Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

この作品は、(5R01MH094705-04 と R01MH109665-01 Z.J.H.) NIH からの補助金、(Z.J.H.) に CSHL ロバートソン神経科学基金、(兼) に NARSAD ドクトラル ・ フェローシップにサポートされていました。

動物科目を含むすべてのプロシージャは、冷たいばね港研究所ニューヨーク (IACUC #16-13-09-8) で IACUC によって承認されています。
1. 手動による並べ替えの蛍光に分類されたマウス神経細胞
<ol><li>キャピラリーの引き手を使用して次の設定で 10-15 μ m 出口径ガラス microcapillaries (材料の表を参照) を引く: 熱: 508、プル: 空白、ヴェル: 空白時間: 空白。</li>
	<li>120...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

プロトコルをソート マニュアルに適してまばら、人口マウス脳のラベルまたは現在のスループットの高いセルを用いた検討することですそれ以外の場合稀な細胞集団を代表しているニューロンのチャイルド RNA の塩基配列を解読並べ替えと増幅方法。通常 FACS を受ける細胞は ~ 9-14 psi、ノズルのサイズに応じての範囲で鞘とサンプルのライン圧力を受けるし、イベント レートを必要に応じて?...

単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) は、トランスクリプトーム研究を変えてきました。ほとんどのメソッドは、定義済みのセルの種類を並べ替えることはできませんさまざまな液滴1、2マイクロ3nanogrids4マイクロウェル5などの技術を使用して大規模な単一セル RNAseq を実行できます。遺伝的コード化の同時を発現します。選択セル人口を隔離するには、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは単一セル モードでラベル付きセルを並べ替えるによく使用されます。ただし、FACS はいくつかの制限をあり、細心のサンプル処理手順が必要です。まず、入力セルの数が多いは通常、かなりの割合で (しばしば数百万セル mL あたり) を必要な (> 15-20%) ラベル付きの人口を含みます。第二に、細胞はグリア細胞分画、破片、およびノズルやフロー セルを詰まらせる可能性がありますそれ以外の場合細胞塊を削除する密度勾配遠心法手順を複数回を必要があります。第三に、FACS は通常染色と染め色ライブ/デッド (4 ′など6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、ヨウ化 propidium (PI)、Cytotracker 染料) を染色、追加の時間をとるための手順を採用します。第四に、2 色 (DAPI、赤/緑の蛍光蛋白質 (GFP/RFP) など)、並べ替えの通常 2 つのサンプルの 1 つの親指のルールは、必要に応じて必要なマウスの緊張だけでなく処理されるラベルのないサンプルを必要とします。第五に、フィルタ リングが実行されるは、複数回する前に、サンプルは、FACS マシンで詰まったサンプル線を予防するために並べ替え中に頻繁です。第六に、初期化し流体流を安定させるし、液滴の調整を実行する最も一般的に使用される FACS 設定で時間を割り当てる必要があります。サンプルは通常、実際のサンプル コレクション、早めに 6 と 7 の彼らの自身の手順を実行いずれかゲートなどのユーザーの設定や必要補償行列、ダブレット除去をセットアップする前にシーケンスで実行、コントロール、並列で技術者の支援します。最後に、ポスト FACS、しばしば単一ラベルだけ細胞が各井戸に存在することを確認する手順がありますたとえばで高速プレート撮像素子など高コンテンツ スクリーニング セットアップのサンプルをチェックします。
上記の手順を回避して比較的短時間で容易に単一の蛍光に分類されたニューロンの小さい人口のシーケンスを対象に述べる選別高感度体外の 2 ラウンドに続いて手順マニュアル絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) とダブルの生体外のトランスクリプションと呼ばれる増幅プロトコル。RNA 増幅と cDNA ライブラリを生成、Eberwineらから適応6 Hashimshonyら7、携帯電話より小さいボリュームを持つマウスの介在ニューロンに合わせて特定の変更さらに、興奮性錐体細胞に均等に有用であるまた発見しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

単一細胞 RNA シーケンス (seq RNA) 遺伝子発現を試金するため広く実装されているツールは、現在。市販の単一細胞 RNA シーケンス プラットフォームは無差別にすべての入力セルを処理します。時々、関心の特にラベル付きの人口を隔離する蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え、上流に使用されます。FACS の制限は、収集およびマウス脳から希少またはまばらにラベル付けされた神経細胞集団をプロファイリングする非現実的です大幅ラベル付きの分数の入力セルの高数値の必要性です。ここでは、マウスの脳組織を分離した手動で収集スパースにたてから単一ニューロンを蛍光標識の手法について述べる。このプロセスにより、高純度と内生コピー比率を保持するの in vitro転写に基づく増幅プロトコルで統合単一標識細胞を取り込むため。ユニークな分子識別子 (Umi) を使用して個々 の mRNA の数を生成する二重線形増幅法について述べる。単一細胞あたりの遺伝子検出の高度の増幅結果の 2 つのラウンド。

上記プロトコルを使用して、gaba 作動性ニューロンが手動で並べ替えられます (図 1)、RNA 増幅し、cDNA ライブラリ (図 2) に、高深さ8シーケンスします。増幅された RNA (aRNA) 製品のレンジに 500 を少し超えるピーク分布のサイズで 200-4,000 bp 間 bp (図 3 a)。ビーズ精製 cDNA ライブラリはさ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

このプロトコルでは、高深度単一細胞 RNA 配列のため mRNA 転写に基づく増幅体外に続いて単一の蛍光に分類されたニューロンを分離するプロシージャを並べ替えマニュアルについて説明します。

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

この方法は、単一ニューロンの分離とシーケンシングの分野における重要な障害を解決するのに役立ちます。ユーザー定義の脳領域から特定の集団または蛍光標識ニューロンの亜集団を収集することなど。この技術の主な利点は、それが目的の単一のニューロンが破片を汚染することなく捕捉されることを保証することです。また、比較的穏やかで、従来のFACS選別の流体圧力を受けるとすぐに死ぬ脆弱なニューロンタイプにとって重要です。キャピラリープーラーを使用して、10〜15ミクロンの出口径で引っ張られたガラスマイクロキャピラリを準備することによって開始します。目的の板の直径を得るために毛細血管の先端を切断するために細かいはさみを使用してください。次に、チューブコネクタを使用して、0.8ミリメートルの内径0.8ミリメートルの柔軟なシリコーンチューブの長さ120~150センチメートルを0.2ミクロンのPVDF膜シリンジフィルターと双方向チューブバルブに取り付けます。エアストーンを通して5%の二酸化炭素バランス酸素を泡立て、または溶液が完全にクリアされるまで500ミリリットルの冷蔵人工脳脊髄液またはACSFと酸素化物を調製します。ACSFの100ミリリットルを含む3つの150ミリリットルビーカーをそれぞれ準備します。1つに、アクティビティブロッカーのカクテルを追加します。もう一つには、プロテアーゼのストレプトコッカス分率を1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度に加える。最終的なビーカーに、FBSを1%の最終濃度に加え、エアストーンを通して5%の二酸化炭素バランス酸素を含む酸素化物を加えます。最後に、オープンフレームの上に転がすことによって出口径を減少させる3つの長い茎のパスツールピペットを作ります。小さなはさみで頭蓋骨を開き、皮質を損傷することなく細かい鉗子を使用して新鮮な脳を抽出することによって、安楽死させたマウスから脳を解剖する。切断の全期間の間に5%の二酸化炭素バランス酸素に取り付けられたエアストーンを残して冷蔵および酸素化されたACSFに脳を置く。ビブラートメチャックに脳を置き、300ミクロンの厚さのコロナまたは矢状切片を切断します。必要な数のセクションを収集して、最低 10 ~ 50 個のラベル付きセルを取得します。ビーカーの中に置かれた綿メッシュのスライスホルダーにスライスを置き、酸素化されたACSFを浴びるようにします。アクティビティブロッカーを備えたACSFを含むビーカーにスライスを移動し、エアストーンを使用して酸素をバブリングしながら室温で15〜20分間ブロックします。プロテアーゼ溶液を用いてACSFを含むビーカーにスライスを移動し、室温で軽度の消化を行います。消化後、活性ブロッカー溶液を含むビーカーにスライスを室温で5~10分間移動してプロテアーゼを洗い流します。酸素をバブリングし続けます。次に、室温で1%FBSのACSFを含む100ミリメートルのペトリ皿を準備し、マイクロディセクションのために個々のセクションをディスクに移動します。蛍光解剖スコープでは、1対50の細胞を有する対象領域および層を微細解剖するために、一対の細い鉗子を使用します。パスツールピペットを使用して、マイクロ解剖した部分をACSF溶液中の約0.8ミリリットルの1%FBSを含む2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。マイクロフュージチューブ内の解剖組織を室温で硝子化する。最大で始まり、最小の出口直径で終わる炎上したパスツールピペットのそれぞれで約10ストロークを実行します。解約した細胞を酸素化したACSFを含む100ミリメートルのペトリ皿に分配し、細胞が徐々に沈着するまで5〜7分待ちます。GFPとRFP信号を解剖顕微鏡で観察します。明視野照明の下で形態を調べることによって破片を識別する。小さな破片を含む細胞の領域が特定されたら、毛細血管を使用し、チューブに取り付けて、チューブバルブの端部を舌でブロックして細胞を選びます。次に、毛細血管を細胞の近くに置きます。毛細血管のブロックを解放し、すぐにキャピラリーアクションを使用して細胞をキャプチャするために再びブロックします。新鮮な酸素化されたACSFで100ミリメートルのペトリ皿に毛細管を移動し、蛍光光学の下で毛細血管先端を観察しながらチューブに穏やかに吹き込み、細胞を皿に分配します。100~150個の細胞が収集されるまで収集手順を繰り返し、デブリなどの汚染物質が明視野差干渉コントラスト光学で最小限に抑えられるようにします。最後に、新鮮なマイクロキャピラリーピペットを毎回使用して、単一のセルを選択し、プライマー付きサンプルコレクションバッファーの1マイクロリットルを含む0.2マイクロフュージチューブに0.5マイクロリットル以下で排出します。マイクロフュージチューブのピペットチップを破って、セルがコレクションバッファに残っていることを確認します。ドライアイスにチューブを置くことによって細胞を凍結します。RNA増幅のための処理までマイナス80°Cの冷凍庫で保管してください。GABAERG性ニューロンは、マウス脳の帯状皮質から単離された。手動で選別されたニューロンから増幅されたRNAは、500塩基対をわずかに上回るピーク分布を有する200〜4,000塩基対の間の範囲となった。ビード精製後、cDNAライブラリは、ビーズを使用して2回目の精製によりさらにサイズが制限され、200塩基対未満の断片を排除し、約350塩基対でピークを迎えます。シーケンスは、5番目の中央値に10倍、または6.9倍の10倍の10倍の平均マッピングされた読み取り1細胞当たりの読み取りを示した。UMIを使用してRNAを重複除去した後、各単一の細胞は5番目の中央値に1.0倍、または1.4倍の10〜1細胞当たりの平均ユニーク読み取り1.4回を持っていました。各単一細胞外部RNA制御コンソーシアムにおいて、RNAのスパイクを内部制御として使用し、サンプルに添加された分子の絶対数を計算した。0.92の傾きと0.94の調整されたR二乗で観測されたカウントに対する入力の線形関係があった。この手順を使用して、1つのニューロンあたり平均約10,000個の遺伝子が検出され、6,000以上の遺伝子を検出する単一細胞の95%以上が検出されました。その開発後、この技術は、分子生物学者が明確に特徴付けられたマウス皮質インターニューロンのトランスクリプトームを探索する道を開き、細胞アイデンティティをコードする責任のある選択された遺伝子カテゴリを同定した。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

パッチ ・ クランプ後単一のセル多重逆のトランスクリプション ポリメラーゼ連鎖反応

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...