Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5R01MH094705-04 e R01MH109665-01 al Z.J.H.), dal fondo di neuroscienze CSHL Robertson (a Z.J.H.) e da un NARSAD induttrici nell'Unione fraterna (A.P.).

Tutte le procedure compreso gli oggetti degli animali sono state approvate da IACUC al Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manuale l'ordinamento dei neuroni di topo fluorescente contrassegnati
<ol><li>Tirare il vetro microcapillari (Vedi Tabella materiali) per 10 – 15 µm di diametro uscita mediante un apposito estrattore del capillare con le seguenti impostazioni: calore: 508, pull: vuoto, vel: ora vuoto,: vuoto.</li>
	<li>Collegare il tubo di 120 ?...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Il manuale di protocollo di ordinamento è adatto per un supervisione sequenziamento di RNA del neurone popolazioni che sono sia scarsamente etichettati nel cervello di topi o rappresentano una popolazione di cellule rari che altrimenti non è fattibile per studiare mediante cella di alto-rendimento corrente metodi di ordinamento e di amplificazione. Cellule sottoposte a FACS solitamente subiscono pressioni di linea guaina e campione nella gamma di psi ~ 9 – 14, a seconda delle dimensioni dell'ugello e desiderato tassi...

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) ha trasformato la trascrittomica studi. Mentre su larga scala singola cellula RNAseq può essere eseguita utilizzando una varietà di tecniche, come le goccioline1,2, microfluidica3, nanogrids4e micropozzetti5, maggior parte dei metodi non possono ordinare tipi di cella definita che esprimono codificato geneticamente fluorofori. Per isolare una popolazione di selezionare la cella, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono spesso usata con etichettate celle in una cella singola modalità di ordinamento. Tuttavia, FACS presenta alcune restrizioni e richiede fasi di lavorazione meticolosa del campione. In primo luogo, un gran numero di celle di input è in genere necessari (spesso parecchie milioni cellule / mL), con una frazione significativa (> 15 – 20%) contenente la popolazione con etichetta. In secondo luogo, preparazioni di cellule possono richiedere vari cicli di passaggi di centrifugazione su gradiente di densità rimuovere frazione glial, detriti e mucchi di cella che potrebbero altrimenti intasare l'ugello o flusso delle cellule. In terzo luogo, FACS impiega solitamente di colorazione e decolorazione passaggi per live/dead colorazione (ad esempio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ioduro di propidio (PI) e coloranti Cytotracker), che prendere ulteriore tempo. In quarto luogo, come una regola empirica per ordinamento (ad esempio DAPI e proteina fluorescente verde/rosso (GFP/RFP)), di solito due campioni di due colori e un controllo sono necessari, che richiedono un campione senza etichetta per essere elaborati oltre il ceppo del mouse desiderato. In quinto luogo, filtro viene spesso eseguito più volte prima e durante l'ordinamento di campione per prevenire in maniera proattiva le righe di esempio intasato in una macchina di FACS. Sesto, il tempo deve essere assegnato in configurazioni di FACS più comunemente utilizzati per inizializzare e stabilizzare il flusso fluido e realizzare la calibratura della gocciolina. Settimo, controllo campioni vengono in genere eseguiti in sequenza prima della raccolta del campione reale per impostare la pagina di matrici di compensazione, rifiuto del doppietto, impostazione gates, utenti ecc o procedere sei e sette stessi prima del tempo o richiedono la assistenza di un tecnico in parallelo. Infine, post-FACS, spesso ci sono misure per garantire che solo etichettati singole cellule sono presenti in ciascun pozzetto; ad esempio, controllando i campioni in un setup di screening ad alto contenuto ad esempio un imager piatto veloce.
Per aggirare la procedura descritta sopra e facilitare un relativamente rapido, mirato sequenziamento di una piccola popolazione di singoli neuroni fluorescente contrassegnati, descriviamo un manuale di procedura seguita da due turni di un altamente sensibile in vitro di ordinamento protocollo di amplificazione, chiamato doppio in vitro trascrizione con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq). La generazione della libreria di amplificazione e cDNA di RNA è adattata da Eberwine et al. 6 e Hashimshony et al. 7, con alcune modifiche per soddisfare interneuroni del mouse che hanno più piccoli volumi cellulare; ancora, abbiamo anche trovato che è altrettanto utile per eccitanti neuroni piramidali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) è ormai uno strumento ampiamente implementato per diluire l'espressione genica. Piattaforme di RNA-sequenziamento unicellulare commercialmente disponibili elaborano tutti gli input cellule indiscriminatamente. A volte, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono usata a Monte per isolare una popolazione specificamente con etichetta di interesse. Una limitazione di FACS è la necessità di un numero elevato di celle di input con frazioni significativamente con etichetta, che è pratico per la raccolta e profilatura popolazioni rare o scarsamente etichettati neurone dal cervello del topo. Qui, descriviamo un metodo per raccogliere manualmente sparse fluorescente etichettati singoli neuroni da appena dissociato del tessuto di cervello di topo. Questo processo consente per l'acquisizione di neuroni con etichetta singola con elevata purezza e successiva integrazione con protocollo in vitro basati su trascrizione amplificazione che mantiene rapporti di trascrizione endogena. Descriviamo un metodo di amplificazione lineare doppia che utilizza identificatori univoci molecola (UNMIS) per generare singoli mRNA conteggi. Due turni di risultati di amplificazione in un elevato grado di rilevazione del gene al singola cella.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, GABAergici neuroni erano manualmente ordinati (Figura 1) e RNA è stato amplificato, poi trasformato in una libreria di cDNA (Figura 2) ed ordinato a elevata profondità8. I prodotti amplificati di RNA (aRNA) ha variato fra 200 – 4.000 bp in dimensioni, con una distribuzione di picco leggermente di sopra di 500 bp (Figura 3A...

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Questo protocollo descrive il manuale procedura per isolare singoli neuroni fluorescente contrassegnati seguiti in vitro basati su trascrizione di mRNA amplificazione per la sequenza di RNA di alta profondità unicellulare di ordinamento.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Questo metodo può aiutare a risolvere un ostacolo chiave nel campo dell'isolamento e del sequenziamento dei singoli neuroni. Come la raccolta di una popolazione specifica o una sottopopolazione di neuroni etichettati fluorescentmente dall'area cerebrale definita dall'utente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che assicura che il singolo neurone di interesse sia catturato senza contaminare i detriti.È anche relativamente delicato, il che è importante per i tipi di neuroni fragili che muoiono rapidamente quando sottoposti alle pressioni fluide dello smistamento FACS convenzionale. Iniziare preparando microcapillari di vetro tirato con un diametro di uscita da 10 a 15 micron utilizzando un estrattore capillare. Utilizzare forbici fini per tagliare la punta del capillare per ottenere il diametro della scheda desiderato.Quindi utilizzare i connettori di tubo per collegare una lunghezza da 120 a 150 centimetri di tubi flessibili in silicone con un diametro interno di 0,8 millimetri a un filtro siringa a membrana PVDF da 0,2 micron e una valvola di tubi a due vie. Preparare 500 millilitri di liquido spinale cerebrale artificiale refrigerato o ACSF e ossigenare gorgogliando ossigeno bilanciato al 5% di anidride carbonica attraverso un Airstone per 15 minuti o fino a quando la soluzione non si sgombrato completamente. Preparare tre becher da 150 millilitri ciascuno contenente 100 millilitri di ACSF.A uno, aggiungi un cocktail di blocchi di attività. A un altro, aggiungere la frazione di Streptococcus per la proteasi a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Al becher finale, aggiungere FBS a una concentrazione finale dell'1% e ossigenare con ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% attraverso un Airstone.Infine, realizzare tre pipette Pasteur a gambo lungo con diametri di uscita decrescenti rotolandoli su una fiamma aperta. Sezionare il cervello da un topo eutanasiato aprendo il cranio con una piccola forbice ed estraendo il cervello fresco usando forcep fini senza danneggiare la corteccia. Posizionare il cervello in ACSF refrigerato e ossigenato lasciando un Airstone attaccato all'ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% per l'intera durata del sezionamento.Posizionare il cervello sul mandrino del vibratomo e tagliare le sezioni coronali o sagittali a 300 micron di spessore. Raccogli tutte le sezioni necessarie per ottenere un minimo di 10-50 celle etichettate. Mettere le fette su un porta fette con rete di cotone posto all'interno di un becher in modo che siano bagnate in ACSF ossigenato.Spostare le fette nel becher contenente ACSF con bloccanti di attività e bloccare per 15-20 minuti a temperatura ambiente mentre si gorgoglia ossigeno utilizzando un Airstone. Spostare le fette sul becher contenente ACSF con la soluzione di proteasi per eseguire una digestione lieve a temperatura ambiente. Dopo la digestione, lavare la proteasi spostando le fette al becher contenente ACSF con soluzione di blocco dell'attività per cinque-10 minuti a temperatura ambiente.Continua a gorgogliare ossigeno. Preparare quindi una piastra di Petri da 100 millimetri contenente ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente e spostare singole sezioni nel disco per la microdisezione. Sotto un mirino di dissezioni fluorescenti, utilizzare una coppia di forcep fini per micro sezionare aree e strati di interesse con un minimo di 10-50 cellule.Utilizzando una pipetta Pasteur, spostare i pezzi microsezionati su un tubo di microcentrifugo da 2 millilitri contenente circa 0,8 millilitri di 1%FBS in soluzione ACSF. Titolare il tessuto sezionato nel tubo di microfuoco a temperatura ambiente. Eseguire circa 10 tratti con ciascuna delle pipette Pasteur fiammate a partire dal più grande e terminando con il più piccolo diametro di uscita.Erogare le cellule dissociate in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente ACSF ossigenato e attendere da cinque a sette minuti affinché le cellule si sistemino gradualmente. Osservare il segnale GFP e RFP al microscopio a dissezione. Identificare i detriti esaminando la morfologia sotto illuminazione a campo luminoso.Una volta identificata un'area di cellule con pochi detriti, utilizzare il capillare e attaccarlo ai tubi per raccogliere le celle bloccando l'estremità della valvola di tubo con la lingua. Quindi posizionare il capillare vicino alle cellule. Rilasciare il blocco sul capillare e bloccarlo rapidamente di nuovo per catturare la cellula utilizzando l'azione capillare.Spostare il capillare su una piastra di Petri di 100 millimetri con ACSF fresco ossigenato e soffiare delicatamente nel tubo osservando la punta capillare sotto l'ottica a fluorescenza per erogare le cellule nel piatto. Ripetere la procedura di raccolta fino a quando non vengono raccolte da 100 a 150 celle assicurandosi che i contaminanti, come i detriti, siano minimi nelle ottiche a contrasto di interferenza differenziale a campo luminoso. Infine, utilizzando ogni volta una pipetta micro-capillare fresca, scegliere una singola cella ed espellerla in non più di 0,5 microlitri in un tubo di micro-fusione da 0,2 microlitri contenente un microlitro di tampone di raccolta campioni con primer.Rompere la punta della pipetta nel tubo di micro-fusione per assicurarsi che la cella rimanga nel buffer di raccolta. Congelare le cellule mettendo i tubi sul ghiaccio secco. Conservare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'elaborazione per l'amplificazione dell'RNA.I neuroni GABAergici sono stati isolati dalla corteccia cingulet del cervello del topo. L'RNA amplificato dai neuroni ordinati manualmente variava tra 200 e 4.000 coppie di basi di dimensioni con una distribuzione di picco leggermente superiore a 500 coppie di basi. Dopo la purificazione delle perline, la libreria cDNA è ulteriormente limitata da un secondo ciclo di purificazione usando perline per eliminare frammenti inferiori a 200 coppie di basi e per il picco a circa 350 coppie di basi.Il sequenziamento ha mostrato un 4,8 per 10 alla 5a mediana o 6,9 per 10 alla 5a lettura mappata media per cella. Dopo la rimozione dell'RNA duplicata usando gli UMI, ogni singola cella aveva una 1,0 per 10 alla 5a mediana o 1,4 volte 10 alla 5a lettura unica media per cella. In ogni consorzio di controlli dell'RNA esterno a singola cellula, il picco di RNA è stato usato come controllo interno per calcolare il numero assoluto di molecole aggiunte al campione.C'era una relazione lineare tra input e conteggi osservati con una pendenza di 0,92 e un quadrato R regolato di 0,94. Una media di circa 10.000 geni per singolo neurone sono stati rilevati utilizzando questa procedura con oltre il 95% delle singole cellule che rilevano più di 6.000 geni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai biologi molecolari per esplorare il trascritoma di distinti internauri corticali del topo ben caratterizzati e ha identificato alcune categorie geniche che sono responsabili della codifica dell'identità cellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

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Ricerca

Neuroscienze

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The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identificare i siti di fattore di trascrizione Olig2 associazione genomico in acutamente purificato PDGFRα + cellule di immunoprecipitazione della cromatina Low-cella ordinamento dell'analisi

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...