Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
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यह काम NIH (5R01MH094705-04 और R01MH109665-01 से Z.J.H.), CSHL Robertson तंत्रिका विज्ञान कोष (Z.J.H.) द्वारा, और एक NARSAD पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप (एपी करने के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

शीत वसंत हार्बर लेबोरेटरी, NY (IACUC #16-13-09-8) में IACUC द्वारा पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया है ।
1. फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस की मैनुअल छंटाई
<ol><li>खींचो ग्लास microcapillaries ( सामग्री ?...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

मैनुअल छँटाई प्रोटोकॉल है कि या तो कम चूहों मस्तिष्क में लेबल कर रहे हैं या एक दुर्लभ कोशिका जनसंख्या है कि अन्यथा वर्तमान उच्च प्रवाह सेल का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है का प्रतिनिधित्व कर ...

एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) ने transcriptomic अध्ययन बदल दिया है । बड़े पैमाने पर एकल-कक्ष RNAseq, जैसे बूंदों1,2, microfluidics3, nanogrids4, और microwells5के रूप में तकनीकों की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, अधिकांश विधियाँ निर्धारित कक्ष प्रकार सॉर्ट नहीं कर सकता कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores एक्सप्रेस । किसी कक्ष का चयन करें जनसंख्या को अलग करने के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) अक्सर लेबल किए गए कक्षों को एकल-कक्ष मोड में सॉर्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, FACS कुछ प्रतिबंध है और सावधानीपूर्वक नमूना संसाधन चरणों की आवश्यकता है । सबसे पहले, इनपुट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या आम तौर पर (अक्सर कई लाख कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर) की जरूरत है, एक महत्वपूर्ण अंश के साथ (> 15 – 20%) लेबल जनसंख्या युक्त । दूसरा, सेल की तैयारी घनत्व ढाल केंद्रापसारक कदम के कई दौर glial अंश, मलबे को दूर करने की आवश्यकता हो सकती है, और सेल के झुरमुट कि अंयथा नोजल या प्रवाह सेल रोकना हो सकता है । तीसरा, FACS आम तौर पर दाग और जीवित/मृत धुंधला (जैसे, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium आयोडाइड (PI), और Cytotracker रंजक) है, जो अतिरिक्त समय लेने के लिए कदम दाग को रोजगार । चौथा, दो के लिए अंगूठे का एक नियम के रूप में रंग छँटाई (जैसे DAPI और हरे/लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP/आरएफपी)), आमतौर पर दो नमूने और एक नियंत्रण की जरूरत है, एक unlabeled नमूना वांछित माउस तनाव के अलावा संसाधित किया जा करने की आवश्यकता है । पांचवां, फ़िल्टरिंग अक्सर कई बार किया जाता है पहले और नमूना छंटाई के दौरान लगातार एक FACS मशीन में भरा नमूना लाइनों को रोकने के लिए । छठा, समय सबसे अधिक इस्तेमाल किया FACS setups में शुरू करने और द्रव धारा स्थिर और छोटी बूंद अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए आवंटित किया जाना चाहिए । सातवें, नियंत्रण के नमूने आमतौर पर अनुक्रम में वास्तविक नमूना संग्रह करने से पहले चलाने के लिए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स सेट कर रहे हैं, नक़ल अस्वीकृति, गेट्स की स्थापना, आदि उपयोगकर्ताओं को या तो कदम छह और सात खुद को समय से आगे प्रदर्शन या आवश्यकता समानांतर में एक तकनीशियन की सहायता । अंत में, पोस्ट-FACS, वहां अक्सर यह सुनिश्चित करने के लिए कदम है कि केवल लेबल एकल कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से मौजूद हैं; उदाहरण के लिए, एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सेटअप जैसे एक तेज प्लेट imager में नमूनों की जाँच करके ।
ऊपर उल्लिखित चरणों को दरकिनार और एकल फ्लोरोसेंट लेबल ंयूरॉंस की एक छोटी सी आबादी के एक अपेक्षाकृत त्वरित, लक्षित अनुक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम एक मैनुअल छंटाई प्रक्रिया का वर्णन एक अति संवेदनशील के दो दौर के बाद इन विट्रो में प्रवर्धन प्रोटोकॉल, बुलाया डबल में-इन विट्रो प्रतिलेखन निरपेक्ष गिनती अनुक्रमण (दिवा-Seq) के साथ । आरएनए प्रवर्धन और सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी Eberwine एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । 6 और Hashimshony एट अल. 7, कुछ संशोधनों के साथ माउस ंयूरॉंस कि छोटे सेलुलर संस्करणों के अनुरूप है; इसके अलावा, हम यह भी पाया है कि यह उत्तेजक पिरामिड ंयूरॉंस के लिए समान रूप से उपयोगी है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) अब जीन अभिव्यक्ति परख के लिए एक व्यापक रूप से कार्यान्वित उपकरण है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकल-कक्ष आरएनए-अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म सभी इनपुट कक्षों की अंधाधुंध प्रक्रिया करते हैं. कई बार, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग ऊपर की रुचि के विशेष लेबल वाली जनसंख्या को अलग करने के लिए किया जाता है । FACS की एक सीमा काफी लेबल भागों, जो इकट्ठा करने और दुर्लभ या विरल माउस मस्तिष्क से ंयूरॉन आबादी लेबल की रूपरेखा के लिए अव्यावहारिक है के साथ इनपुट कोशिकाओं की उच्च संख्या के लिए की जरूरत है । यहां, हम स्वयं का संग्रह के लिए एक विधि का वर्णन विरल फ्लोरोसेंट एक हौसले से असंबद्ध माउस मस्तिष्क ऊतक से ंयूरॉंस लेबल । यह प्रक्रिया एकल पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, उच्च शुद्धता और बाद में एक साथ एकीकरण के साथ न्यूरॉन्स लेबल के साथ एक में इन विट्रो परिवर्धन प्रोटोकॉल है कि अंतर्जात प्रतिलिपि अनुपात को बरकरार रखता है. हम एक दोहरे रेखीय प्रवर्धन पद्धति का वर्णन करते है जो व्यक्तिगत mRNA गणना उत्पंन करने के लिए अनंय अणु पहचानकर्ता (UMIs) का उपयोग करती है । एक कोशिका प्रति जीन का पता लगाने के एक उच्च डिग्री में प्रवर्धन परिणामों के दो दौर ।

प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, GABAergic न्यूरॉन्स मैन्युअल रूप से क्रमबद्ध थे (1 चित्रा) और आरएनए परिलक्षित किया गया था, तो एक सीडीएनए पुस्तकालय में बनाया (चित्रा 2) और उच?...

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के साथ फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस मैनुअल छंटाई और डबल इन विट्रो प्रतिलेखन के साथ निरपेक्ष गणना अनुक्रमण (DIVA-Seq)

इस प्रोटोकॉल का वर्णन मैनुअल छंटाई प्रक्रिया को अलग करने के लिए एकल फ्लोरोसेंट लेबल इन विट्रो प्रतिलेखन के बाद ंयूरॉंस उच्च गहराई एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए आधारित mRNA प्रवर्धन ।

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

यह विधि एकल-न्यूरॉन अलगाव और अनुक्रमण के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण बाधा को हल करने में मदद कर सकती है। जैसे विशिष्ट जनसंख्या एकत्र करना या उपयोगकर्ता-परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र से फ्लोरोसेंटली लेबल न्यूरॉन की उप-आबादी। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह सुनिश्चित करता है कि मलबे को दूषित किए बिना ब्याज के एकल न्यूरॉन को पकड़ लिया जाता है।यह अपेक्षाकृत कोमल भी है, जो नाजुक न्यूरॉन प्रकारों के लिए महत्वपूर्ण है जो पारंपरिक एफएस छंटाई के तरल पदार्थ के दबाव के अधीन होने पर जल्दी मर जाते हैं। एक केशिका खींचने का उपयोग कर 10 से 15 माइक्रोन निकास व्यास के साथ खींचा ग्लास माइक्रोकैपिलरी तैयार करके शुरू करें। वांछित बोर्ड व्यास प्राप्त करने के लिए केशिका की नोक को काटने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करें।फिर ट्यूबिंग कनेक्टर का उपयोग करने के लिए एक ०.२ माइक्रोन पीवीडीएफ झिल्ली सिरिंज फिल्टर और एक दो तरह ट्यूबिंग वाल्व के लिए व्यास के अंदर ०.८ मिलीमीटर के साथ लचीला सिलिकॉन ट्यूबिंग की एक १२० से १५० सेंटीमीटर लंबाई संलग्न करने के लिए । 15 मिनट के लिए एक एयरस्टोन के माध्यम से 5% कार्बन डाइऑक्साइड संतुलित ऑक्सीजन बुदबुदाते द्वारा ठंडा कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ या ACSF और ऑक्सीजन के 500 मिलीलीटर तैयार करें या जब तक समाधान पूरी तरह से साफ नहीं हो जाता है। 150 मिलीलीटर बीकर्स तैयार करें जिनमें से प्रत्येक में 100 मिलीलीटर ACSF हैं।एक के लिए, गतिविधि ब्लॉकर्स का कॉकटेल जोड़ें। दूसरे में, प्रति मिलीलीटर एक मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीज़ के लिए स्ट्रेप्टोकोकस अंश जोड़ें। अंतिम बीकर के लिए, एक एयरस्टोन के माध्यम से 5% कार्बन डाइऑक्साइड संतुलित ऑक्सीजन के साथ 1% की अंतिम एकाग्रता और ऑक्सीजन के लिए FBS जोड़ें ।अंत में, एक खुली लौ पर उन्हें रोलिंग द्वारा बाहर निकलें व्यास कम करने के साथ तीन लंबे समय से उपजी पाश्चान्ख पिपेट बनाएं। एक छोटे कैंची के साथ कपाल खोलने और प्रांतस्था को नुकसान पहुंचाए बिना ठीक संदंश का उपयोग कर ताजा मस्तिष्क निकालने के द्वारा एक इच्छामृत्यु माउस से मस्तिष्क विच्छेदन । मस्तिष्क को ठंडा और ऑक्सीजनयुक्त ACSF में रखें जो खंड की पूरी अवधि के दौरान 5% कार्बन डाइऑक्साइड-संतुलित ऑक्सीजन से जुड़े एयरस्टोन को छोड़ देता है।वाइब्रेटम चक पर मस्तिष्क की स्थिति और 300 माइक्रोन मोटाई पर कोरोनल या sagittal वर्गों में कटौती। कम से कम 10 से 50 लेबल वाली कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यकतानुसार कई अनुभागों को एकत्र करें। एक बीकर के अंदर रखा एक कपास-meshed टुकड़ा धारक पर स्लाइस रखो ताकि वे ऑक्सीजनयुक्त ACSF में नहाया रहे हैं ।स्लाइस को गतिविधि ब्लॉकर्स के साथ ACSF युक्त बीकर में ले जाएं और एयरस्टोन का उपयोग करके ऑक्सीजन को चुबुदान करते हुए कमरे के तापमान पर 15 से 20 मिनट के लिए ब्लॉक करें। कमरे के तापमान पर हल्के पाचन करने के लिए प्रोटीज समाधान के साथ एसीएसएफ युक्त बीकर के लिए स्लाइस ले जाएँ। पाचन के बाद, कमरे के तापमान पर पांच से 10 मिनट के लिए गतिविधि अवरोधक समाधान के साथ ACSF युक्त बीकर के लिए स्लाइस वापस ले जाकर प्रोटीज़ बाहर धो ।बुदबुदाती ऑक्सीजन रखें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर 1% एफबीएस के साथ ACSF युक्त एक 100 मिलीमीटर पेट्री डिश तैयार करें और माइक्रोडिसेक्शन के लिए डिस्क में व्यक्तिगत वर्गों को स्थानांतरित करें। फ्लोरोसेंट विच्छेदन दायरे के तहत, सूक्ष्म विच्छेदन क्षेत्रों और ब्याज की परतों में एक जोड़ी ठीक संदंश का उपयोग करें जिसमें न्यूनतम 10 से 50 कोशिकाएं होती हैं।एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, सूक्ष्म-विच्छेदित टुकड़ों को 2-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर ले जाएं जिसमें एसीएसएफ समाधान में 1% एफबीएस के लगभग 0.8 मिलीलीटर होते हैं। कमरे के तापमान पर माइक्रो-फ्यूज ट्यूब में विच्छेदित ऊतक को टिट्रेट करें। सबसे बड़ी और सबसे छोटी निकास व्यास के साथ समाप्त होने वाले प्रत्येक फ्लेम्ड पाश्चुर पिपेट के साथ लगभग 10 स्ट्रोक करें।एक १०० मिलीमीटर पेट्री एक ऑक्सीजनयुक्त ACSF युक्त पकवान में अलग कोशिकाओं बांटना और कोशिकाओं को धीरे से व्यवस्थित करने के लिए पांच से सात मिनट इंतजार । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जीएफपी और आरएफपी सिग्नल का निरीक्षण करें। उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत आकृति विज्ञान की जांच करके मलबे की पहचान करें।एक बार छोटे मलबे के साथ कोशिकाओं के एक क्षेत्र की पहचान की गई है, केशिका का उपयोग करें और जीभ के साथ ट्यूबिंग वाल्व के अंत को अवरुद्ध करके कोशिकाओं को लेने के लिए टयूबिंग को देते हैं । फिर कोशिकाओं के करीब केशिका की स्थिति। केशिका पर ब्लॉक जारी करें और केशिका कार्रवाई का उपयोग करके सेल को पकड़ने के लिए जल्दी से फिर से ब्लॉक करें।ताजा ऑक्सीजनयुक्त ACSF के साथ एक १०० मिलीमीटर पेट्री डिश के लिए केशिका ले जाएँ और धीरे ट्यूब में उड़ा, जबकि फ्लोरेसेंस प्रकाशिकी के तहत केशिका टिप देख पकवान में कोशिकाओं बांटना । संग्रह प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि 100 से 150 कोशिकाओं को यह सुनिश्चित न किया जाए कि संदूषक, जैसे मलबे, उज्ज्वल क्षेत्र अंतर हस्तक्षेप विपरीत प्रकाशिकी में न्यूनतम हैं। अंत में, हर बार एक ताजा माइक्रो-केशिका पिपेट का उपयोग करके, एक सेल चुनें और इसे 0.2 माइक्रोलीटर माइक्रो-फ्यूज ट्यूब में 0.5 माइक्रोलीटर से अधिक नहीं निष्कासित करें जिसमें प्राइमर्स के साथ नमूना-संग्रह बफर का एक माइक्रोलीटर होता है।माइक्रो-फ्यूज ट्यूब में पिपेट टिप को तोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सेल संग्रह बफर में रहता है। सूखी बर्फ पर ट्यूब डालकर कोशिकाओं को फ्रीज कर दें। आरएनए प्रवर्धन के लिए प्रसंस्करण तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।गैबार्गिक न्यूरॉन्स माउस मस्तिष्क के सिंगुलेट कॉर्टेक्स से अलग थे। मैन्युअल रूप से हल किए गए न्यूरॉन्स से परिलक्षित आरएनए आकार में 200 से 4, 000 बेस जोड़े के बीच 500 बेस जोड़े से थोड़ा ऊपर एक चोटी वितरण के साथ होता है। मनका शुद्धिकरण के बाद, सीडीएनए पुस्तकालय को 200 बेस जोड़े से कम टुकड़ों को खत्म करने और लगभग 350 आधार जोड़े पर चोटी के लिए मोतियों का उपयोग करके शुद्धि के दूसरे दौर द्वारा प्रतिबंधित आकार दिया गया है।अनुक्रमण एक 4.8 बार 10 5 वीं औसत या 6.9 बार 10 से 5 औसत मैप प्रति सेल पढ़ता है दिखाया. UMIs का उपयोग कर डुप्लिकेट आरएनए हटाने के बाद, प्रत्येक एकल सेल में 5 वीं औसत के लिए 10 गुना या 5 वीं औसत अद्वितीय के लिए 10 गुना प्रति सेल पढ़ता था। प्रत्येक एकल सेल बाहरी आरएनए नियंत्रण कंसोर्टियम में, आरएनए में स्पाइक का उपयोग नमूने में जोड़े गए अणुओं की पूर्ण संख्या की गणना करने के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जाता था।0.92 की ढलान और 0.94 के समायोजित आर वर्ग के साथ गणना की गिनती के लिए इनपुट का एक रैखिक संबंध था। 6, 000 से अधिक जीन का पता लगाने वाली एकल कोशिकाओं के 95% से अधिक के साथ इस प्रक्रिया का उपयोग करके प्रति एकल न्यूरॉन के लगभग 10, 000 जीन का औसत पाया गया। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने आणविक जीवविज्ञानियों के लिए अलग-अलग अच्छी तरह से विशेषता वाले माउस कॉर्टिकल इंटरन्यूरॉन्स के ट्रांसक्रिप्टोम का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया, और चुनिंदा जीन श्रेणियों की पहचान की जो सेलुलर पहचान को एन्कोडिंग के लिए जिम्मेदार हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

कुल शाही सेना अलगाव और डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइलिंग के लिए कैद गैर अलहदा माउस ब्रेन क्षेत्र के Microdissection के लिए लेजर माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Nigral न्यूरॉन्स में एकल सेल RT-पीसीआर तकनीक का उपयोग वोल्ट gated पोटेशियम चैनल mRNA अभिव्यक्ति रूपरेखा

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

विकासशील और परिपक्व रेटिना न्यूरॉन्स की रूपरेखा एकल कक्ष

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Midbrain संस्कृतियों में रहने वाले डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के विश्वसनीय पहचान आरएनए अनुक्रमण और वें प्रमोटर संचालित EGFP अभिव्यक्ति का उपयोग

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

रीटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के परिभाषित सैकट्स के सिंगल-सेल आरएनए-सैक

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

एक Vivo में रक्त-चूहों में मस्तिष्क बाधा पारगम्यता परख फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखकों का उपयोग

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

कम सेल क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा तीव्र शुद्ध PDGFRα + कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारक Olig2 जीनोमिक बंधन साइटों की पहचान

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

एकल सेल मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के बाद पैच-दबाना

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

डीप सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए एक वयस्क माउस ब्रेन गोलार्द्ध से क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोग्लिया का अलगाव

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...