Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH (5R01MH094705-04 e 01-R01MH109665 para Z.J.H.), pelo fundo de neurociência CSHL Robertson (para Z.J.H.) e por um NARSAD Doctoral Fellowship (para A.P.).

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo IACUC em Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manual de classificação de neurônios de rato fluorescente etiquetadas
<ol><li>Puxe microcapilares de vidro (veja a Tabela de materiais) para 10-15 µm de diâmetro de saída usando um extrator capilar com as seguintes configurações: calor: 508, puxe: em branco, vel: em branco, tempo: em branco.</li>
	<li>Anexe tubos de silicone flex?...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

O manual de classificação protocolo é apropriado para uma sequenciação do ARN supervisionada de neurônio populações que são escassamente rotulada do cérebro de ratos ou estão representando uma população de células raras que caso contrário, não é viável para estudar usando a célula atual da elevado-produção métodos de triagem e amplificação. As células submetidas a FACS geralmente sofrem pressões de linha bainha e amostra na faixa de ~ 9 – 14 psi, dependendo do tamanho do bocal e desejado taxas...

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) transformou-se estudos de transcriptomic. Enquanto em grande escala RNAseq de célula única pode ser executada usando uma variedade de técnicas, como as gotas1,2, Microfluido3, nanogrids4e micropoços5, a maioria dos métodos não pode classificar tipos de células definidas que expressam fluorophores geneticamente codificado. Para isolar uma população selecione a célula, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é frequentemente usada para classificar as pilhas etiquetadas em um modo de célula única. No entanto, FACS tem algumas restrições e requer etapas de processamento de amostra meticuloso. Em primeiro lugar, um grande número de células de entrada é normalmente necessários (muitas vezes vários milhões de células / mL), com uma fração significativa (> 15 – 20%) contendo a população rotulada. Em segundo lugar, preparações da pilha podem exigir várias rodadas de etapas de centrifugação gradiente de densidade para remover fração glia, detritos e aglomerados de células que caso contrário podem obstruir o bocal ou fluxo de célula. Em terceiro lugar, FACS geralmente emprega a coloração e descoloração passos para viver/morrer coloração (por exemplo, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), iodeto de propidium (PI) e corantes Cytotracker), que ocupam tempo adicional. Em quarto lugar, como uma regra de ouro para duas cores classificação (como DAPI e proteína fluorescente verde/vermelho (GFP/RFP)), geralmente duas amostras e um controle são necessários, exigindo uma amostra sem rótulo para ser processado além da estirpe do mouse desejado. Em quinto lugar, a filtragem é frequentemente realizada várias vezes antes e durante a amostra classificação para proativamente evitar linhas de exemplo obstruído em uma máquina de FACS. Em sexto lugar, o tempo deve ser atribuído em configurações de FACS mais comumente usadas para inicializar e estabilizar o fluxo de fluido e realizar a calibração da gota. Sétimo, controle de amostras geralmente são executadas em sequência antes da colheita de amostra real para criar matrizes de compensação, rejeição de gibão, definindo portões, etc. os usuários também executar as etapas 6 e 7 se antes do tempo ou exigir o assistência de um técnico em paralelo. Finalmente, post-FACS, muitas vezes há medidas para assegurar que somente rotulado única células estão presentes em cada poço; por exemplo, verificando as amostras em uma configuração de alto teor de triagem como um gerador de imagens de prato rápido.
Para contornar as etapas descritas acima e facilitar um relativamente rápida, alvo de sequenciamento de uma pequena população de neurônios fluorescente etiquetadas único, descrevemos um manual de classificação procedimento seguido por duas rodadas de um altamente sensíveis em vitro Protocolo de amplificação, chamado dobro da transcrição in vitro com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq). A geração de biblioteca de amplificação e do cDNA de RNA é adaptada de Eberwine et al . 6 e Hashimshony et al . 7, com certas modificações para atender interneurônios rato que têm volumes menores de celulares; Além disso, encontramos também é igualmente útil para excitatórios neurônios piramidais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

A sequenciação do ARN unicelulares (RNA-seq) agora é uma ferramenta amplamente implementada para análise de expressão gênica. Plataformas de sequenciação do ARN monocelulares comercialmente disponíveis processam tudo entradas células indiscriminadamente. Às vezes, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é usada contra a corrente para isolar uma população especificamente rotulada de interesse. Uma limitação de FACS é a necessidade de números elevados de células entradas com frações significativamente rotuladas, que é impraticável para coleta e criação de perfil de populações raras ou escassamente rotulada neurônio do cérebro do rato. Aqui, descrevemos um método para manualmente coletando esparsas fluorescente etiquetado único neurônios de recém dissociado tecido de cérebro de rato. Este processo permite a captura de neurônios com rótulo único com pureza elevada e subsequente integração com um em vitro protocolo de amplificação baseada na transcrição que preserva os rácios de transcrição endógena. Nós descrevemos um método de amplificação linear duplo que usa identificadores da molécula original (UMIs) para gerar contagens individuais do mRNA. Duas rodadas de resultados de amplificação em um alto grau de deteção de gene por uma única célula.

Usando o protocolo descrito acima, gabaérgica neurônios manualmente foram classificados (Figura 1) e RNA amplificado, depois foi transformado em uma biblioteca de cDNA (Figura 2) e sequenciado em alta profundidade8. Os produtos amplificados do RNA (aRNA) variaram entre 200 – 4.000 bp em tamanho, com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 bp (Figura 3A). A bib...

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Este protocolo descreve o manual de procedimento para isolar o único neurônios fluorescente etiquetados seguidos em vitro baseada na transcrição de amplificação do mRNA para a sequenciação do ARN de alta profundidade única célula de triagem.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Este método pode ajudar a resolver um obstáculo chave no campo do isolamento e sequenciamento de um único neurônio. Como a coleta de população específica ou uma subpopulação de neurônio fluorescente rotulado da área cerebral definida pelo usuário. A principal vantagem dessa técnica é que ela garante que o único neurônio de interesse seja capturado sem contaminar detritos.Também é relativamente suave, o que é importante para tipos de neurônios frágeis que morrem rapidamente quando submetidos às pressões fluidas da classificação FACS convencional. Comece preparando microcapillarias de vidro puxados com diâmetro de saída de 10 a 15 mícrons usando um puxador capilar. Use uma tesoura fina para cortar a ponta do capilar para obter o diâmetro desejado da placa.Em seguida, use conectores de tubulação para anexar um comprimento de 120 a 150 centímetros de tubulação flexível de silicone com 0,8 milímetros de diâmetro interno a um filtro de seringa de membrana PVDF de 0,2 mícal e uma válvula de tubulação bidirecional. Prepare 500 mililitros de fluido espinhal cerebral artificial resfriado ou ACSF e oxigene por borbulhar 5% de dióxido de carbono de oxigênio equilibrado através de uma Pedra aérea por 15 minutos ou até que a solução se esclae completamente. Prepare três béquers de 150 mililitros cada um contendo 100 mililitros de ACSF.A um, adicione um coquetel de bloqueadores de atividade. Por outro, adicione fração de Streptococcus para protease a uma concentração final de um miligrama por mililitro. Ao béquer final, adicione FBS a uma concentração final de 1% e oxigene com oxigênio balanceado com 5% de dióxido de carbono através de uma pedra aérea.Finalmente, faça três pipetas Pasteur de haste longa com diâmetros de saída decrescentes, rolando-as sobre uma chama aberta. Disseque o cérebro de um rato eutanizado abrindo o crânio com uma pequena tesoura e extraindo o cérebro fresco usando fórceps finos sem danificar o córtex. Coloque o cérebro em ACSF refrigerado e oxigenado deixando uma Pedra de Ar presa a oxigênio balanceado com dióxido de carbono de 5% durante toda a duração da secção.Posicione o cérebro sobre o mandril vibratome e corte as seções coronal ou sagital a 300 mícrons de espessura. Colete quantas seções necessários para obter um mínimo de 10 a 50 células rotuladas. Coloque fatias em um suporte de fatia de algodão colocado dentro de um béquer para que eles sejam banhados em ACSF oxigenado.Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com bloqueadores de atividade e bloqueie por 15 a 20 minutos em temperatura ambiente enquanto borbulha oxigênio usando uma pedra aérea. Mova as fatias para o béquer contendo ACSF com a solução protease para realizar uma digestão leve à temperatura ambiente. Após a digestão, lave o protease movendo fatias de volta para o béquer contendo ACSF com solução de bloqueador de atividade por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente.Continue borbulhando oxigênio. Em seguida, prepare uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF com 1%FBS à temperatura ambiente e mova seções individuais para o disco para microdisseção. Sob um escopo de dissecções fluorescentes, use um par de fórceps finos para micro dissecar áreas e camadas de interesse com um mínimo de 10 a 50 células.Usando uma pipeta Pasteur, mova as peças micro-dissecadas para um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros contendo aproximadamente 0,8 mililitros de 1% FBS na solução ACSF. Titular o tecido dissecado no tubo de microfusão à temperatura ambiente. Realize aproximadamente 10 tacadas com cada uma das pipetas Pasteur flamedas começando com as maiores e terminando com o menor diâmetro de saída.Distribua as células dissociadas em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo ACSF oxigenado e espere de cinco a sete minutos para que as células se instalem gradualmente. Observe o sinal GFP e RFP sob um microscópio de dissecção. Identifique os detritos examinando a morfologia sob iluminação de campo brilhante.Uma vez que uma área de células com pequenos detritos tenha sido identificada, use o capilar e conecte-se à tubulação para colher células bloqueando a extremidade da válvula de tubulação com a língua. Em seguida, posicione o capilar perto das células. Solte o bloco no capilar e bloqueie rapidamente novamente para capturar a célula usando ação capilar.Mova o capilar para uma placa de Petri de 100 milímetros com ACSF oxigenado fresco e sopre suavemente no tubo enquanto observa a ponta capilar sob a óptica fluorescência para distribuir as células no prato. Repita o procedimento de coleta até que 100 a 150 células sejam coletadas, certificando-se de que os contaminantes, como os detritos, sejam mínimos em óptica de contraste de interferência diferencial de campo brilhante. Finalmente, usando uma pipeta micro-capilar fresca cada vez, escolha uma única célula e expulse-a em no máximo 0,5 microlitros em um tubo micro-fuge de 0,2 microliter contendo um microliter de tampão de coleta de amostras com primers.Quebre a ponta da pipeta no tubo de microfusão para garantir que a célula permaneça no tampão de coleta. Congele as células colocando os tubos em gelo seco. Armazene em um congelador Celsius de menos 80 graus até o processamento para amplificação de RNA.Os neurônios GABAérgicos foram isolados do córtex cingulet do cérebro do camundongo. O RNA amplificado a partir dos neurônios manualmente classificados variou entre 200 e 4.000 pares de base em tamanho com uma distribuição de pico ligeiramente acima de 500 pares de base. Após a purificação das contas, a biblioteca cDNA é ainda maior restrita por uma segunda rodada de purificação usando contas para eliminar fragmentos com menos de 200 pares de base e para o pico em aproximadamente 350 pares de base.O sequenciamento mostrou uma média de 4,8 vezes 10 para a 5ª mediana ou 6,9 vezes 10 para a 5ª média de leituras mapeadas por célula. Após a remoção duplicada do RNA usando UMIs, cada célula tinha uma média de 1,0 vezes 10 para a 5ª mediana ou 1,4 vezes 10 para a 5ª média de leituras únicas por célula. Em cada consórcio de controles externos de RNA de células únicas, o pico no RNA foi usado como controle interno para calcular o número absoluto de moléculas adicionadas à amostra.Houve uma relação linear de entrada com contagem observada com inclinação de 0,92 e quadrado R ajustado de 0,94. Uma média de cerca de 10.000 genes por único neurônio foram detectados usando este procedimento com mais de 95% das células únicas detectando mais de 6.000 genes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os biólogos moleculares explorarem o transcriptome de estagiários cortical de camundongos bem caracterizados, e identificaram categorias genéticas selecionadas que são responsáveis pela codificação da identidade celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Neurociência

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Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identificação de Sítios de Ligação Genômica do Fator de Transcrição Olig2 em Células PDGFRα+ Purificadas por Análise de Sequenciamento de Imunoprecipitação de Cromatina de Poucas Células

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...