Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Dit werk werd gesteund door subsidies van de NIH (5R01MH094705-04 en R01MH109665-01 tot en met Z.J.H.), door het CSHL Robertson Neuroscience Fonds (Z.J.H.) en door een NARSAD Post-Doctoral Fellowship (naar A.P.).

Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de IACUC op de Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. hand sorteren van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen
<ol><li>Trek glas microcapillaries (Zie Tabel van materialen) met 10 – 15 µm afrit diameter een capillaire trekker met de volgende instellingen opgegeven: warmte: 508, pull: leeg, vel: leeg, tijd: leeg.</li>
	<li>120-150 cm flexibele silicone slangen (~0.8 mm binn...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

De handleiding sorteren protocol is geschikt voor een gecontroleerde RNA sequencing van neuron populaties die dun met de label in de hersenen van muizen of vertegenwoordigen een zeldzame celpopulatie die anders niet haalbaar is om te studeren met behulp van de huidige high-throughput cel Sorteer- en versterking methoden. Cellen die zijn onderworpen aan FACS meestal ondergaan schede en monster lijn druk in het bereik van ~ 9-14 psi, afhankelijk van de grootte van het mondstuk en gewenste gebeurtenis tarieven. Daarnaast op...

Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) heeft transcriptomic studies getransformeerd. Terwijl de grootschalige eencellige RNAseq kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid van technieken, zoals druppels1,2, microfluidics3, nanogrids4en5van het microwells, sorteren de meeste methoden gedefinieerd celtypes niet die genetisch gecodeerde fluorophores express. Isoleren van een select-celpopulatie, wordt fluorescentie-activated cell sorting (FACS) vaak gebruikt voor het sorteren van gelabelde cellen in de modus van een eencellige. Er zijn enkele beperkingen heeft echter FACS en vereist zorgvuldige monster verwerking stappen. Ten eerste, een groot aantal invoercellen zijn meestal nodig (vaak meerdere miljoen cellen per mL), met een belangrijke fractie (> 15-20%) met de gelabelde bevolking. Ten tweede, cel preparaten mogelijk meerdere rondes van dichtheid kleurovergang centrifugeren stappen voor het verwijderen van gliale breuk, puin en cel bosjes die anders de mondstuk of stroom cel verstoppen misschien. Ten derde, FACS werken meestal kleuring en destaining stappen voor live/dead kleuring (bijvoorbeeld 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) propidium jodide (PI) en Cytotracker kleurstoffen), die extra tijd in beslag nemen. Ten vierde, als een vuistregel voor twee kleuren sorteren (zoals DAPI en groen/rood fluorescente proteïne (GFP/RFP)), meestal twee monsters en één besturingselement nodig zijn, vereisen een labelloze monster naast de gewenste muis stam worden verwerkt. Ten vijfde: filteren wordt vaak uitgevoerd meerdere malen vóór en tijdens het monster sorteren om proactief te voorkomen dat verstopte monster lijnen in een FACS machine. Ten zesde moet tijd worden toegewezen in de meest gebruikte FACS opstellingen te initialiseren en te stabiliseren van de vloeistof stroom druppel kalibratie uit te voeren. Zevende, controle monsters worden meestal uitgevoerd in volgorde vóór het verzamelen van feitelijke monster om compensatie matrices, doublet afwijzing instellen, instellen van poorten, etc. gebruikers ofwel stappen zes en zeven zich tevoren of vereisen de hulp van een technicus in parallel. Ten slotte, post-FACS, er zijn vaak stappen om ervoor te zorgen dat alleen het label enkele cellen aanwezig in elk putje; bijvoorbeeld door het controleren van monsters bij een instelling met hoog-content screening zoals een snelle plaat imager.
Omzeilen van de bovenstaande stappen te vergemakkelijken een relatief snelle, gerichte sequencing van een kleine populatie van één fluorescently geëtiketteerde neuronen, beschrijven we een handleiding sorteren procedure gevolgd door twee rondes van een hooggevoelige in vitro versterking protocol, dubbele in-vitro transcriptie met absolute aantallen sequencing (DIVA-Seq) genoemd. De RNA-versterking en cDNA Bibliotheek generatie zijn aangepast van Eberwine et al. 6 en Hashimshony et al. 7, met enkele wijzigingen aan de muis interneuronen hebben kleinere cellulaire volumes; Bovendien, we hebben ook geconstateerd dat er even nuttig voor excitatory piramidale neuronen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Eencellige RNA sequencing (RNA-seq) is nu een grote schaal uitgevoerde hulpmiddel voor het analyseren van genexpressie. Commercieel beschikbare eencellige RNA-sequencing platforms verwerken alle invoercellen lukraak. Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) wordt soms stroomopwaarts gebruikt voor het isoleren van een specifiek gelabelde bevolking van belang. Een beperking van FACS is de noodzaak voor hoge aantallen invoercellen met aanzienlijk gelabelde breuken, onpraktisch voor het verzamelen en profilering van zeldzame of dunbevolkte gelabelde neuron populaties van de hersenen van de muis. Hier beschrijven we een methode voor het handmatig verzamelen van sparse fluorescently label één neuronen van vers losgekoppeld muis hersenweefsel. Dit proces zorgt voor het vastleggen van single-geëtiketteerden neuronen met hoge zuiverheid en verdere integratie met een in vitro transcriptie gebaseerde amplificatie protocol dat endogene transcript verhoudingen behouden. We beschrijven een dubbele lineaire versterking-methode die unieke molecuul-id's (UMIs) gebruikt voor het genereren van afzonderlijke mRNA graven. Twee rondes van versterking resulteert in een hoge mate van gene detectie per eencellige.

Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, GABAergic neuronen handmatig werden gesorteerd op (Figuur 1) en RNA versterkt, vervolgens werd verfilmd een cDNA Bibliotheek (Figuur 2) en sequenced op hoge diepte8. De versterkte RNA (aRNA) producten varieerde van 200-4000 bp in grootte, met een verdeling van de piek iets boven 500 bp (figuur 3A). De kraal-gezuiverd cDNA...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Eencellige RNA Sequencing van Fluorescently geëtiketteerde muis neuronen met behulp van handmatig sorteren en dubbele In Vitro transcriptie met Absolute aantallen Sequencing (DIVA-Seq)

Dit protocol beschrijft de procedure om te isoleren van één fluorescently geëtiketteerde neuronen gevolgd door in vitro transcriptie gebaseerde mRNA versterking voor hoge-diepte eencellige RNA sequencing sorteren handleiding.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Deze methode kan helpen bij het oplossen van een belangrijk obstakel op het gebied van single-neuron isolatie en sequencing. Zoals het verzamelen van specifieke populatie of een subpopulatie van fluorescerend gelabeld neuron uit door de gebruiker gedefinieerd hersengebied. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zorgt ervoor dat de enkele neuron van belang wordt gevangen zonder vervuilende puin.Het is ook relatief zacht, wat belangrijk is voor fragiele neuron types die snel sterven wanneer onderworpen aan de vloeistof druk van conventionele FACS sorteren. Begin met het bereiden van getrokken glazen microcapillaries met een uitgangsdiameter van 10 tot 15 micron met behulp van een capillaire trekker. Gebruik fijne schaar om de punt van de capillaire te snijden om de gewenste board diameter te krijgen.Gebruik vervolgens buizenconnectoren om een 120 tot 150 centimeter lange flexibele siliconen slang met een binnendiameter van 0,8 millimeter te bevestigen aan een 0,2 micron PVDF membraanspuitfilter en een tweerichtingsbuizenklep. Bereid 500 milliliter gekoelde kunstmatige cerebrale spinale vloeistof of ACSF en zuurstofaat door borrelen 5%kooldioxide evenwichtige zuurstof door middel van een airstone gedurende 15 minuten of totdat de oplossing volledig wist. Bereid drie bekers van 150 milliliter met elk 100 milliliter ACSF.Voeg er een cocktail van activiteitenblokkers toe. Aan een andere, voeg Streptococcus fractie voor protease aan een laatste concentratie van een milligram per milliliter. Voeg aan het laatste bekerglas FBS toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% en zuurstof met 5% koolstofdioxide-uitgebalanceerde zuurstof via een Airstone.Maak ten slotte drie pasteurpipettes met lange steel met afnemende uitgangsdiameters door ze over een open vlam te rollen. Ontleden de hersenen van een geëuthanaseerde muis door het openen van de schedel met een kleine schaar en het extraheren van de verse hersenen met behulp van fijne tangen zonder beschadiging van de cortex. Plaats de hersenen in gekoelde en zuurstofrijk ACSF waardoor een Airstone bevestigd aan 5%kooldioxide-evenwichtige zuurstof tijdens de gehele duur van de sectie.Plaats de hersenen op de vibratome chuck en snijd coronale of sagittale secties op 300 micron dikte. Verzamel zoveel secties als nodig is om een minimum van 10 tot 50 gelabelde cellen te verkrijgen. Leg plakjes op een katoenmazige slice houder geplaatst in een beker, zodat ze worden badend in zuurstofrijk ACSF.Verplaats de plakjes in het bekerglas met ACSF met activiteitsblokkers en blok gedurende 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur terwijl u zuurstof borrelt met behulp van een Airstone. Verplaats de plakjes naar het bekerglas met ACSF met de protease-oplossing om een milde spijsvertering bij kamertemperatuur uit te voeren. Na de spijsvertering, was de protease door het verplaatsen van plakjes terug naar de beker met ACSF met activiteit blocker oplossing voor vijf tot 10 minuten op kamertemperatuur.Blijf zuurstof borrelen. Bereid vervolgens een petrischaal van 100 millimeter met ACSF met 1%FBS bij kamertemperatuur en verplaats afzonderlijke secties in de schijf voor microdissection. Gebruik onder een fluorescerende dissecties toepassingsgebied een paar fijne tangen om gebieden en lagen van belang met een minimum van 10 tot 50 cellen te micro-ontleden.Verplaats met behulp van een Pasteur pipet de micro-ontleede stukken naar een 2 milliliter microcentrifugebuis met ongeveer 0,8 milliliter van 1%FBS in ACSF-oplossing. Titreert het ontleed weefsel in de microfuge buis bij kamertemperatuur. Voer ongeveer 10 slagen uit met elk van de gevlamde Pasteur pipetten te beginnen met de grootste en eindigend met de kleinste exit diameter.Doe de gescheiden cellen in een petrischaaltje van 100 millimeter met zuurstofrijk ACSF en wacht vijf tot zeven minuten tot de cellen zich geleidelijk vestigen. Let op het GFP- en RFP-signaal onder een dissectiemicroscoop. Identificeer puin door het onderzoeken van de morfologie onder heldere-veld verlichting.Zodra een gebied van cellen met weinig puin is geïdentificeerd, gebruik maken van de capillaire en hechten aan buizen om cellen te plukken door het blokkeren van het einde van de slang klep met de tong. Plaats vervolgens de capillaire dicht bij de cellen. Laat het blok los op de capillaire en blokkeer snel opnieuw om de cel vast te leggen met capillaire actie.Verplaats de capillaire naar een 100-millimeter petrischaal met verse zuurstofhoudende ACSF en blaas zachtjes in de buis tijdens het observeren van de capillaire tip onder fluorescentie optica om de cellen in de schotel af te leveren. Herhaal de opvangprocedure tot er 100 tot 150 cellen worden verzameld om ervoor te zorgen dat verontreinigingen, zoals vuil, minimaal zijn in contrastoptica met een rooskleurig differentieel. Ten slotte, met behulp van een verse micro-capillaire pipet elke keer, kies een enkele cel en verdrijven in niet meer dan 0,5 microliter in een 0,2 microliter micro-fuge buis met een microliter van monster-collectie buffer met primers.Breek de pipetpunt in de microfugebuis om ervoor te zorgen dat de cel in de opvangbuffer blijft. Vries de cellen door het zetten van de buizen op droog ijs. Bewaar in een min 80-graden Celsius vriezer tot verwerking voor RNA versterking.GABAergic neuronen werden geïsoleerd uit de cingulet cortex van de muis hersenen. RNA versterkt van de handmatig gesorteerde neuronen varieerde tussen 200 tot 4,000 basisparen in grootte met een piekverdeling iets boven de 500 basisparen. Na de zuivering van kralen wordt de cDNA-bibliotheek verder groot door een tweede ronde zuivering met kralen om fragmenten van minder dan 200 basisparen te elimineren en voor de piek op ongeveer 350 basisparen.Sequencing toonde een 4,8 keer 10 tot de 5e mediaan of 6,9 keer 10 tot de 5e gemiddeld in kaart gebrachte leest per cel. Na dubbele RNA-verwijdering met UMI's had elke cel een 1,0 keer 10 tot de 5e mediaan of 1,4 keer 10 tot het 5e gemiddelde unieke leest per cel. In elke eencellige externe RNA-besturingselementen consortium, piek in RNA werd gebruikt als een interne controle om het absolute aantal moleculen toegevoegd aan het monster te berekenen.Er was een lineaire verhouding van input aan waargenomen tellingen met een helling van 0.92 en aangepast R vierkant van 0.94. Een gemiddelde van ongeveer 10.000 genen per enkel neuron werden gedetecteerd met behulp van deze procedure met meer dan 95% van de enkele cellen detecteren meer dan 6,000 genen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor moleculaire biologen om het transcriptonoom van verschillende goed gekarakteriseerde muizencorticale interneurons te verkennen en bepaalde gencategorieën te identificeren die verantwoordelijk zijn voor het coderen van de cellulaire identiteit.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Profiling Voltage-gated kalium kanaal mRNA expressie in Nigral Neuronen met behulp van Single-cell RT-PCR-technieken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identificeren van transcriptie Factor Olig2 Genomic bandplaatsen in acuut gezuiverd PDGFRα + cellen door lage-cel chromatine Immunoprecipitation Sequencing analyse

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Eencellige Multiplex omgekeerde transcriptie Polymerase-kettingreactie na Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...