Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01-Z.J.H.), CSHL Robertson neurovidenskab fond (til Z.J.H.) og en NARSAD Post-Doctoral Fellowship (til A.P.).

Alle de procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af IACUC på kolde forår Harbor laboratorium, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manuel sortering af Fluorescently mærket mus neuroner
<ol><li>Trække glas microcapillaries (Se Tabel af materialer) til 10 – 15 µm exit diameter ved hjælp af en kapillær aftrækker med følgende indstillinger: varme: 508, pull: Tom, vel: Tom, tid: Tom.</li>
	<li>Vedhæfte 120 – 150 cm fleksible silikoneslanger (~0.8 mm indvendig d...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Den manuelle sortering protokol er velegnet til en overvåget RNA sekventering af neuron befolkningsgrupper, som er enten sparsomt mærket i hjernen, mus eller repræsenterer en sjælden celle befolkning, som ellers ikke er muligt at studere ved hjælp af aktuelle høj overførselshastighed celle sortering og forstærkning metoder. Celler udsat for FACS normalt gennemgå kappe og prøve linje pres i rækken af ~ 9-14 psi, afhængigt af dyse størrelse og ønskede begivenhed priser. Derudover ved at blive skubbet ud fra d...

Encellede RNA sekventering (RNA-seq) har forvandlet transkriptom undersøgelser. Mens store enkelt-celle RNAseq kan udføres ved hjælp af en række teknikker, som dråber1,2, mikrofluidik3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerede celletyper at udtrykke genetisk kodet fluorophores. For at isolere en Marker celle population, bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) ofte til at sortere mærket celler i en enkelt celle tilstand. FACS har dog nogle begrænsninger og kræver omhyggelig prøve behandlingstrin. Først, et stort antal input celler er typisk behov (ofte flere millioner celler pr. mL), med en betydelig brøkdel (> 15 – 20%) der indeholder mærket befolkningen. For det andet kan celle præparater kræve flere runder af tæthed gradient centrifugering skridt til at fjerne glial brøkdel, snavs og celle klumper, der ellers kan tilstoppe cellen dyse eller flow. For det tredje beskæftiger FACS normalt farvning og affarvning trin for live/døde farvning (fx 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium Iodid (PI) og Cytotracker farvestoffer), som tager op ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to-farve sortering (f.eks DAPI og grøn/rød fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis/RFP)), normalt to prøver og en kontrol er nødvendig, kræver en umærket prøven skal behandles ud over den ønskede mus stamme. For det femte er filtrering ofte udføres flere gange før og under prøven sortering for at proaktivt forhindre tilstoppede prøve linjer i en FACS maskine. Det sjette skal gang tildeles i mest almindeligt anvendte FACS opsætninger til at initialisere og stabilisere den flydende strøm og udføre droplet kalibrering. Syvende, kontrol prøver der typisk køres i rækkefølge før den faktiske prøvetagning til nedsat erstatning matricer, doublet afvisning, indstilling gates, etc. brugere enten udføre trin seks og syv selv god tid eller kræver det hjælp fra en tekniker parallelt. Endelig, post-FACS, der er ofte skridt til at sikre, at kun mærket enkelt celler er til stede i hver brønd; for eksempel, ved at kontrollere prøver i en høj-indhold screening Opsætning såsom en fast plade imager.
For at omgå trinene ovenfor og lette en forholdsvis hurtig, målrettet sekventering af en lille population af enkelt fluorescently mærket neuroner, beskriver vi en manuel sortering procedure efterfulgt af to runder af en yderst følsom in vitro forstærkning protokol, kaldet dobbelt in vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq). RNA forstærkning og cDNA bibliotek generation er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med visse ændringer der passer til mus interneurons, der har mindre cellulære mængder; Derudover har vi også fundet, at det er lige så nyttige for excitatoriske pyramideformet neuroner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Encellede RNA sekventering (RNA-FF.) er nu en bredt implementeret værktøj for materialeprøvning genekspression. Kommercielt tilgængelige encellede RNA-sekventering platforme behandle alle inputceller ukritisk. Nogle gange bruges fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) opstrøms at isolere et specifikt mærket befolkning af interesse. En begrænsning af FACS er behovet for høje antal input celler med betydeligt mærket fraktioner, som er upraktisk for indsamling og profilering sjældne eller tyndt mærket neuron befolkninger fra mus hjernen. Her, beskriver vi en metode til manuelt indsamling sparsomme fluorescently mærket enkelt neuroner fra frisk dissocieres mus hjernevæv. Denne proces giver mulighed for opfange single-mærket neuroner med høj renhed og efterfølgende integration med en in vitro- transskription-baseret forstærkning protokol, der bevarer endogene udskrift nøgletal. Vi beskriver en dobbelt lineær forstærkning metode, der bruger unikt molekyle identifikatorer ((UMIS) velkommen) til at generere enkelte mRNA tæller. To runder af forstærkning resulterer i en høj grad af gen påvisning pr. enkelt celle.

Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, GABAergic neuroner blev manuelt sorteret (figur 1) og RNA blev forstærket, derefter gøres til en cDNA bibliotek (figur 2) og sekventeret på høj dybde8. De forstærkede RNA (Carl) produkter varierede mellem 200 – 4.000 bp i størrelse, med et peak distribution lidt over 500 bp (figur 3A). Perle-renset cDNA bibliotek ble...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Encellede RNA sekventering af Fluorescently mærket mus neuroner ved hjælp af manuel sortering og dobbelt In Vitro transskription med absolut tæller sekventering (DIVA-Seq)

Denne protokol beskriver den manuelle sortering procedure for at isolere enkelt fluorescently mærket neuroner efterfulgt af in vitro- transskription-baserede mRNA forstærkning til høj-dybde encellede RNA sekvensering.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Denne metode kan hjælpe med at løse en vigtig hindring inden for enkelt-neuron isolation og sekventering. Såsom indsamling af specifikke befolkningsgrupper eller en delpopulation af fluorescerende mærket neuron fra brugerdefineret hjerneområde. Den største fordel ved denne teknik er, at det sikrer den enkelte neuron af interesse er fanget uden at forurene snavs.Det er også relativt skånsom, hvilket er vigtigt for skrøbelige neuron typer, der dør hurtigt, når de udsættes for væsketryk af konventionel FACS sortering. Start med at forberede trak glas mikrokapiller med 10 til 15 mikron exit diameter ved hjælp af en kapillær puller. Brug fint saks til at skære spidsen af kapillær for at få den ønskede borddiameter.Brug derefter slangestik til at fastgøre en 120 til 150-centimeter længde af fleksible silikonerør med 0,8 millimeter indvendig diameter til en 0,2 mikron PVDF membran sprøjte filter og en to-vejs slange ventil. Forbered 500 milliliter af kølet kunstig cerebral spinalvæske eller ACSF og oxygenat ved boblende 5% kuldioxid afbalanceret ilt gennem en Airstone i 15 minutter, eller indtil opløsningen rydder helt. Der tilberedes tre 150 milliliterbikker, der hver indeholder 100 milliliter ACSF.Til en, tilføje en cocktail af aktivitet blokkere. Til en anden, tilsæt Streptococcus fraktion for protease til en endelig koncentration af en milligram per milliliter. Til det endelige bægerglas tilsættes FBS til en endelig koncentration på 1%, og der tilsættes 5 % kuldioxidafbalanceret ilt gennem en Airstone.Endelig lave tre lang-stilkede Pasteur pipetter med faldende exit diametre ved at rulle dem over en åben flamme. Disseker hjernen fra en aflivet mus ved at åbne kraniet med en lille saks og udvinde den friske hjerne ved hjælp af fine kraftaffekt uden at beskadige cortex. Placer hjernen i kølet og iltet ACSF forlader en Airstone knyttet til 5% kuldioxid-afbalanceret ilt i hele varigheden af nittet.Placer hjernen på vibratome chuck og skære koronal eller sagittal sektioner på 300 mikron tykkelse. Indsamle så mange sektioner som nødvendigt for at opnå mindst 10 til 50 mærkede celler. Læg skiver på en bomuldsmasket skiveholder placeret inde i et bægerglas, så de er badet i iltet ACSF.Flyt skiverne ind i bægeret, der indeholder ACSF med aktivitetsblokkere, og bloker i 15 til 20 minutter ved stuetemperatur, mens du bobler ilt ved hjælp af en Airstone. Flyt skiverne til bægeret, der indeholder ACSF, med proteaseopløsningen for at udføre mild fordøjelse ved stuetemperatur. Efter fordøjelsen vaskes proteasen ud ved at flytte skiverne tilbage til bægeret, der indeholder ACSF, med aktivitetsblokkeropløsning i fem til 10 minutter ved stuetemperatur.Bliv ved med at boble ilt. Dernæst forberede en 100-millimeter petriskål, der indeholder ACSF med 1% FBS ved stuetemperatur og flytte de enkelte sektioner ind i disken for mikrodissektion. Under en fluorescerende dissektioner rækkevidde, bruge et par fine kraftaffekt til mikro dissekere områder og lag af interesse, der har mindst 10 til 50 celler.Ved hjælp af en Pasteur pipette flyttes de mikrodeknerede stykker til et 2-milliliter mikrocentrifugerør, der indeholder ca. 0,8 milliliter 1%FBS i ACSF-opløsning. Titrere det dissekeret væv i mikro-fugerøret ved stuetemperatur. Udfør ca. 10 slag med hver af de flammede Pasteur pipetter startende med den største og slutter med den mindste udgangsdiameter.Dispenser de dissocierede celler i en 100-millimeter petriskål, der indeholder iltet ACSF og vent fem til syv minutter for cellerne til gradvist at bosætte sig. Overhold GFP- og RFP-signalet under et dissektionsmikroskop. Identificer snavs ved at undersøge morfologien under lys-felt belysning.Når et område af celler med lidt snavs er blevet identificeret, skal du bruge kapillær og fastgør til slanger til at plukke celler ved at blokere enden af slangeventilen med tungen. Placer derefter kapillæren tæt på cellerne. Slip blokken på kapillær og hurtigt blokere igen for at fange cellen ved hjælp af kapillær handling.Flyt kapillær til en 100-millimeter petriskål med frisk iltet ACSF og slag forsigtigt ind i røret, mens du observerer kapillær spidsen under fluorescens optik til at dispensere cellerne ind i skålen. Gentag indsamlingsproceduren, indtil der indsamles 100 til 150 celler, og sørg for, at forurenende stoffer, såsom snavs, er minimale i kontrastoptik med lyse feltforskelle. Endelig skal du ved hjælp af en frisk mikrokapillær pipette hver gang vælge en enkelt celle og udvise den i højst 0,5 mikroliter i et 0,2 mikroliter mikro-fugerør, der indeholder en mikroliter af prøveopsamlingsbuffer med primere.Bryd pipettespidsen i mikro-fugerøret for at sikre, at cellen forbliver i opsamlingsbufferen. Frys cellerne ved at sætte rørene på tøris. Opbevares i en minus 80-graders Celsius fryser indtil behandling for RNA forstærkning.GABAergic neuroner blev isoleret fra cingulet cortex af musen hjernen. RNA forstærket fra de manuelt sorterede neuroner varierede mellem 200 til 4, 000 base par i størrelse med en peak distribution lidt over 500 base par. Efter bead rensning, cDNA biblioteket er yderligere størrelse begrænset af en anden runde af rensning ved hjælp af perler til at fjerne fragmenter mindre end 200 base par og for toppen på ca 350 base par.Sekvensering viste en 4,8 gange 10 til 5th median eller 6,9 gange 10 til den femte gennemsnit kortlagte læser per celle. Efter dobbelt RNA fjernelse ved hjælp af UMIs, hver enkelt celle havde en 1,0 gange 10 til 5th median eller 1,4 gange 10 til den femte gennemsnitlige unikke læser per celle. I hvert eksternt RNA-kontrolkonsortium blev spike i RNA anvendt som en intern kontrol til at beregne det absolutte antal molekyler, der blev tilføjet til prøven.Der var en lineær sammenhæng af input til observerede tal med en hældning på 0,92 og justeret R-kvadrat på 0,94. Et gennemsnit på omkring 10, 000 gener pr enkelt neuron blev opdaget ved hjælp af denne procedure med mere end 95% af de enkelte celler detektering mere end 6, 000 gener. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for molekylærbiologer til at udforske transkriptionen af forskellige vel karakteriserede musekortikale interneuroner og identificerede udvalgte genkategorier, der er ansvarlige for kodning af den cellulære identitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Ikke-Laser Capture Mikroskopi Tilgang til mikrodissektion af diskrete Mouse Brain Regioner for Total RNA Isolation og downstream næste generation sekventering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Enkelt-celle Profilering af at udvikle og Ældre retinaneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Pålidelig Identifikation af Living dopaminerge neuroner i midthjernen Cultures Brug RNA Sequencing og TH-promotor-drevet eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Single-cell RNA-Seq af definerede subsæt af retinale Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet Assay i mus ved hjælp af Fluorescently mærket røbestoffer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

At identificere transskription faktor Olig2 genomisk bindingssteder i akut renset PDGFRα + celler ved lav-celle kromatin Immunoprecipitation sekventering analyse

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Enkelt celle Multiplex Reverse transkription Polymerase Chain Reaction efter Patch-klemme

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering af region-specifikke mikroglia fra en voksen mus hjerne halvkugle for dyb single-celle RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...