Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01 til Z.J.H.) av CSHL Robertson nevrovitenskap Fund (til Z.J.H.) og av et NARSAD Post-Doctoral fellesskap (til A.P.).

Alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av IACUC på Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manuell sortering av Fluorescently merket musen Neurons
<ol><li>Trekke glass microcapillaries (se Tabell of Materials) til 10-15 µm Avslutt diameter med en kapillær avtrekker med følgende innstillinger: varme: 508, trekk: Tom, vel: Tom, tid: Tom.</li>
	<li>Fest 120-150 cm fleksibel silikon rør (~0.8 mm i diameter) til et 0,2 µm polyvinylidene difluoride (...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Manuell sortering protokollen er egnet for en veiledet RNA sekvensering av Nevron populasjoner som enten tynt merket i mus hjernen eller representerer en sjelden celle populasjon som ellers ikke er mulig å studere med gjeldende høy gjennomstrømming cellen sortering og forsterkning metoder. Celler underlegges FACS vanligvis gjennomgå skjede og prøve linje press i størrelsesorden ~ 9-14 psi, avhengig av størrelsen på munnstykket og ønsket hendelse priser. Dessuten, ved å være kastet ut av munnstykket, kan cellen...

Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) har forvandlet transcriptomic studier. Mens store encellede RNAseq kan utføres ved hjelp av en rekke teknikker, som dråper1,2, microfluidics3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerte celletyper som uttrykker genetisk kodet fluorophores. For å isolere et merke celle befolkningen, brukes fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ofte til å sortere merkede celler i én celle modus. Men FACS har noen begrensninger og krever nitid eksempel behandlingstrinnene. Først, et stort antall innsettingsceller er vanligvis nødvendig (ofte flere millioner celler per mL), med en betydelig andel (> 15-20%) som inneholder merket befolkningen. Andre kan cellen preparater kreve flere runder med tetthet gradert sentrifugering fremgangsmåte for å fjerne glial brøkdel, avfall og celle klumper som kan ellers tette munnstykket eller flow cellen. Tredje bruker FACS vanligvis flekker og destaining trinn for live/døde flekker (f.eks 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodide (PI) og Cytotracker fargestoffer), som tar opp ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to farger sortering (som DAPI og grønn/rød fluorescerende protein (GFP/RFP)), vanligvis to eksempler og en kontroll er nødvendig, krever en umerket prøve behandles i tillegg til ønsket musen belastningen. Femte utføres filtrering ofte flere ganger før og under eksempel sortering for å proaktivt forhindre tette utvalg linjer i en FACS maskin. Sjette må tid være tildelt i vanligste FACS oppsett å initialisere og stabilisere væske strømmen og utføre slippverktøy kalibrering. Syvende, kontroll prøver vanligvis kjøres i rekkefølge før samlingen faktisk prøve å konfigurere kompensasjon matriser, doublet avvisning, gates, etc. brukere enten utføre trinn seks og sju selv forhånd eller krever det hjelp av en tekniker parallelt. Til slutt, innlegget-FACS, det er ofte skritt for å sikre at bare merket én celler, finnes i hver brønn; for eksempel ved å sjekke prøver i et høyt innhold screening oppsett som en rask plate imager.
Å omgå innstillinger og tilrettelegge en relativt rask, målrettet sekvensering av en liten populasjon av enkelt fluorescently merket neurons, beskriver vi en manuell sortering prosedyren etterfulgt av to runder med en svært følsom i vitro forsterkning protokollen, kalt dobbel in vitro transkripsjon med absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA forsterkning og cDNA bibliotek generasjonen er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med enkelte modifikasjoner for mus interneurons som har mindre mobilnettet volum; Videre har vi også funnet at det er like nyttige for eksitatoriske pyramidale nevroner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) er nå et vidt gjennomført verktøy for assaying genuttrykk. Kommersielt tilgjengelige encellede RNA-sekvensering plattformer behandle alle innsettingsceller ukritisk. Fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) brukes noen ganger oppstrøms isolere en spesielt merket befolkning av interesse. En begrensning av FACS er behovet for høyt antall innsettingsceller med betydelig merket fraksjoner, som er upraktisk for innsamling og profilering sjeldne eller tynt merket Nevron bestander fra musen hjernen. Her beskriver vi en metode for manuelt å samle spredte fluorescently merket enkelt neurons fra ferske dissosiert musen hjernevev. Denne prosessen tillater fanger single-merket neurons med høy renhetsgrad og påfølgende integrering med en i vitro transkripsjon-baserte forsterkning protokoll som bevarer endogene transkripsjon prosenter. Vi beskriver en dobbel lineær forsterkning metode som bruker unike molekyl identifikatorer (UMIs) til å generere individuelle mRNA teller. To runder av forsterkning gir en høy grad av genet per enkelt celle.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, GABAergic neurons var manuelt sortert (figur 1) og RNA ble forsterket, deretter laget i et cDNA bibliotek (figur 2) og sekvensert høy dybde8. Forsterket RNA (aRNA) produktene varierte mellom 200-4000 bp i størrelse, med en topp distribusjon over 500 bp (figur 3A). Perle-renset cDNA biblioteket var størrelse-begrenset av en ...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Encellede RNA sekvensering av Fluorescently merket musen Neurons med manuell sortering og dobbel In Vitro transkripsjon absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq)

Denne protokollen beskriver manuell sortering fremgangsmåten for å isolere enkelt fluorescently merket neurons etterfulgt av i vitro transkripsjon-baserte mRNA forsterkning for høy-dybde encellede RNA sekvensering.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Denne metoden kan bidra til å løse et viktig hinder innen single-neuron isolasjon og sekvensering. Som å samle inn spesifikk populasjon eller en underpopulasjon av fluorescerende merket nevron fra brukerdefinert hjerneområde. Den største fordelen med denne teknikken er at den sikrer at enkelt neuron av interesse fanges uten å forurense rusk.Det er også relativt skånsomt, noe som er viktig for skjøre nevrontyper som dør raskt når de blir utsatt for væsketrykket til konvensjonell FACS-sortering. Start med å forberede mikrokapillærer i trukket glass med 10 til 15 mikron utgangsdiameter ved hjelp av en kapillær avtrekker. Bruk fin saks for å kutte spissen av kapillæren for å få ønsket borddiameter.Bruk deretter slangekontakter til å feste en 120 til 150 centimeter lang fleksibel silikonrør med 0,8 millimeter innvendig diameter til et 0,2 mikron PVDF membransprøytefilter og en toveis rørventil. Forbered 500 milliliter kjølt kunstig cerebral spinalvæske eller ACSF og oksygenat ved å boble 5% karbondioksid balansert oksygen gjennom en Airstone i 15 minutter eller til løsningen klarner helt. Forbered tre 150-milliliter beger som hver inneholder 100 milliliter ACSF.Til en, legg til en cocktail av aktivitetsblokkere. Til en annen, legge Streptococcus fraksjon for protease til en endelig konsentrasjon på ett mg per milliliter. Til det endelige begeret, legg FBS til en endelig konsentrasjon på 1%og oksygenat med 5% karbondioksidbalansert oksygen gjennom en Airstone.Til slutt, lage tre lang-stammet Pasteur pipetter med avtagende utgangdiametere ved å rulle dem over en åpen flamme. Disseker hjernen fra en eutanisert mus ved å åpne kraniet med en liten saks og trekke ut den friske hjernen ved hjelp av fine tang uten å skade cortex. Plasser hjernen i kjølt og oksygenert ACSF slik at en Airstone er festet til 5% karbondioksidbalansert oksygen under hele varigheten av snittingen.Plasser hjernen på vibratom chuck og kutt koronale eller sagittal seksjoner på 300 mikron tykkelse. Samle så mange seksjoner som nødvendig for å få minst 10 til 50 merkede celler. Sett skiver på en bomullsmasket skiveholder plassert inne i et beger, slik at de blir badet i oksygenert ACSF.Flytt skivene inn i begeret som inneholder ACSF med aktivitetsblokkere og blokker i 15 til 20 minutter ved romtemperatur mens du bobler oksygen ved hjelp av en Airstone. Flytt skivene til begeret som inneholder ACSF med proteaseløsningen for å utføre mild fordøyelse ved romtemperatur. Etter fordøyelsen, vask ut protease ved å flytte skiver tilbake til begeret som inneholder ACSF med aktivitetsblokkerløsning i fem til 10 minutter ved romtemperatur.Fortsett å boble oksygen. Deretter forbereder du en 100 millimeter petriskål som inneholder ACSF med 1 % FBS ved romtemperatur og flytter individuelle seksjoner inn i disken for mikrodisseksjon. Under et fluorescerende disseksjonsomfang, bruk et par fine tang til mikrodektområder og lag av interesse som har minst 10 til 50 celler.Bruk en Pasteurpipette til å flytte mikrodisserte stykker til et 2-milliliter mikrocentrifugerør som inneholder ca. 0,8 milliliter med 1 % FBS i ACSF-oppløsning. Titrer det dissekerte vevet i mikrofugerøret ved romtemperatur. Utfør ca 10 slag med hver av de flammede Pasteur pipetter starter med den største og slutter med den minste utgangdiameter.Dispenser de dissosierte cellene i en 100-millimeter petriskål som inneholder oksygenert ACSF og vent fem til syv minutter for at cellene gradvis skal bosette seg. Vær oppmerksom på GFP- og RFP-signalet under et disseksjonsmikroskop. Identifiser rusk ved å undersøke morfologien under lysfeltbelysning.Når et område med celler med lite rusk er identifisert, bruk kapillæren og fest til rør for å plukke celler ved å blokkere enden av rørventilen med tungen. Plasser deretter kapillæren nær cellene. Slipp blokken på kapillæren og blokker raskt igjen for å fange cellen ved hjelp av kapillærhandling.Flytt kapillæren til en 100 millimeter petriskål med frisk oksygenert ACSF og blås forsiktig inn i røret mens du observerer kapillærspissen under fluorescensoptikk for å dispensere cellene inn i fatet. Gjenta innsamlingsprosedyren til 100 til 150 celler samles inn, og pass på at forurensninger, for eksempel rusk, er minimale i lysfelts differensialkontrastkontrastoptikk. Til slutt, ved hjelp av en frisk mikrokapillær pipette hver gang, velg en enkelt celle og utvise den i ikke mer enn 0,5 mikroliter i en 0,2 mikro-fuge rør som inneholder en mikroliter prøve-samling buffer med primere.Bryt pipettespissen i mikrofugerøret for å sikre at cellen forblir i oppsamlingsbufferen. Frys cellene ved å sette rørene på tørris. Oppbevares i en minus 80-graders Celsius fryser til behandling for RNA forsterkning.GABAergiske nevroner ble isolert fra cingulet cortex av musehjernen. RNA forsterket fra manuelt sorterte nevroner varierte mellom 200 til 4 000 basepar i størrelse med en toppfordeling litt over 500 basispar. Etter perlerensing er cDNA-biblioteket ytterligere størrelse begrenset av en andre runde rensing ved hjelp av perler for å eliminere fragmenter mindre enn 200 basispar og for toppen på ca 350 basepar.Sekvensering viste en 4,8 ganger 10 til femte median eller 6,9 ganger 10 til den femte gjennomsnittlige kartlagte leser per celle. Etter duplisert RNA fjerning ved hjelp av UMIer, hver enkelt celle hadde en 1,0 ganger 10 til femte median eller 1,4 ganger 10 til femte gjennomsnittlig unike leser per celle. I hver enkelt celle eksterne RNA kontroller konsortiet, pigg i RNA ble brukt som en intern kontroll for å beregne absolutt antall molekyler lagt til prøven.Det var en lineær sammenheng med innspill til observerte tellinger med en skråning på 0,92 og justert R-kvadrat på 0,94. Et gjennomsnitt på rundt 10.000 gener per enkelt neuron ble oppdaget ved hjelp av denne prosedyren med mer enn 95% av enkeltcellene som oppdager mer enn 6000 gener. Etter utviklingen banet denne teknikken veien for molekylærbiologer å utforske transkripsjonen av distinkte godt karakteriserte muskortikale interneuroner, og identifiserte utvalgte genkategorier som er ansvarlige for koding av cellulær identitet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encellet Profiling for å utvikle og modne Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Pålitelig Identifikasjon av Bo dopaminerge nevroner i midthjernen kulturer Bruke RNA sekvensering og TH-promoter-drevet EGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Enkeltcelle RNA-Seq av definerte subsets av retinal Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifisere transkripsjon faktor Olig2 genomisk bindende områder i akutt renset PDGFRα + celler av lav-cellers Chromatin Immunoprecipitation sekvensering analyse

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Enkelt celle Multiplex omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons etter Patch-klemme

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...