Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (5R01MH094705 / 04 und R01MH109665-01, Z.J.H.), CSHL Robertson Neurowissenschaften Fonds (Z.J.H.) und ein NARSAD Postdoc-Stipendium (für A.P.) unterstützt.

Alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen wurden von IACUC am Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8) genehmigt.
1. manuelle Sortierung der Gewebekulturen beschrifteten Maus Neuronen
<ol><li>Ziehen Sie Glas Mikrokapillaren (siehe Tabelle der Materialien), 10 – 15 µm Ausfahrt Durchmesser mit Hilfe einer Kapillare Abzieher mit den folgenden Einstellungen: Hitze: 508, ziehen: leer, Vel: leer, Zeit: leer.</li>
	<li>Ein 0,2 µm Polyvinylidene Difluoride ...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Das manuelle Sortieren Protokoll eignet sich für eine betreute RNA Sequenzierung des Neurons Populationen, die entweder dünn mit der Bezeichnung im Gehirn von Mäusen oder repräsentieren eine seltene Zellpopulation, die sonst nicht möglich ist, mit aktuellen Hochdurchsatz-Zelle zu studieren Sortierung und Verstärkung Methoden. Zellen ausgesetzt FACS in der Regel durchlaufen Mantel und Probe Linie Drücke im Bereich von ~ 9 – 14 Psi, je nach Düsengröße und Ereignisraten gewünscht. Darüber hinaus können die Ze...

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) verwandelte transkriptomischen Studien. Während große einzellige RNAseq ausgeführt werden kann, mit einer Vielzahl von Techniken, wie Tropfen1,2, Mikrofluidik3, Nanogrids4und Mikrovertiefungen5, können nicht die meisten Methoden definierte Zelltypen sortieren. genetisch codierte Fluorophore ausdrücken. Um eine wählen Sie die Zellenbevölkerung zu isolieren, wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) häufig verwendet, um markierte Zellen in eine einzelne Zelle Modus zu sortieren. Allerdings FACS hat einige Einschränkungen und erfordert sorgfältige Verarbeitung Beispielschritte. Erstens eine große Anzahl von Eingabezellen sind in der Regel benötigt (oft mehrere Millionen Zellen pro mL), mit einem signifikanten Anteil (> 15 – 20 %) mit der beschrifteten Bevölkerung. Zweitens können Zelle Vorbereitungen erfordern mehrfache Umläufe der Dichte Gradienten Zentrifugation Schritte zum Entfernen von Gliazellen Bruchteil, Schmutz und Zelle-Klumpen, die sonst die Düse oder Flow Zelle verstopfen könnte. Drittens: FACS beschäftigt in der Regel färben und Entfärben Schritte für die lebenden/Toten Färbung (z. B. 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Propidium Jodid (PI) und Cytotracker Farbstoffe), die zusätzliche Zeit in Anspruch nehmen. Viertens: als Faustregel für Zweifarben-Sortierung (z. B. DAPI und grün/rot fluoreszierenden Proteins (GFP/RFP)), in der Regel zwei Proben und ein Steuerelement benötigt werden, erfordern eine unbeschriftete Probe neben die gewünschte Maus Belastung verarbeitet werden. Fünftens ist Filterung oft mehrmals vor und während der Probe zu sortieren, um proaktiv verhindert verstopfte Querprofillinien in ein FACS-Maschine durchgeführt. Sechstens muss Zeit zugeteilt werden, in am häufigsten verwendeten FACS-Setups zu initialisieren und stabilisieren den Fluidstrom und Tröpfchen Kalibrierung durchführen. Siebte, Kontrolle, die Proben in der Regel in der Reihenfolge vor der eigentlichen Probenentnahme Entschädigung Matrizen, Wams Ablehnung einzurichten laufen, Tore, etc. Benutzer entweder führen Sie die Schritte 6 bis 7 sich vorzeitig oder erfordern die Hilfe eines Technikers parallel. Zu guter Letzt Post-FACS, oft gibt es Maßnahmen, um sicherzustellen, dass nur einzelne beschriftet Zellen sind in jede Vertiefung; zum Beispiel durch Überprüfung Proben in einem High-Content-Screening-Setup wie eine schnelle Platte-Imager.
Um die oben beschriebenen Schritte zu umgehen und erleichtern eine relativ schnelle, gezielte Sequenzierung von eine kleine Population von einzelnen Eindringmittel beschrifteten Neuronen, beschreiben wir eine manuelle Sortieren gefolgt von zwei Runden von einem hochsensiblen in-vitro- Verfahren Verstärkung-Protokoll, genannt double in-vitro-Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq). Die RNA-Verstärkung und cDNA-Bibliothek-Generation sind von Eberwine Et al. 6 und Hashimshony Et al. 7, mit bestimmten Modifikationen entsprechend Maus Interneuronen, die kleinere zelluläre Volumen haben; Darüber hinaus haben wir auch gefunden, dass es ebenso nützlich für exzitatorischen pyramidale Neuronen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Einzelne Zelle RNA Sequenzierung (RNA-Seq) ist jetzt ein weit implementierten Werkzeug für die Untersuchung der Genexpression. Handelsübliche einzellige RNA-Sequenzierung Plattformen verarbeiten alle Eingabezellen wahllos. Manchmal wird Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) stromaufwärts verwendet, um einen speziell gekennzeichneten Bevölkerung von Interesse zu isolieren. Eine Einschränkung des FACS ist die Notwendigkeit für eine hohe Anzahl von Eingabezellen mit deutlich beschrifteten Brüche, unpraktisch zum sammeln und Profilerstellung seltene oder spärlich beschrifteten Neuron Populationen aus dem Gehirn der Maus. Hier beschreiben wir eine Methode für manuell sammeln spärlich Eindringmittel mit der Bezeichnung einzelner Neuronen aus frisch Maus Hirngewebe dissoziiert. Dieser Prozess ermöglicht es für die Erfassung mit der Bezeichnung der einzelnen Neuronen mit hoher Reinheit und anschließende Integration mit einer in-vitro- Transkription-basierte Verstärkung Protokoll, die endogene Transkript Verhältnisse bewahrt. Wir beschreiben eine doppelte lineare Verstärkung-Methode, die einzigartige Molekül Bezeichner (UMIs) verwendet, um einzelne mRNA zählt zu generieren. Zwei Runden der Verstärkung ergibt ein hohes Maß an gen-Erkennung pro Einzelzelle.

Mit der oben beschriebenen Protokoll, GABAergen Neuronen manuell wurden sortiert (Abbildung 1) und RNA wurde verstärkt, dann in eine cDNA-Bibliothek (Abbildung 2) und bei großer Tiefe8sequenziert. Die verstärkte RNA (aRNA) Produkte lagen zwischen 200 – 4.000 bp in der Größe, mit einer Spitze Verteilung leicht über 500 bp (Abb. 3A). Die Perle-gereinigte cDNA-Bibliothek ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Einzellige RNA Sequenzierung von Eindringmittel beschrifteten Maus Neuronen mit Handsortierung und doppelte In Vitro Transkription mit absoluten zählt Sequenzierung (DIVA-Seq)

Dieses Protokoll beschreibt das manuelle Sortieren Verfahren, um einzelne Eindringmittel beschrifteten Neuronen, gefolgt von in-vitro- Transkription-basierte mRNA Verstärkung für die hoch-Tiefe einzellige RNA Sequenzierung zu isolieren.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Diese Methode kann helfen, ein Haupthindernis im Bereich der Single-Neuron-Isolation und -Sequenzierung zu lösen. Wie das Sammeln einer bestimmten Population oder einer Subpopulation von fluoreszierend markierten Neuronen aus dem benutzerdefinierten Hirnbereich. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sicherstellt, dass das einzelne Neuron von Interesse erfasst wird, ohne Denreste zu kontaminieren.Es ist auch relativ sanft, was für empfindliche Neuronentypen wichtig ist, die schnell sterben, wenn sie den Flüssigkeitsdrücken der konventionellen FACS-Sortierung ausgesetzt sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung gezogener Glasmikrokapillaren mit 10 bis 15 Mikron Austrittsdurchmesser mit einem Kapillarzieher. Verwenden Sie eine feine Schere, um die Spitze der Kapillare zu schneiden, um den gewünschten Plattendurchmesser zu erhalten.Verwenden Sie dann Schlauchstecker, um einen 120 bis 150 Zentimeter langen flexiblen Silikonschlauch mit 0,8 Millimeter Innendurchmesser an einen 0,2-Mikron-PVDF-Membranspritzenfilter und ein Zwei-Wege-Schlauchventil zu befestigen. Bereiten Sie 500 Milliliter gekühlte künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder ACSF vor und sauerstoffhaltigen, indem Sie 5% Kohlendioxid-Ausbader Sauerstoff durch einen Airstone für 15 Minuten oder bis die Lösung vollständig abklarheiten. Bereiten Sie drei 150-Milliliter-Becher mit je 100 Milliliter ACSF vor.Fügen Sie einen Cocktail von Aktivitätsblockern hinzu. Zu einem anderen, fügen Sie Streptococcus-Fraktion für Protease zu einer endgültigen Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Zum Endbecher, fügen Sie FBS zu einer Endkonzentration von 1% hinzu und sauerstoffhaltigen mit 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff durch einen Airstone.Schließlich machen Sie drei langstämmige Pasteur Pipetten mit abnehmenden Austrittsdurchmessern, indem Sie sie über eine offene Flamme rollen. Sezieren Sie das Gehirn von einer eingeschläferten Maus, indem Sie den Schädel mit einer kleinen Schere öffnen und das frische Gehirn mit feinen Zangen extrahieren, ohne den Kortex zu beschädigen. Legen Sie das Gehirn in gekühlten und sauerstoffhaltigen ACSF und hinterlassen Sie einen Airstone, der während der gesamten Dauer des Schnitts an 5% Kohlendioxid-ausbalanciertem Sauerstoff gebunden ist.Positionieren Sie das Gehirn auf dem Vibratomfutter und schneiden Sie koronale oder sagittale Abschnitte bei 300 Mikron Dicke. Sammeln Sie so viele Abschnitte wie nötig, um mindestens 10 bis 50 markierte Zellen zu erhalten. Legen Sie Scheiben auf einen baumwollmaschigen Scheibenhalter, der in einen Becher gelegt wird, damit sie in sauerstoffhaltigem ACSF gebadet werden.Bewegen Sie die Scheiben in den Becher, der ACSF mit Aktivitätsblockern enthält, und blockieren Sie 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie mit einem Airstone Sauerstoff sprudeln. Bewegen Sie die Scheiben auf den Becher, der ACSF enthält, mit der Protease-Lösung, um eine leichte Verdauung bei Raumtemperatur durchzuführen. Waschen Sie nach der Verdauung die Protease aus, indem Sie die Scheiben bei Raumtemperatur fünf bis zehn Minuten lang wieder in den Becher mit ACSF mit Aktivitätsblockerlösung bewegen.Halten Sie sprudelnden Sauerstoff. Als nächstes bereiten Sie eine 100-Millimeter-Petrischale mit ACSF mit 1%FBS bei Raumtemperatur vor und bewegen Sie einzelne Abschnitte in die Scheibe für die Mikrodissektion. Verwenden Sie unter einem fluoreszierenden Sezieren Bereich ein Paar feiner Zangen, um Bereiche und Interessenschichten mit mindestens 10 bis 50 Zellen mikrosezieren zu können.Mit einer Pasteur-Pipette bewegen Sie die mikrosezierten Teile in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das etwa 0,8 Milliliter 1%FBS in ACSF-Lösung enthält. Tittieren Sie das sezierte Gewebe im Mikrofugerohr bei Raumtemperatur. Führen Sie ca. 10 Schläge mit jeder der geflammten Pasteur Pipetten aus, beginnend mit der größten und endend mit dem kleinsten Austrittsdurchmesser.Geben Sie die dissoziierten Zellen in eine 100-Millimeter-Petrischale mit sauerstoffhaltigem ACSF und warten Sie fünf bis sieben Minuten, bis sich die Zellen allmählich absetzen. Beobachten Sie das GFP- und RFP-Signal unter einem Seziermikroskop. Identifizieren Sie Trümmer, indem Sie die Morphologie unter Hellfeldbeleuchtung untersuchen.Sobald ein Zellbereich mit wenig Schutt identifiziert wurde, verwenden Sie die Kapillare und befestigen Sie an Schläuchen, um Zellen zu pflücken, indem Sie das Ende des Schlauchventils mit der Zunge blockieren. Positionieren Sie dann die Kapillare in der Nähe der Zellen. Lösen Sie den Block auf der Kapillare und blockieren Sie schnell wieder, um die Zelle mit Kapillarwirkung zu erfassen.Bewegen Sie die Kapillare auf eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem sauerstoffreichem ACSF und blasen Sie sanft in das Rohr, während Sie die Kapillarspitze unter Fluoreszenzoptik beobachten, um die Zellen in die Schale zu geben. Wiederholen Sie den Sammelvorgang, bis 100 bis 150 Zellen gesammelt werden, um sicherzustellen, dass Verunreinigungen wie Schmutz in der Optik für unterschiedliche Störwellen im hellen Feld minimal sind. Schließlich wählen Sie mit einer frischen Mikrokapillarpipetten jedes Mal eine einzelne Zelle aus und vertreiben Sie sie in nicht mehr als 0,5 Mikroliter in ein 0,2-Mikroliter-Mikrofuge-Rohr, das einen Mikroliter Probensammelpuffer mit Primern enthält.Brechen Sie die Pipettenspitze im Mikrofugerohr, um sicherzustellen, dass die Zelle im Sammelpuffer verbleibt. Einfrieren der Zellen, indem Sie die Rohre auf Trockeneis setzen. In einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius bis zur Verarbeitung zur RNA-Verstärkung aufbewahren.GABAerge Neuronen wurden aus dem Cingulet Cortex des Mausgehirns isoliert. Die aus den manuell sortierten Neuronen verstärkten RNA-Verstärkungen lagen zwischen 200 und 4.000 Basenpaaren mit einer Spitzenverteilung von etwas über 500 Basenpaaren. Nach der Perlenreinigung wird die cDNA-Bibliothek durch eine zweite Reinigungsrunde mit Perlen zur Beseitigung von Fragmenten von weniger als 200 Basenpaaren und für den Spitzenwert bei etwa 350 Basenpaaren weiter eingeschränkt.Die Sequenzierung zeigte 4,8 mal 10 bis 5. Median oder 6,9 mal 10 bis zum 5. durchschnittlich enden den zugeordneten Lesevorgängen pro Zelle. Nach der doppelten RNA-Entfernung mit UMIs hatte jede einzelne Zelle 1,0 mal 10 bis 5. Median oder 1,4 mal 10 bis zum 5. durchschnittlichen eindeutigen Lesewert pro Zelle. In jedem einzelnen externen RNA-Kontrollkonsortium wurde die RNA-Spitze als interne Kontrolle verwendet, um die absolute Anzahl der Moleküle zu berechnen, die der Probe hinzugefügt wurden.Es gab eine lineare Beziehung der Eingabe zu beobachteten Zählungen mit einer Neigung von 0,92 und einem angepassten R-Quadrat von 0,94. Mit diesem Verfahren wurden durchschnittlich etwa 10.000 Gene pro einzelnem Neuron nachgewiesen, wobei mehr als 95 % der einzelzellen mehr als 6.000 Gene detektieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Molekularbiologen, das Transkriptom von verschiedenen gut charakterisierten Mauskortika-Interneurons zu erforschen, und identifizierte ausgewählte Genkategorien, die für die Kodierung der zellulären Identität verantwortlich sind.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...