Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Эта работа была поддержке грантов из низ (5R01MH094705-04 и R01MH109665-01-Z.J.H.), CSHL Робертсон нейронауки фонд (Z.J.H.) и NARSAD после стипендии (а.п.).

Все процедуры, включая животных темы были одобрены IACUC холодной весны гавани лаборатории, Нью-Йорк (IACUC #16-13-09-8).
1. Ручная сортировка дневно обозначенные мыши нейронов
<ol><li>Тянуть стекло microcapillaries (см. Таблицу материалы) до 10-15 µm выхода диаметр с помощью капиллярног...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Руководство, сортировка протокол подходит для поднадзорных РНК последовательности нейрона популяций, которые либо малонаселенных помечены в мозге мышей или представляют редкие клеток населения, которое иначе не возможно для исследования с использованием текущей ячейки высокой проп...

Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) превратил транскриптомики исследований. В то время как крупномасштабные одноклеточных RNAseq могут быть выполнены с использованием различных методов, таких как капельки1,2, микрофлюидика3,4nanogrids и microwells5, большинство методов нельзя сортировать типы определенных клеток Это Экспресс генетически закодированный флуорофоров. Чтобы изолировать население выделите ячейку, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) часто используется для сортировки помечены клетки в режиме одной ячейки. Однако СУИМ имеет некоторые ограничения и требует тщательной образца шаги обработки. Во-первых, большое количество ячеек ввода, как правило необходимо (часто несколько миллионов клеток / мл), значительная часть (> 15 – 20%) содержащий помечены населения. Во-вторых подготовка клетки может потребовать несколько раундов плотности градиентного центрифугирования шаги для удаления глиальных дроби, мусора и клеток сгустки, которые в противном случае может засорить сопла или потока ячейки. В-третьих СУИМ обычно работают, окрашивание и минигелей шаги для жить/мертвые окрашивание (например, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), пропидий йодидом (PI) и Cytotracker красителей), которые занимают дополнительное время. В-четвертых как правило для сортировки (например, DAPI и зеленый/красный флуоресцирующий белок (GFP/ППП)), обычно два образца-двухцветный и один элемент управления необходимы, требующих немеченого образец должен обрабатываться в дополнение к желаемой мыши штамма. В-пятых фильтрация часто выполняется несколько раз до и во время пример сортировки proactively предотвратить засорение образец линии в машине СУИМ. В-шестых необходимо выделено время, в наиболее часто используемых настроек СУИМ для инициализации и стабилизировать потоком жидкости и калибровки капли. Седьмой, управления, образцы обычно выполняются в последовательности до фактической проб настроить компенсации матрицы, Дуплет отказ, либо установка ворот, пользователей и т.д. выполните шаги, шесть и семь себя раньше времени или требуют помощь специалиста параллельно. Наконец, пост СУИМ, часто есть шаги, чтобы обеспечить, что только надписью одной клетки присутствуют в каждой скважине; к примеру путем проверки пробы в высоким содержанием скрининг установки, такие как Быстрый плита тепловизор.
Обойти шаги, описанные выше и облегчения относительно быстро, целевые последовательности небольшой численностью населения одного дневно обозначенные нейронов, мы описываем ручной сортировки процедуры следуют два раунда высокочувствительный в пробирке амплификация протокол, называемый двойной in vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива-Seq). РНК амплификации и кДНК библиотеки поколения адаптированы из Eberwine и др. 6 и Hashimshony и др. 7, с некоторыми изменениями с учетом интернейронов мыши, которые имеют меньше сотовой томов; Кроме того мы также обнаружили, что это одинаково полезны для возбуждающих пирамидных нейронов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Одноклеточных последовательности РНК (РНК seq) теперь является широко используемым инструментом для assaying экспрессии генов. Коммерчески доступных платформ одноклеточных РНК последовательности процесса всех входных клетки без разбора. Иногда активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) вверх по течению используется для изоляции специально обозначенные населения интерес. Ограничение СУИМ является необходимость большого числа ячеек ввода с значительно помечены фракций, которые нецелесообразно сбора и профилирование популяций редких или малонаселенных помечены нейрон от мозга мыши. Здесь мы описываем метод для вручную собирать разреженные дневно помечены одного нейроны от свежего отделить ткани мозга мыши. Этот процесс позволяет для захвата однокомпонентным нейронов с высокой чистоты и последующей интеграции с в vitro транскрипция на основе усиления протокол, который сохраняет эндогенного Стенограмма соотношения. Мы описываем двойной линейные усилители метод, который использует уникальные молекулы идентификаторы (UMIs) для создания индивидуальных счетчиков мРНК. Два раунда результатов амплификации в высокой степени обнаружения генов в одной ячейке.

Используя протокол, описанных выше, ГАМК, нейроны были вручную сортируются (рис. 1) и РНК усиливается, затем сделал в библиотеку cDNA (рис. 2) и виртуализации на высокой глубиной8. Усиленные РНК (Арна) продукции колеблется от 200 – 4...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Одноместный клеточной РНК последовательности нейронов дневно обозначенные мыши, с помощью ручной сортировки и двойной в Vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива Seq)

Этот протокол описывает ручной сортировки процедура изолировать одно дневно обозначенные нейронов, следуют в vitro на основе транскрипции мРНК усилители для высоких глубина одноклеточных РНК последовательности.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Этот метод может помочь решить ключевое препятствие в области одно нейронной изоляции и секвенирования. Такие, как сбор конкретной популяции или субпопуляции флуоресцентно помечены нейрона от пользователя определенных области мозга. Основным преимуществом этой техники является то, что она обеспечивает один нейрон интерес захвачен без загрязнения мусора.Это также относительно нежный, что важно для хрупких типов нейронов, которые умирают быстро, когда подвергаются давлению жидкости обычной сортировки FACS. Начните с подготовки вытащил стекла микрокапилляры с 10 до 15 микрон выход диаметром с помощью капиллярного шкива. Используйте тонкие ножницы, чтобы сократить кончик капилляров, чтобы получить желаемый диаметр доски.Затем используйте трубчатые разъемы, чтобы прикрепить 120-150-сантиметровую длину гибкой силиконовой трубки диаметром 0,8 миллиметра к мембранно-шприц-фильтру PVDF диаметром 0,2 микрона и двухмерный трубчатый клапан. Подготовка 500 миллилитров охлажденной искусственной спинномозговой жидкости или ACSF и оксигенации путем пузырьков 5%углекислого газа сбалансированного кислорода через Airstone в течение 15 минут или до тех пор, пока раствор очищает полностью. Приготовьте три 150-миллилитровых стакана, каждый из которых содержит 100 миллилитров ACSF.С одной стороны, добавить коктейль деятельности блокаторы. С другой стороны, добавьте фракцию стрептококка для протеазы к окончательной концентрации одного миллиграмма на миллилитр. К окончательному стакану добавьте FBS к окончательной концентрации 1%и оксигенат с 5%carbon двуокиси сбалансированного кислорода через Airstone.Наконец, сделайте три длинносырных пипетки Pasteur с уменьшением диаметров выхода, перекатив их на открытое пламя. Рассекайте мозг от усыпленной мыши, открыв череп небольшими ножницами и извлекая свежий мозг с помощью тонких типсов, не повреждая кору. Поместите мозг в охлажденный и оксигенированный ACSF, оставляя воздушный камень, прикрепленный к 5%углекислому газу, сбалансированному кислороду в течение всего периода секции.Распорежьте мозг на виброме патрона и вырежьте корональные или стрельцовые секции толщиной 300 микрон. Соберите как можно больше секций, необходимых для получения как минимум от 10 до 50 помеченных ячеек. Положите ломтики на хлопчатобумажной сетки ломтик держатель помещен внутри стакана, чтобы они купались в кислородом ACSF.Переместите ломтики в стакан, содержащий ACSF с блокаторами активности, и блокируйте в течение 15-20 минут при комнатной температуре при пузырьковом кислороде с помощью Airstone. Переместите ломтики в стакан, содержащий ACSF с раствором протеазы для выполнения мягкого пищеварения при комнатной температуре. После пищеварения вымойте протеазу, перемещая ломтики обратно в стакан, содержащий ACSF с раствором блокатора активности в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре.Держите восходящей кислорода. Затем приготовьте 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую ACSF с 1%FBS при комнатной температуре, и переместим отдельные секции в диск для микропересмешки. Под флуоресцентными вскрытиями, используйте пару тонких типсов для микро-препарации областей и слоев интереса, имеющих как минимум от 10 до 50 клеток.Используя пипетку Pasteur, переместите микропарированные кусочки в 2-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую приблизительно 0,8 миллилитров 1%FBS в растворе ACSF. Титрат расчлененной ткани в микро-фуге трубки при комнатной температуре. Выполните около 10 ударов с каждым из воспаленных пипеток Pasteur, начиная с самой большой и заканчивая самым маленьким диаметром выхода.Разпределить диссоциированные клетки в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую кислородом ACSF и ждать пять-семь минут для клеток постепенно оседают. Наблюдайте за сигналом GFP и RFP под микроскопом вскрытия. Определите мусор, изучая морфологию при ярко-полевом освещении.После того, как область клеток с небольшим количеством мусора была определена, использовать капилляры и прикрепить к трубам, чтобы забрать клетки, блокируя конец трубного клапана с языком. Затем распоить капилляр близко к клеткам. Отпустите блок на капилляре и быстро заблокив снова, чтобы захватить ячейку с помощью капиллярного действия.Переместите капилляр в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим кислородом ACSF и осторожно удар в трубку, наблюдая капиллярный кончик под флуоресцентной оптикой, чтобы обойтись клетки в блюдо. Повторите процедуру сбора до тех пор, пока не будут собраны от 100 до 150 ячеек, чтобы убедиться, что загрязняющие вещества, такие как мусор, минимальны в ярко-полевой дифференциальной интерференционной контрастной оптике. Наконец, используя свежий микро-капиллярный пипетку каждый раз, выберите одну ячейку и изгнать его в не более чем 0,5 микролитров в 0,2 микролитера микро-фуге трубки, содержащей один микролитер буфера сбора образцов с грунтовки.Разбей наконечник пипетки в микро-фуге-трубке, чтобы убедиться, что ячейка остается в буфере сбора. Заморозить клетки, поставив трубки на сухой лед. Хранить в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию до обработки для усиления РНК.ГАМК-нейроны были выделены из коры цигулета мозга мыши. РНК усиливается из вручную отсортированы нейроны варьировались от 200 до 4000 базовых пар в размере с пиковым распределением чуть выше 500 базовых пар. После очистки бисера библиотека cDNA еще больше ограничена вторым раундом очистки с использованием бисера для устранения фрагментов менее чем 200 базовых пар и для пика примерно в 350 базовых парах.Секвенирование показало 4,8 раза от 10 до 5-й медианы или 6,9 раза от 10 до 5-го усредненного картографических считывания на ячейку. После дублирования удаления РНК с использованием UMIs, каждая ячейка имела 1,0 раза от 10 до 5-й медианы или 1,4 раза от 10 до 5-го среднего уникального чтения на ячейку. В консорциуме внешних РНК-элементов каждой клетки всплеск РНК использовался в качестве внутреннего контроля для расчета абсолютного количества молекул, добавленных в образец.Наблюдалась линейная взаимосвязь входных данных с наблюдаемыми отсчетами со склоном 0,92 и скорректированным квадратом R 0,94. В среднем с помощью этой процедуры было обнаружено около 10 000 генов на одного нейрона, при этом более 95% одиночных клеток обнаружили более 6000 генов. После своего развития, этот метод проложил путь для молекулярных биологов, чтобы исследовать транскриптом различных хорошо охарактеризованных мыши корковых интернейронов, и определили отдельные категории генов, которые отвечают за кодирование клеточной идентичности.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Профилирование напряжения закрытого калия Выражение мРНК канала в Nigral Нейроны использованием Одноклеточный-ПЦР методов

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Одноклеточная РНК-Seq определенных подмножеств клеток сетчатки ганглия

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Определение фактора транскрипции Olig2 геномной привязки сайтов в остро очищенный PDGFRα + клеток по иммунопреципитации Chromatin Low клеточной последовательности анализа

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...