Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

이 작품은 NIH (5R01MH094705-04와 Z.J.H.에 R01MH109665-01)에서 교부 금에 의해, CSHL 로버트 슨 신경 과학 기금 (Z.J.H.)에 의해 고 NARSAD 장래가 화목 (되)에 의해 지원 되었다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 찬 봄 항구 실험실, 뉴욕 (IACUC #16-13-09-8)에 IACUC에 의해 승인 되었습니다.
1. 수동 정렬 붙일 레이블이 마우스 뉴런의
<ol><li>10-15 µ m 출구 직경 모 세관 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음 설정을 가진 유리 microcapillaries ( 재료의 표참조)를 당겨: 열: 508, 풀: 비어 벨: 빈, 시간: 빈.</li>
	<li>120-150 cm 유연한 실리콘 튜브 (~0.8 m m 내경)...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

프로토콜을 정렬 매뉴얼은 인구 밀도 쥐 두뇌에서 표시 또는 현재 높은 처리량 셀을 사용 하 여 공부 가능 하지 않은 희소 한 세포 인구를 대표 하는 신경의 감독된 RNA 시퀀싱에 적합 정렬 및 증폭 방법입니다. FACS를 보통 복종 셀 노즐 크기에 따라 ~ 9-14 psi의 범위에서 칼 집 및 샘플 라인 압력을 받 다 고 원하는 이벤트 요금. 또한, 노즐에서 배출 되 고, 시 셀 수 토지 하드 컬렉션 튜브 또는 우물 영...

단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) transcriptomic 연구 변신 했다. 대규모 단일 셀 RNAseq 다양 한 방울1,2, 마이크로3, nanogrids4, microwells5와 같은 기술 사용 하 여 수행할 수 있지만 대부분 메서드 정의 된 셀을 정렬할 수 없습니다. 그 유전자 인코딩된 fluorophores를 표현 한다. 선택 세포 인구를 격리 하려면 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀 모드에서 레이블이 지정 된 셀을 정렬 하려면 종종 사용 됩니다. 그러나, FACS 몇 가지 제한 사항이 있으며 세심 한 샘플 처리 단계가 필요 합니다. 첫째, 입력된 셀의 많은 수는 일반적으로 상당한 분수 (종종 몇 백만 셀 mL 당), 필요 (> 15-20%) 레이블이 지정 된 인구를 포함 하. 둘째, 셀 준비 조밀도 기온 변화도 원심 분리 단계 폐해 분수, 파편, 및 그렇지 않으면 노즐 또는 흐름 셀을 방해할 수 있습니다 세포 덩어리를 제거 하의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다. 셋째, FACS 일반적으로 얼룩이 지 고 라이브/죽은 (예를 들어, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium 요오드 화물 (PI), 및 Cytotracker 염료) 얼룩, 추가 시간을 소요 하기 위한 단계를 destaining을 사용 합니다. 넷째, 엄지손가락의 규칙 2-색상 정렬 (예: DAPI 및 그린/레드 형광 단백질 (GFP/RFP)), 일반적으로 두 개의 예제 및 컨트롤은 필요에 따라 원하는 마우스 긴장 뿐만 아니라 처리 됩니다 레이블된 샘플을 요구. 다섯째, 필터링은 종종 수행 하기 전에 여러 번 샘플 FACS 기계에 막힌된 샘플 라인을 사전 방지 하기 위해 정렬 하는 동안. 여섯째, 가장 일반적으로 사용 되 FACS 설정을 초기화 하 고 유체 흐름을 안정화 고 방울 캘리브레이션을 수행에 시간을 할당 해야 합니다. 예제는 일반적으로 보상 행렬, 더블 릿 거부 설정, 중 문, 등 사용자 설정 단계 6과 7 스스로 미리 또는 필요에 대 한 실제 샘플 컬렉션 이전 순서 대로 실행 하는 7, 제어는 동시에 기술자의 지원입니다. 마지막으로, 포스트-FACS, 종종 하나의 분류에 셀에 각 잘; 있는지 확인 하는 단계는 예를 들어 빠른 판 영상 등이 콘텐츠 심사 설치에 샘플 검사 여.
위에서 설명한 단계를 우회 하 여 붙일 레이블이 단일 뉴런의 작은 인구의 시퀀싱을 대상으로 비교적 빠른 촉진 수동 절차 뒤에 매우 민감한 체 외 의 2 라운드 정렬 설명 증폭 프로토콜, 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 두 번 시험관 전사 라는. RNA 증폭 및 cDNA 라이브러리 생성은 Eberwine 그 외 여러분 에서 적응 6 와 Hashimshony 외. 7, 작은 세포 볼륨; 있는 마우스 수에 맞게 특정 수정 또한, 우리는 또한 흥분 성의 피라미드 뉴런에 대 한 동등 하 게 유용 하다 발견.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 지금 유전자 발현 시 금 한 널리 구현 된 도구 이다. 상업적으로 사용 가능한 단일 셀 RNA 시퀀싱 플랫폼 무차별 모든 입력된 셀 처리합니다. 때때로, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 관심의 구체적으로 레이블이 지정 된 인구를 분리 하 상류 사용 됩니다. FACS의 한계는 수집 하 고 쥐의 뇌에서 드문 또는 띄엄띄엄 레이블이 신경 인구를 프로 파일링에 대 한 실용적인 크게 레이블이 분수 입력된 셀의 높은 숫자에 대 한 필요는. 여기, 우리는 수동으로 수집 스파스 붙일 갓에서 단일 뉴런을 표시 해리 마우스 뇌 조직에 대 한 메서드를 설명 합니다. 이 프로세스는 높은 순도와 생체 외에서 전사 기반 증폭 프로토콜 생 성적 비율을 유지 하는 후속 통합 단일 레이블 뉴런을 캡처에 대 한 수 있습니다. 개별 mRNA 카운트를 생성 하기 위해 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하는 이중 선형 증폭 방법을 설명 합니다. 증폭 결과 단일 셀 당 유전자 검출의 높은 학위에서의 2 라운드.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, GABAergic 신경 했다 수동으로 정렬 (그림 1) 고 RNA는 증폭, cDNA 라이브러리 (그림 2)로 그리고 높은 깊이8시퀀스. 증폭된 RNA (aRNA) 제품 500 위에 약간 피크 분포와 크기에서 200-4000 bp 사이 원거리 bp (그림 3A). 비드 정화 cDNA 라이브러리 추가 구슬 200 보다 ?...

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

이 프로토콜 수동을 정렬 mRNA 증폭 높은 깊이 단일 셀 RNA 시퀀싱 전사 기반 생체 외에서 다음 단일 붙일 레이블된 신경 세포를 분리 하는 절차에 설명 합니다.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

이 방법은 단일 뉴런 격리 및 시퀀싱 분야의 주요 장애물을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특정 인구 또는 사용자 정의 뇌 영역에서 형광으로 표지 된 뉴런의 하위 집단을 수집하는 것과 같은. 이 기술의 주요 장점은 관심의 단일 뉴런이 파편을 오염하지 않고 포획되도록 한다는 것입니다.그것은 또한 상대적으로 부드러운, 기존의 FACS 정렬의 유체 압력을 실시 하는 경우 신속 하 게 죽는 깨지기 쉬운 신경 유형에 대 한 중요 한. 모세관 풀러를 사용하여 10 내지 15 미크로네 출구 직경을 가진 당겨진 유리 미세 모세 혈관을 준비하여 시작합니다. 미세 한 가위를 사용하여 모세관의 끝을 잘라 원하는 보드 직경을 가져옵니다.그런 다음 튜브 커넥터를 사용하여 0.2 마이크론 PVDF 멤브레인 주사기 필터와 양방향 튜브 밸브에 0.8 밀리미터 내부 직경의 유연한 실리콘 튜브의 120 ~ 150센티미터 길이를 부착합니다. 차가운 인공 뇌 척수액 또는 ACSF의 500 밀리리터를 준비하고 15 분 동안 에어스톤을 통해 또는 용액이 완전히 지울 때까지 5 %의 이산화탄소 균형 산소를 버블링하여 산소를 공급하십시오. ACSF 100 밀리리터를 포함하는 150밀리리터 비커 3개를 준비합니다.하나에, 활동 차단제의 칵테일을 추가합니다. 다른 하나에, 밀리 리터 당 1 밀리 그램의 최종 농도에 프로테아제대 연쇄상 구균 분획을 추가합니다. 최종 비커에 FBS를 1%의 최종 농도에 추가하고 에어스톤을 통해 이산화탄소 균형 산소를 5%로 산소화합니다.마지막으로, 출구 직경이 줄어 있는 세 개의 긴 파스퇴르 파이펫을 화염 위로 굴려 서 십시오. 작은 가위로 두개골을 열고 피질을 손상시키지 않고 미세 포셉을 사용하여 신선한 뇌를 추출하여 안락사 마우스에서 뇌를 해부하십시오. 절제 기간 동안 5%의 이산화탄소 균형 산소에 부착된 에어스톤을 남기고, 차갑고 산소가 공급되는 ACSF에 뇌를 배치합니다.뇌를 진동 척에 배치하고 관상 또는 처진 부분을 300 미칸 두께로 자른다. 최소 10~50개의 라벨이 부착된 셀을 얻기 위해 필요에 따라 많은 섹션을 수집합니다. 비커 안에 놓인 면 메쉬 슬라이스 홀더에 슬라이스를 넣어 산소가 공급되는 ACSF로 목욕합니다.액티비티 블로커를 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하고 에어스톤을 사용하여 산소를 부각시키면서 실온에서 15~20분 동안 차단합니다. 프로테제스 용액을 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하여 실온에서 가벼운 소화를 수행합니다. 소화후 실온에서 액티비티 블로커 용액을 사용하여 ACSF를 함유한 비커로 슬라이스를 다시 이동하여 프로테아제를 씻어내라.거품 산소를 유지합니다. 다음으로 실온에서 1%의 FBS가 포함된 ACSF가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비하고 개별 섹션을 마이크로절을 위해 디스크로 이동합니다. 형광 해부 범위하에서, 마이크로 해부 영역 및 최소 10 ~ 50 세포를 갖는 관심층에 미세 집게 쌍을 사용합니다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 ACSF 솔루션에서 약 0.8 밀리리터를 포함하는 2밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 마이크로 해부 된 조각을 이동합니다. 실온에서 마이크로 퍼지 튜브에 해부 된 조직을 적시. 가장 크고 가장 작은 출구 직경으로 끝나는 각 화염 파스퇴기 파이펫으로 약 10 스트로크를 수행합니다.해리된 세포를 산소ACSF를 함유한 100mm 페트리 접시에 분배하고 세포가 점진적으로 정착할 때까지 5~7분 정도 기다립니다. 해부 현미경하에서 GFP 및 RFP 신호를 관찰한다. 밝은 필드 조명 아래에서 형태를 검사하여 이물질을 식별합니다.이물질이 거의 없는 세포의 영역이 확인되면 모세관을 사용하여 튜브에 부착하여 튜브 밸브의 끝을 혀로 차단하여 세포를 선택하십시오. 그런 다음 모세관을 세포에 가깝게 배치합니다. 모세관의 블록을 방출하고 모세관 작용을 사용하여 세포를 캡처하기 위해 다시 신속하게 차단합니다.모세관을 신선한 산소 ACSF로 100mm 페트리 접시로 옮기고 형광 광학 에서 모세관 팁을 관찰하면서 튜브로 부드럽게 날려 세포를 접시에 분배합니다. 100~150개의 세포가 수집될 때까지 수집 절차를 반복하여 이물질과 같은 오염물질이 밝은 필드 차동 간섭 대조 광학에서 최소화되도록 합니다. 마지막으로, 매번 신선한 마이크로 모세관 파이펫을 사용하여 단일 셀을 선택하고 0.5 마이크로리터를 0.5 마이크로리터로 추방하여 프라이머를 함유한 샘플 수집 버퍼 1마이크로리터를 포함하는 0.2 마이크로리터 마이크로 퍼지 튜브로 추방합니다.마이크로 퍼지 튜브의 파이펫 팁을 깨고 셀이 수집 버퍼에 머물수 있도록 합니다. 마른 얼음에 튜브를 넣어 세포를 동결. RNA 증폭을 위한 처리될 때까지 영하 80도 냉동고에 보관하십시오.GABAergic 뉴런은 마우스 뇌의 cingulet 피질에서 분리되었다. 수동으로 정렬된 뉴런으로부터 증폭된 RNA는 500개의 베이스 쌍 보다 약간 높은 피크 분포를 가진 크기가 200에서 4, 000의 베이스 쌍 사이를 배회했다. 비드 정화 후, cDNA 라이브러리는 200개 미만의 베이스 쌍과 약 350개의 베이스 쌍에서 피크를 제거하기 위해 구슬을 이용한 2차 정화에 의해 더욱 제한된다.시퀀싱은 셀당 4.8배 10배, 5위 중앙값6.9배 10회 10회, 셀당 5일 평균 매핑판독을 보였다. UMIs를 사용하여 RNA를 중복한 후, 각 단일 세포는 5번째 중앙값으로 1.0배 또는 1.4배 10배, 세포당 5번째 평균 고유 판독을 가졌다. 각 단세포 외부 RNA 대조컨소시엄에서, RNA의 스파이크는 시료에 첨가된 절대 분자수를 계산하기 위해 내부 대조군으로 사용되었다.0.92의 경사와 0.94의 조정 된 R 사각형으로 관찰 된 카운트에 입력의 선형 관계가 있었다. 단일 뉴런 당 약 10, 000 유전자의 평균6, 000 개 이상의 유전자를 검출 하는 단일 세포의 95% 이상이 절차를 사용 하 여 검출 되었다. 개발 후, 이 기술은 분자 생물학자가 뚜렷한 잘 특징적인 마우스 피질 인터뉴런의 전사체를 탐구할 수 있는 길을 열어주었으며, 세포 정체성에 대한 코딩을 담당하는 엄선된 유전자 범주를 확인했습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

연구

신경과학

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

PDGFRα + 셀 낮은 셀 Chromatin Immunoprecipitation 시퀀싱 분석에 의해 정화에 녹음 방송 요인 Olig2 게놈 바인딩 사이트를 심하게 식별

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...