على ما يقرب من 0.8 ملليلتر من 1٪ FBS في حل ACSF. تثليط الأنسجة تشريح في أنبوب ميكرو فوج في درجة حرارة الغرفة. أداء ما يقرب من 10 السكتات الدماغية مع كل من الماصات باستور ملتهب بدءا من أكبر وتنتهي مع أصغر قطر الخروج.الاستغناء عن الخلايا المنفصلة في طبق بيتري 100 ملليمتر يحتوي على ACSF المؤكسج وانتظر خمس إلى سبع دقائق الخلايا لتسوية تدريجيا. مراقبة إشارة GFP وRFP تحت مجهر تشريح. تحديد الحطام من خلال فحص مورفولوجيا تحت الإضاءة في المجال الساطع.مرة واحدة تم تحديد مساحة من الخلايا مع القليل من الحطام، واستخدام الشعرية والتعلق الأنابيب لالتقاط الخلايا عن طريق سد نهاية صمام الأنابيب مع اللسان. ثم ضع الشعيرات الدموية بالقرب من الخلايا. الافراج عن كتلة على شعرية وبسرعة كتلة مرة أخرى لالتقاط الخلية باستخدام عمل شعري.نقل الشعيرية إلى طبق بيتري 100 ملليمتر مع ACSF أكسجين الطازجة وضربة بلطف في الأنبوب أثناء مراقبة طرف الشعرية تحت بصريات الفلوريسل للاستغناء عن الخلايا في الطبق. كرر إجراء الجمع حتى يتم جمع 100 إلى 150 خلية مع التأكد من أن الملوثات، مثل الحطام، هي الحد الأدنى في مجال مشرق التداخل التفاضلي النقيض البصريات. وأخيرا، باستخدام ماصة شعرية صغيرة جديدة في كل مرة، واختيار خلية واحدة وطرده في ما لا يزيد عن 0.5 ميكرولترات في أنبوب 0.2 ميكرولتر مايكرو فوغ يحتوي على ميكرولتر واحد من عينة جمع العازلة مع التمهيديات.كسر تلميح ماصة في أنبوب مايكرو fuge لضمان أن الخلية يبقى في المخزن المؤقت جمع. تجميد الخلايا عن طريق وضع الأنابيب على الجليد الجاف. يُخزن في ثلاجّة مئوية ناقص 80 درجة حتى معالجة تضخيم الحمض النووي الريبي.تم عزل الخلايا العصبية GABAergic من قشرة cingulet من دماغ الماوس. تضخيم الجيش الملكي النيبالي من الخلايا العصبية فرزها يدويا تراوحت بين 200 إلى 4، 000 أزواج قاعدة في الحجم مع توزيع الذروة قليلا فوق 500 أزواج قاعدة. بعد تنقية الخرزة ، يتم تقييد مكتبة cDNA بمزيد من الحجم من خلال جولة ثانية من التنقية باستخدام الخرز للقضاء على الأجزاء الأقل من 200 زوج أساسي وللذروة في حوالي 350 زوجًا أساسيًا.وأظهر التسلسل 4.8 مرات 10 إلى الوسيط الخامس أو 6.9 مرة 10 إلى القراءة التي تم تعيينها في 5th لكل خلية. بعد إزالة RNA مكررة باستخدام UMIs، كل خلية واحدة كان 1.0 مرات 10 إلى الوسيط 5 أو 1.4 مرات 10 إلى المتوسط 5 قراءات فريدة لكل خلية. في كل خلية واحدة رنا الخارجية ضوابط الاتحاد، تم استخدام ارتفاع في الجيش الملكي النيبالي كتحكم داخلي لحساب العدد المطلق من الجزيئات المضافة إلى العينة.كانت هناك علاقة خطية من المدخلات إلى عدد ملاحظ مع ميل 0.92 وR معدلة مربع 0.94. تم الكشف عن متوسط حوالي 10,000 جينات لكل خلية عصبية واحدة باستخدام هذا الإجراء مع أكثر من 95٪ من الخلايا الفردية التي تكتشف أكثر من 6,000 جينات. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأحياء الجزيئية لاستكشاف نسخة من الماوس المتميزة ذات تميز جيد interneurons القشرية ، وحددت فئات الجينات المختارة المسؤولة عن ترميز الهوية الخلوية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

التنميط الجهد بوابات مرنا قناة البوتاسيوم التعبير في الخلايا العصبية Nigral باستخدام خلية واحدة RT - PCR تقنيات

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

تحديد موثوق المعيشة الدوبامين الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الثقافات عن طريق RNA تسلسل وTH يحركها المروج EGFP التعبير

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

تحديد مواقع النسخ Olig2 عامل ربط الجينوم في حدة تنقية PDGFRα + الخلايا من الكروماتين خلية منخفض إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل التحليل

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...