Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH (5R01MH094705-04 y R01MH109665-01 a Z.J.H.), por el CSHL Robertson Neurociencia fondo (Z.J.H.) y por una beca Post-Doctoral de NARSAD (a A.P.).

Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por la IACUC en laboratorio de Puerto primavera fría, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manual de clasificación de las neuronas de ratón fluorescente etiquetado
<ol><li>Tirar vidrio microcapilares (véase Tabla de materiales) a 10-15 μm de diámetro salida utilizando un extractor capilar con los siguientes ajustes: calor: 508, tirar: en blanco, vel: tiempo en blanco,: en blanco.</li>
	<li>Fije el conducto flexi...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

El manual de clasificación de protocolo es adecuado para una secuencia de RNA supervisada de neurona las poblaciones que son escasamente marcados en el cerebro de ratones o representan a una población de células raras que de lo contrario no es factible estudiar con células de alto rendimiento actual métodos de selección y amplificación. Las células sometidas a FACS generalmente se someten a las presiones de línea de vaina y muestra en la gama de ~ 9 – 14 psi, dependiendo del tamaño de la boquilla y deseado de...

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular ha transformado estudios transcriptómico. Mientras que a gran escala unicelular RNAseq puede realizarse usando una variedad de técnicas, como gotitas1,2, microfluídica3, nanogrids4y5de los micropocillos, mayoría de los métodos no puede ordenar tipos celulares definidas expresan fluoróforos genéticamente codificados. Para aislar a una población selecta de la célula, célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación es de uso frecuente para clasificar las células etiquetadas en el modo de una sola célula. Sin embargo, FACS tiene algunas restricciones y requiere de etapas de procesamiento de una muestra. En primer lugar, un gran número de células de entrada es típicamente necesarios (a menudo varios millones células / mL), con una fracción significativa (> 15-20%) que contiene la población marcada. En segundo lugar, preparaciones celulares pueden requerir múltiples rondas de pasos de centrifugación del gradiente de densidad para eliminar la fracción glial, escombros y montones de celulares que de lo contrario podrían obstruir la boquilla o flujo de la célula. En tercer lugar, FACS generalmente emplea la coloración y los pasos para live/dead tinción (por ejemplo, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), yoduro de propidio (PI) y colorantes de Cytotracker), que toman más tiempo de extracción. En cuarto lugar, como regla general para la clasificación (como DAPI y proteína fluorescente verde y rojo (GFP/RFP)), generalmente dos muestras de dos colores y un control son necesarios, que requieren una muestra sin etiqueta para ser procesados además de la cepa de ratón deseado. En quinto lugar, filtrado a menudo se realiza varias veces antes y durante la clasificación de la muestra para evitar proactivamente obstruido muestra líneas en una máquina de FACS. En sexto lugar, debe asignarse tiempo en configuraciones de FACS más comúnmente utilizadas para inicializar y estabilizar el flujo y realizar la calibración de la gota. Séptimo, control de muestras normalmente se ejecutan en secuencia antes de la colección de la muestra real para configurar matrices de compensación, rechazo de doblete, puertas, etc. usuarios o realice los pasos seis y siete se antes de tiempo o requieren la asistencia de un técnico en paralelo. Por último, post-FACS, hay a menudo medidas para asegurar que sólo con la etiqueta solo las células están presentes en cada pozo; por ejemplo, revisando las muestras en una instalación de proyección de alto contenido como un toner de la placa rápida.
Para eludir los pasos descritos arriba y facilitar una relativamente rápida, dirigida la secuencia de una población pequeña de neuronas fluorescencia etiquetadas sola, describimos un manual de clasificación procedimiento seguido por dos rondas de una alta sensibilidad in vitro Protocolo de amplificación, llamado doble transcripción de in vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq). La generación de biblioteca de cDNA y amplificación de RNA está adaptada de Eberwine et al. 6 y Hashimshony et al. 7, con algunas modificaciones para todos los interneurons de ratón que tienen volúmenes celulares más pequeños; Además, también hemos encontrado que es igualmente útil para neuronas piramidales excitatorias.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular es ahora una herramienta ampliamente implementada para análisis de expresión génica. Disponible en el mercado plataformas de secuenciación del RNA unicelular procesan todo entradas células indiscriminadamente. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación se utiliza a veces, contra la corriente para aislar a una población específicamente etiquetada de interés. Una limitación de FACS es la necesidad de un número elevado de células entradas con fracciones significativamente marcadas, que no es práctico para la recogida y perfiles de poblaciones raras o escasamente marcada neurona del cerebro del ratón. Aquí, describimos un método para manualmente recoger escasa fluorescencia etiquetada neuronas solo de recién disociados tejido de cerebro de ratón. Este proceso permite capturar las neuronas solo etiquetados con pureza elevada y posterior integración con un protocolo en vitro amplificación basada en la transcripción que conserva relaciones de transcripción endógena. Se describe un método de doble amplificación lineal que utiliza identificadores de molécula única (UMIs) para generar cuentas de ARNm individuales. Dos rondas de los resultados de amplificación en un alto grado de detección de genes por célula.

Utilizando el protocolo descrito, GABAergic neuronas fueron manualmente ordenadas (figura 1) y RNA fue amplificado, hecho en una biblioteca de cDNA (figura 2) y secuenciado en profundidad8. Los productos amplificados de RNA (aRNA) oscilaron entre 200 – 4.000 bp en tamaño, con una distribución de pico ligeramente por encima de 500 bp (Figura 3A). La biblioteca de cDNA de gr...

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Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Este protocolo describe el manual de clasificación procedimiento para aislar neuronas fluorescencia etiquetadas solo seguidas en vitro basada en la transcripción ARNm amplificación de la secuencia de RNA de alta profundidad unicelular.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Este método puede ayudar a resolver un obstáculo clave en el campo del aislamiento y la secuenciación de una sola neurona. Como la recolección de población específica o una subpoblación de neuronas etiquetadas fluorescentemente de área cerebral definida por el usuario. La principal ventaja de esta técnica es que asegura que la única neurona de interés se captura sin contaminar los escombros.También es relativamente suave, que es importante para los tipos de neuronas frágiles que mueren rápidamente cuando se someten a las presiones de fluidos de la clasificación convencional de FACS. Comience preparando microcapillarios de vidrio tirado con un diámetro de salida de 10 a 15 micras utilizando un tirador capilar. Utilice tijeras finas para cortar la punta del capilar para obtener el diámetro de placa deseado.A continuación, utilice conectores de tubería para conectar un tubo de silicona flexible de 120 a 150 centímetros de longitud con un diámetro interior de 0,8 milímetros a un filtro de jeringa de membrana PVDF de 0,2 micras y una válvula de tubo bidireccional. Preparar 500 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerado o ACSF y oxigenar burbujeando 5%dióxido de carbono equilibrado a través de una Airstone durante 15 minutos o hasta que la solución se despeje por completo. Prepare tres vasos de 150 mililitros cada uno que contengan 100 mililitros de ACSF.A uno, agregue un cóctel de bloqueadores de actividad. A otro, añadir la fracción de Streptococcus para la proteasa a una concentración final de un miligramo por mililitro. Al vaso final, añadir FBS a una concentración final de 1%y oxigenar con 5% de oxígeno equilibrado de dióxido de carbono a través de una piedra de aire.Por último, haga tres pipetas Pasteur de tallo largo con diámetros de salida decrecientes enrollándolas sobre una llama abierta. Disecciona el cerebro de un ratón eutanasia abriendo el cráneo con una pequeña tijera y extrayendo el cerebro fresco usando fórceps finos sin dañar la corteza. Coloque el cerebro en ACSF refrigerado y oxigenado dejando un Airstone unido a 5% de oxígeno equilibrado con dióxido de carbono durante toda la duración de la seccionamiento.Coloque el cerebro en el mandril del vibratome y corte las secciones coronales o sagitales con un grosor de 300 micras. Recopile tantas secciones como sea necesario para obtener un mínimo de 10 a 50 celdas etiquetadas. Coloque las rodajas en un soporte de rodajas de malla de algodón colocado dentro de un vaso de precipitados para que se bañen en ACSF oxigenado.Mueva las rodajas en el vaso de precipitados que contiene ACSF con bloqueadores de actividad y bloquee durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente mientras burbujea de oxígeno con una Piedra de Aire. Mueva las rodajas al vaso de precipitados que contiene ACSF con la solución proteasa para realizar una digestión leve a temperatura ambiente. Después de la digestión, lavar la proteasa moviendo las rodajas de nuevo al vaso de precipitados que contiene ACSF con solución de bloqueador de actividad durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente.Sigue burbujeando oxígeno. A continuación, prepare un plato Petri de 100 milímetros que contenga ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente y mueva secciones individuales al disco para la microdisección. Bajo un ámbito de disecciones fluorescentes, utilice un par de fórceps finos para microsectar áreas y capas de interés que tengan un mínimo de 10 a 50 celdas.Con una pipeta Pasteur, mueva las piezas microdesinscriptadas a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga aproximadamente 0,8 mililitros de 1%FBS en solución ACSF. Valore el tejido diseccionado en el tubo de microfuge a temperatura ambiente. Realice aproximadamente 10 golpes con cada una de las pipetas Pasteur flameadas comenzando con la más grande y terminando con el diámetro de salida más pequeño.Dispensar las células disociadas en un plato de Petri de 100 milímetros que contenga ACSF oxigenado y esperar de cinco a siete minutos para que las células se asienten gradualmente. Observe la señal GFP y RFP bajo un microscopio de disección. Identifique los escombros examinando la morfología bajo la iluminación de campo brillante.Una vez que se haya identificado un área de células con poco desecho, utilice el capilar y adjúntelo al tubo para recoger las células bloqueando el extremo de la válvula de tubo con la lengua. A continuación, coloque el capilar cerca de las células. Suelte el bloque en el capilar y bloquee rápidamente de nuevo para capturar la célula mediante la acción capilar.Mueva el capilar a un plato petri de 100 milímetros con ACSF fresco oxigenado y sople suavemente en el tubo mientras observa la punta capilar bajo la óptica de fluorescencia para dispensar las células en el plato. Repita el procedimiento de recolección hasta que se recojan entre 100 y 150 células, asegurándose de que los contaminantes, como los desechos, sean mínimos en la óptica de contraste de interferencia diferencial de campo brillante. Por último, utilizando una pipeta micro-capilar fresca cada vez, elija una sola célula y expulse en no más de 0,5 microlitros en un tubo de microfuto de 0,2 microlitros que contenga un microlitro de tampón de recolección de muestras con imprimadores.Romper la punta de la pipeta en el tubo de micro-fuge para asegurarse de que la célula permanece en el búfer de recolección. Congele las células poniendo los tubos sobre hielo seco. Conservar en un congelador de menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento para amplificación de ARN.Las neuronas GABAérgicas fueron aisladas de la corteza cingulet del cerebro del ratón. El ARN amplificado a partir de las neuronas ordenadas manualmente oscilaba entre 200 y 4.000 pares base en tamaño con una distribución máxima ligeramente superior a 500 pares base. Después de la purificación de cuentas, la biblioteca de cDNA es de tamaño adicional restringido por una segunda ronda de purificación utilizando cuentas para eliminar fragmentos de menos de 200 pares base y para el pico en aproximadamente 350 pares base.La secuenciación mostró un 4.8 veces 10 a la 5a mediana o 6.9 por 10 a la 5a lecturas asignadas promediadas por celda. Después de la eliminación duplicada de ARN utilizando IRI, cada celda tenía una media de 1,0 a la 5a mediana o 1,4 veces 10 a la 5a lecturas únicas promedio por celda. En cada consorcio de controles de ARN externo de célula única, se utilizó un pico de ARN como control interno para calcular el número absoluto de moléculas añadidas a la muestra.Hubo una relación lineal de entrada a los recuentos observados con una pendiente de 0,92 y un cuadrado R ajustado de 0,94. Se detectó un promedio de alrededor de 10.000 genes por neurona única utilizando este procedimiento con más del 95% de las células individuales que detectan más de 6.000 genes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los biólogos moleculares exploraran el transcriptoma de claras interneuriones corticales de ratón bien caracterizadas, e identificó categorías genéticas selectas que son responsables de codificar la identidad celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Investigación

Neurociencias

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Perfiles de voltaje de expresión del ARNm de potasio en las neuronas Canal nigral con una sola celda de RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

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La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

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An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

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Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...