Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (5R01MH094705-04, R01MH109665-01 כדי Z.J.H.), על ידי הקרן Neuroscience רוברטסון CSHL (ל Z.J.H.), ועל ידי NARSAD לפוסט מלגת (אקולוגיה).

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי IACUC קר ספרינג הרבור מעבדה, ניו יורק (IACUC #16-13-09-8).
1. מיון ידני של העכבר Fluorescently שכותרתו נוירונים
<ol><li>למשוך 10 – 15 מיקרומטר קוטר יציאה באמצעות ההגדרות הבאות של פולר נימי זכוכית microcapillaries (ראה טבלה של חומרים): חום: 508, משיכה: רי?...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

המדריך מיון פרוטוקול מתאים רצפי RNA תחת פיקוח של נוירון אוכלוסיות שהן גם בדלילות שכותרתו במוח עכברים או הם המייצגים אוכלוסיה תא נדיר כי אחרת אינו אפשרי ללמוד באמצעות התא הנוכחי תפוקה גבוהה שיטות מיון של הגברה. התאים נתון FACS בדרך כלל עוברים לחצים קו נדן ודגימת בטווח של psi ~ 9 – 14, תלוי בגודל הח?...

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הפכה מחקרים transcriptomic. בעוד RNAseq תא יחיד בקנה מידה גדול יכול להתבצע תוך שימוש במגוון טכניקות, כגון טיפות1,2, מיקרופלואידיקה3, nanogrids4, microwells5, לרוב השיטות לא ניתן למיין את סוגי תאים מוגדרים זה בטא fluorophores מקודדים גנטית. כדי לבודד אוכלוסיה בחר תא, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש לעתים קרובות כדי למיין תאים עם תוויות במצב תא בודד. עם זאת, FACS יש הגבלות מסוימות ומחייב שלבי עיבוד הדגימה מוקפד. ראשית, מספר גדול של תאי קלט הם בדרך כלל צורך (לעיתים קרובות מספר מיליון תאים לכל mL), עם חלק קטן משמעותית (> 15 – 20%) המכיל את האוכלוסייה עם תוויות. שנית, ההכנות התא עשויים לדרוש מספר סיבובים של צפיפות שלבים הדרגתיים צנטריפוגה כדי להסיר שבר גליה, פסולת, ובתצורות תא כי אחרת עלול לסתום את התא חרירים או זרימה. שלישית, FACS מעסיקה בדרך כלל מכתים, destaining צעדים חי/מת מכתים (למשל, 4 ′ 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), propidium יודיד (PI), צבעי Cytotracker), אשר לקחת את הזמן נוספים. רביעית, כמו כלל אצבע על שני צבעים מיון (כגון דאפי חלבון פלואורסצנטי ירוק/אדום (GFP/RFP)), בדרך כלל שני מדגמים ובקרת אחד נדרשים, הדורשים דוגמה ללא תווית יעובדו בנוסף המתח העכבר הרצויה. חמישית, סינון מבוצעת לעיתים קרובות מספר פעמים לפני ובמהלך מדגם מיון באופן יזום למנוע שורות מדגם סתומות מכשיר FACS. שישית, זמן חייב להקציב ב כיוונוני FACS הנפוץ לאתחל, לייצב את זרם נוזלים, לבצע כיול droplet. שביעית, שליטה דגימות מופעלים בדרך כלל ברצף לפני באוסף הדגימה בפועל כדי להגדיר פיצוי מטריצות, כפיל דחייה, הגדרת שערים, וכדומה משתמשים גם לבצע צעדים שש ושבע עצמם מבעוד מועד או לדרוש סיוע של טכנאי במקביל. לבסוף, פוסט-FACS, לעיתים קרובות ישנם צעדים כדי להבטיח כי רק תווית יחידה תאים הם נוכח כל טוב; לדוגמה, על-ידי בדיקת דגימות בתוך מלכודת הקרנה גבוהה-תוכן כגון imager צלחת מהיר.
כדי לעקוף את השלבים שפורטו לעיל ולהקל יחסית מהיר, ממוקד רצף של אוכלוסיה קטנה של נוירונים שכותרתו fluorescently יחיד, אנו מתארים ידנית מיון הליך ואחריו שני סיבובים של רגישות גבוהה חוץ גופית בתוך פרוטוקול הגברה, נקרא שעתוק הפריה כפולה עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq). דור הגברה RNA ספריית cDNA המותאמים מ. Eberwine et al. 6 והשמשוני. et al. 7, עם שינויים מסוימים כדי להתאים interneurons העכבר שיש כרכים הסלולר קטן יותר; יתר על כן, מצאנו גם כי זה שהנשק של נוירונים כפירמידה סינאפסות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הוא כעת כלי מיושמים באופן נרחב assaying ביטוי גנים. פלטפורמות זמינים מסחרית של רצפי RNA בתא יחיד לעבד תאי כל קלט ללא אבחנה. לפעמים, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש במעלה הנהר כדי לבודד אוכלוסיה ספציפית עם תוויות של ריבית. מגבלה של FACS הוא בצורך מספר גבוה של תאי קלט עם שברים שכותרתו באופן משמעותי, אשר אינה מעשית עבור איסוף והגדרת פרופיל נדיר או בדלילות שכותרתו נוירון אוכלוסיות מהמוח העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה עבור באופן ידני איסוף דליל fluorescently שכותרתו נוירונים יחיד של טרי הפומבית רקמת מוח העכבר. תהליך זה מאפשר לכידת נוירונים התווית על-ידי יחיד עם טוהר גבוהה ושילוב הבאים עם במבחנה הגברה מבוססת-תמלול פרוטוקול ששומרת יחסי התעתיק אנדוגני. אנו מתארים שיטה הגברה ליניארי זוגי המשתמשת מזהים ייחודיים מולקולה (UMIs) כדי ליצור ספירות mRNA בודדות. שני סיבובים של הגברה תוצאות ברמה גבוהה של זיהוי גנים לכל תא ותא.

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, GABAergic העצב היו ידנית למיין (איור 1) ואז RNA היה מוגבר, הפך ספריית cDNA (איור 2) וסודרו עומק גבוה8. המוצרים RNA (ארנה) מוגבר נע בין 200 – 4,000 bp בגודל, עם התפלגות שיא מעט מעל 500 bp (איור 3 א). ספריית cD...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

רצפי RNA בתא יחיד של נוירונים Fluorescently שכותרתו העכבר באמצעות מיון ידני וכפול במבחנה תמלול עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq)

פרוטוקול זה מתאר את המדריך מיון ההליך כדי לבודד את הנוירונים fluorescently שכותרתו יחיד ואחריו במבחנה מבוסס-תמלול mRNA הגברה עבור רצפי RNA תא בודד גבוה-עומק.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

שיטה זו יכולה לעזור לפתור מכשול מרכזי בתחום הבידוד והתהוות של נוירון יחיד. כגון איסוף אוכלוסייה ספציפית או תת-אוכלוסייה של נוירון בעל תווית פלואורסצנטית מאזור המוח המוגדר על-ידי המשתמש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מבטיחה את הנוירון היחיד של עניין נתפס ללא פסולת מזהמת.זה גם עדין יחסית, וזה חשוב עבור סוגי נוירונים שבירים שמתים במהירות כאשר נתון ללחצים הנוזליים של מיון FACS קונבנציונלי. התחל על ידי הכנת microcapillaries זכוכית משך עם 10 עד 15 מיקרון קוטר יציאה באמצעות מושך נימי. השתמש מספריים עדין לחתוך את קצה נימי כדי לקבל את קוטר הלוח הרצוי.לאחר מכן השתמשו במחברי צינורות כדי לחבר אורך של 120 עד 150 ס"מ של צינורות סיליקון גמישים בקוטר פנימי של 0.8 מילימטר למסנן מזרק ממברנה PVDF מיקרון 0.2 ושסתום צינור דו כיווני. הכינו 500 מיליליטר של נוזל שדרה מלאכותי מקורר או ACSF וחמצן על ידי מבעבע 5%פחמן דו חמצני מאוזן חמצן דרך Airstone במשך 15 דקות או עד הפתרון מתנקה לחלוטין. הכינו שלוש חבילות של 150 מיליליטר שכל אחת מהן מכילה 100 מיליליטר של ACSF.לאחד, להוסיף קוקטייל של חוסמי פעילות. לאחר, להוסיף שבר סטרפטוקוקוס לפרוטאז לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. לסק הסופי, מוסיפים FBS לריכוז סופי של 1% ומחמצנים עם 5% חמצן מאוזן פחמן דו חמצני דרך איירסטון.לבסוף, לעשות שלוש פיפטים פסטר לטווח ארוך עם קטי ירידה בקוטר היציאה על ידי גלגול אותם על להבה פתוחה. לנתח את המוח מעכבר המתת דם על ידי פתיחת הגולגולת עם מספריים קטנים וחילוץ המוח הטרי באמצעות מטלפים עדין מבלי לפגוע בקליפת המוח. הנח את המוח ב- ACSF מקורר וחמצן והשאיר אבן אוויר מחוברת לחמצן מאוזן פחמן דו-חמצני של 5% לאורך כל תקופת הניתוח.מקם את המוח על צ'אק הרטט וגזור חלקים של קורונלי או קשת בעובי של 300 מיקרון. לאסוף מקטעים רבים ככל הנדרש כדי להשיג מינימום של 10 עד 50 תאים שכותרתו. שים פרוסות על מחזיק פרוסת רשת כותנה ממוקם בתוך מקור כך שהם ש רוחצים ACSF מחומצן.מעבירים את הפרוסות לתוך המקורה המכילה ACSF עם חוסמי פעילות וחוסמים במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר תוך מבעבע חמצן באמצעות איירסטון. מעבירים את הפרוסות לתוך המקור המכיל ACSF עם פתרון פרוטאז לבצע עיכול קל בטמפרטורת החדר. לאחר העיכול, לשטוף את הפרוטאז על ידי הזזת פרוסות בחזרה לתוך המקור המכיל ACSF עם פתרון חוסם פעילות במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר.תמשיך לבעבע חמצן. לאחר מכן, הכינו צלחת פטרי באורך 100 מ"מ המכילה ACSF עם 1%FBS בטמפרטורת החדר והזיזו חלקים בודדים לדיסק למיקרו-דיסק. תחת היקף ניתוחים פלואורסצנטיים, השתמש בזוג מדפים עדין כדי לנתח מיקרו אזורים ושכבות עניין שיש להם מינימום של 10 עד 50 תאים.באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את חתיכות מיקרו ניתוח לצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מיליליטר המכיל כ 0.8 מיליליטר של 1%FBS בת פתרון ACSF. לטהר את הרקמה המנותקת בצינור מיקרו-פיוז' בטמפרטורת החדר. בצע כ 10 משיכות עם כל פיפטים פסטר להבה החל הגדול ביותר וכלה בקוטר היציאה הקטן ביותר.מחלקים את התאים המנותקים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה ACSF מחומצן ומחכים חמש עד שבע דקות עד שהתאים יתיישבו בהדרגה. שים לב לאות GFP ו- RFP תחת מיקרוסקופ ניתוח. זהה פסולת על ידי בחינת המורפולוגיה תחת תאורת שדה בהיר.לאחר אזור של תאים עם פסולת קטנה זוהה, להשתמש נימי לצרף צינורות כדי לבחור תאים על ידי חסימת קצה שסתום צינורות עם הלשון. לאחר מכן מקם את נימי קרוב לתאים. שחרר את הבלוק על נימי במהירות לחסום שוב כדי ללכוד את התא באמצעות פעולה נימי.מעבירים את נימי לצלחת פטרי 100 מ"מ עם ACSF מחומצן טרי בעדינות מכה לתוך הצינור תוך התבוננות קצה נימי תחת אופטיקה פלואורסצנטית לחלק את התאים לתוך המנה. חזור על הליך האיסוף עד שנאספים 100 עד 150 תאים כדי לוודא שמזהמים, כגון פסולת, הם מינימליים באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות של שדה בהיר. לבסוף, באמצעות פיפטה מיקרו נימי טרי בכל פעם, לבחור תא אחד לגרש אותו לא יותר מ 0.5 microliters לתוך צינור מיקרו-fuge מיקרוליטר 0.2 המכיל microliter אחד של מאגר איסוף מדגם עם פריימרים.לשבור את קצה פיפטה בצינור מיקרו-fuge כדי להבטיח כי התא נשאר במאגר האיסוף. להקפיא את התאים על ידי לשים את הצינורות על קרח יבש. יש לאחסן במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד להגברת רנ"א.תאי עצב GABAergic היו מבודדים מקליפת המוח cingulet של המוח העכבר. רנ"א מוגבר מהנוירונים המימוינים ידנית נע בין 200 ל-4,000 זוגות בסיסים בגודל עם התפלגות שיא מעט מעל 500 זוגות בסיסים. לאחר טיהור חרוזים, ספריית cDNA מוגבלת עוד יותר על ידי סיבוב שני של טיהור באמצעות חרוזים כדי לחסל שברים פחות מ -200 זוגות בסיסים ועל הפסגה בכ 350 זוגות בסיס.רצף הראה 4.8 פעמים 10 כדי החציון החמישי או 6.9 פעמים 10 כדי 5 קריאות ממופות בממוצע לכל תא. לאחר הסרת RNA כפולה באמצעות UMIs, לכל תא בודד היו 1.0 כפול 10 עד החציון החמישי או פי 1.4 10 מהממוצע החמישי של קריאות ייחודיות לתא. בכל תא יחיד קונסורציום פקדי RNA חיצוניים, ספייק ב- RNA שימש כבקרה פנימית כדי לחשב מספר מוחלט של מולקולות שנוספו לדגימה.היה קשר ליניארי של קלט לספירות שנצפו עם שיפוע של 0.92 ומרובע R מותאם של 0.94. בממוצע של כ -10,000 גנים לכל נוירון יחיד זוהו באמצעות הליך זה עם יותר מ 95% של תאים בודדים גילוי יותר מ 6, 000 גנים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לביולוגים מולקולריים לחקור את התמלול של אינטראורונים קליפת המוח של העכבר המאופיינים היטב, וזיהתה קטגוריות גנים נבחרות האחראיות על קידוד הזהות התאית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...