Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Detta arbete fick stöd genom bidrag från NIH (5R01MH094705-04 och R01MH109665-01-Z.J.H.), av CSHL Robertson neurovetenskap fonden (till Z.J.H.) och av en publicerade Post-Doctoral Fellowship (att A.P.).

Alla förfaranden inklusive animaliska ämnen har godkänts av IACUC vid kalla Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).
1. manuell sortering av Fluorescently märkt mus nervceller
<ol><li>Dra glas microcapillaries (se Tabell för material) till 10-15 µm exit diameter med hjälp av kapillär avdragare med följande inställningar: värme: 508, pull: Tom, vel: Tom, tid: tomt.</li>
	<li>Tillmäter ett 0,2 µm polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) spruta membranfilter...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Manuell sortering protokoll är lämplig för en övervakad RNA-sekvensering av neuron populationer som antingen glest märkt i möss hjärnan eller företräder en ovanlig cell befolkning som inte annars är möjligt att studera med hjälp av aktuella hög genomströmning cellen sortering och förstärkning metoder. Celler utsätts för FACS vanligtvis genomgå slida och prov linje påtryckningar i spänna av ~ 9 – 14 psi, beroende på munstycke och önskad händelse priser. Dessutom på att matas ut från munstycket ...

Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) har förändrat transcriptomic studier. Medan storskaliga encelliga RNAseq kan utföras med hjälp av olika tekniker, såsom droppar1,2, mikrofluidik3, nanogrids4och mikrobrunnar5, kan inte de flesta metoder sortera definierade celltyper som express genetiskt kodade fluorophores. För att isolera en Markera cell befolkningen, används fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) ofta för att sortera märkta celler i en enskild cell-läge. Dock FACS har vissa begränsningar och kräver noggranna prov bearbetningssteg. Först, ett stort antal indataceller är vanligtvis behövs (ofta flera miljoner celler per mL), med en betydande fraktion (> 15 – 20%) som innehåller märkt befolkningen. Det andra kan cell preparat kräva flera rundor av täthet lutning centrifugering steg ta bort gliaceller bråkdel, skräp och cell klumpar som kanske annars täpper till munstycke eller flöde cellen. För det tredje, FACS vanligtvis sysselsätter färgning och avfärgning steg för live/dead färgning (t.ex. 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI), propidium jodid (PI) och Cytotracker färgämnen), vilket tar ytterligare tid. För det fjärde, som en tumregel för två-färg sortering (såsom DAPI och grön/röd fluorescerande protein (GFP/RFP)), vanligtvis två prov och en kontroll behövs, som kräver en omärkt prov ska behandlas förutom önskad mus stammen. Det femte utförs filtrering ofta flera gånger före och under prov sortering för att proaktivt förhindra tilltäppta prov rader i en FACS maskin. Det sjätte måste tid tilldelas i vanligaste FACS uppställningar att initiera och stabilisera den flytande strömmen och utföra droplet kalibrering. Sjunde, kontroll prover vanligtvis körs i ordning innan den faktiska provtagning att ställa in kompensation matriser, doublet avvisande, grindar, etc. användare antingen Utför steg sex och sju sig före tid eller kräver den assistans av en tekniker parallellt. Slutligen, post-FACS, finns det ofta åtgärder för att säkerställa att endast märkt enstaka celler är närvarande i varje brunn; exempelvis genom att kontrollera prover i en hög-innehåll screening setup såsom en snabb platta imager.
För att kringgå de steg som beskrivs ovan och underlätta en relativt snabb, riktade sekvensering av en liten befolkning av enstaka fluorescently märkt nervceller, beskriver vi en manuell sortering procedur följt av två rundor av en mycket känsliga in vitro förstärkning protocol, kallad dubbel in vitro-transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA amplifiering och cDNA bibliotek generationen är anpassade från Eberwine et al. 6 och Hashimshony o.a. 7, med vissa ändringar som passar musen interneuroner som har mindre cellulära volymer; Dessutom har vi också funnit att det är lika användbara för excitatoriska pyramidal nervceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Encelliga RNA-sekvensering (RNA-seq) är nu ett allmänt genomförda verktyg för testmetoder genuttryck. Kommersiellt tillgängliga encelliga RNA-sekvensering plattformar bearbeta alla indataceller urskillningslöst. Fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) används ibland, uppströms att isolera en specifikt märkt population av intresse. En begränsning av FACS är behovet stort antal indataceller med betydligt märkt fraktioner, som är opraktiskt för insamling och profilering sällsynta eller glest märkt neuron populationer från mus hjärnan. Här, beskriver vi en metod för manuellt samla glesa fluorescently märkt enda nervceller från färska dissocierade mus hjärnvävnad. Denna process möjliggör fånga singel-märkt nervceller med hög renhet och efterföljande integration med ett in vitro- transkription-baserade förstärkning protokoll som bevarar endogena avskrift nyckeltal. Vi beskriver en dubbel linjär förstärkning metod som använder identifierare för unik molekyl (UMIs) för att generera individuella mRNA räknas. Två omgångar av förstärkning resulterar i en hög grad av gen upptäckt per enskild cell.

Med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, GABAergic nervceller var manuellt sorteras (figur 1) och RNA förstärks, då gjordes till cDNA bibliotek (figur 2) och sekvenserade på hög djup8. De förstärkta RNA (aRNA) produkterna varierade mellan 200 – 4 000 bp i storlek, med en topp strax över 500 bp (figur 3A). Bead-renat cDNA biblioteket var ytterligare storlek-begrä...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Single-cell RNA-sekvensering av Fluorescently märkt mus nervceller med manuell sortering och dubbel In Vitro transkription med absolut räknas sekvensering (DIVA-Seq)

Det här protokollet beskriver manuell sortering procedur för att isolera enstaka fluorescently märkt nervceller följt av in vitro- transkription-baserade mRNA förstärkning för hög-djup encelliga RNA-sekvensering.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Denna metod kan bidra till att lösa ett viktigt hinder inom området för single-neuron isolering och sekvensering. Såsom att samla in specifik population eller en subpopulation av fluorescerande märkt neuron från användardefinierade hjärnan område. Den största fördelen med denna teknik är att det säkerställer den enda neuron av intresse fångas utan att förorena skräp.Det är också relativt skonsamt, vilket är viktigt för ömtåliga neurontyper som dör snabbt när de utsätts för vätsketrycket från konventionell FACS-sortering. Börja med att förbereda pulled glass mikrokapillärer med 10 till 15 micron exit diameter med hjälp av en kapillär puller. Använd fin sax för att skära spetsen av kapillären för att få önskad bräda diameter.Använd sedan slangkontakter för att fästa en 120 till 150 centimeter lång längd av flexibla silikonrör med 0,8 millimeters insida diameter till en 0,2 micron PVDF membran spruta filter och en tvåvägs slang ventil. Förbered 500 milliliter kyld konstgjord cerebral spinalvätska eller ACSF och syresätta genom att bubbla 5%koldioxidbalanserat syre genom en Airstone i 15 minuter eller tills lösningen klarnat helt. Förbered tre 150-milliliter bägare vardera innehållande 100 milliliter ACSF.Till en, lägga till en cocktail av aktivitetsblockerare. Till en annan, lägg till Streptococcus fraktion för proteas till en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter. Till den slutliga bägaren, tillsätt FBS till en slutlig koncentration på 1%och syresätta med 5%koldioxidbalanserat syre genom en Airstone.Slutligen, gör tre långskaftade Pasteur pipetter med minskande utgångsdiametrar genom att rulla dem över en öppen låga. Dissekera hjärnan från en avlivad mus genom att öppna kraniet med en liten sax och extrahera den färska hjärnan med hjälp av fina tlyck utan att skada cortex. Placera hjärnan i kyld och syresatt ACSF lämnar en Airstone fäst vid 5%koldioxidbalanserad syre under hela snittningen.Placera hjärnan på vibratome chuck och skär koronal eller sagittal sektioner på 300 mikron tjocklek. Samla in så många sektioner som behövs för att få minst 10 till 50 märkta celler. Lägg skivor på en bomullsmejlad hållare med skiva placerad inuti en bägare så att de badar i syresatt ACSF.Flytta skivorna i bägaren som innehåller ACSF med aktivitetsblockerare och blockera i 15 till 20 minuter i rumstemperatur medan bubblande syre med hjälp av en Airstone. Flytta skivorna till bägaren som innehåller ACSF med proteaslösningen för att utföra mild matsmältning vid rumstemperatur. Efter matsmältningen tvättar du ur proteasen genom att flytta skivorna tillbaka till bägaren som innehåller ACSF med lösning för aktivitetsblockerare i fem till tio minuter i rumstemperatur.Fortsätt bubbla syre. Därefter förbereda en 100-millimeters Petriskål som innehåller ACSF med 1%FBS vid rumstemperatur och flytta enskilda sektioner in i disken för mikrodissektion. Under en fluorescerande dissektioner omfattning, använd ett par fina tlyckor till mikro dissekera områden och lager av intresse med minst 10 till 50 celler.Flytta de mikrosekerade bitarna med hjälp av en Pasteurpipett till ett 2 milliliter mikrocentrifugrör innehållande cirka 0,8 milliliter 1%FBS i ACSF-lösning. Titrera den dissekerade vävnaden i mikro-fuge-röret vid rumstemperatur. Utför ungefär 10 slag med var och en av de flammade Pasteur pipetterna som börjar med den största och slutar med den minsta utgångsdiametern.Fördela de dissocierade cellerna i en 100-millimeters Petriskål som innehåller syresatt ACSF och vänta fem till sju minuter för att cellerna gradvis ska bosätta sig. Observera GFP- och RFP-signalen under ett dissektionmikroskop. Identifiera skräp genom att undersöka morfologin under belysning på ljusa fält.När ett område av celler med lite skräp har identifierats, använd kapillären och fäst vid slangar för att plocka celler genom att blockera änden av slangventilen med tungan. Placera sedan kapillären nära cellerna. Släpp blocket på kapillären och blockera snabbt igen för att fånga cellen med hjälp av kapillärverkan.Flytta kapillären till en 100-millimeters Petriskål med färsk syresatt ACSF och blås försiktigt in i röret samtidigt som du observerar kapillärspetsen under fluorescensoptik för att fördela cellerna i skålen. Upprepa insamlingsförfarandet tills 100 till 150 celler samlas in och se till att föroreningar, såsom skräp, är minimala i skarp-fält differentiell interferens kontrastoptik. Slutligen, med hjälp av en färsk mikro-kapillär pipet varje gång, välj en enda cell och utvisa den i högst 0,5 mikroliter i en 0,2 mikroliter mikro-fuge rör som innehåller en mikroliter av prov-samling buffert med primers.Bryt pipettspetsen i mikro-fuge-röret för att säkerställa att cellen stannar i uppsamlingsbufferten. Frys cellerna genom att sätta rören på torris. Förvaras i en minus 80-graders Frys i Celsius tills bearbetningen för RNA-amplifiering.GABAergic nervceller var isolerade från cingulet cortex av musen hjärnan. RNA förstärks från de manuellt sorterade nervceller varierade mellan 200 till 4, 000 baspar i storlek med en toppfördelning något över 500 baspar. Efter pärlrening är cDNA-biblioteket ytterligare storlek begränsat av en andra omgång rening med hjälp av pärlor för att eliminera fragment mindre än 200 baspar och för toppen på cirka 350 baspar.Sekvensering visade en 4,8 gånger 10 till 5: e median eller 6,9 gånger 10 till den 5: e genomsnitt mappade läsningar per cell. Efter duplicerad RNA borttagning med UMIs, varje enskild cell hade en 1,0 gånger 10 till 5: e median eller 1,4 gånger 10 till 5: e genomsnittliga unika läsningar per cell. I varje enskild cell externt RNA kontroller konsortium, spike i RNA användes som en intern kontroll för att beräkna absoluta antalet molekyler som läggs till provet.det fanns ett linjärt samband av input till observerade räknas med en lutning på 0,92 och justeras R kvadrat av 0,94. I genomsnitt omkring 10, 000 gener per enda neuron upptäcktes med hjälp av detta förfarande med mer än 95% av de enstaka celler upptäcka mer än 6, 000 gener. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för molekylärbiologer att utforska transkriptom av distinkta väl karakteriserade mus när interneuroner, och identifierade utvalda genkategorier som är ansvariga för kodning av den cellulära identiteten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Icke-Laser Capture Mikroskopi metoden för Microdissection diskreta Regioner Mouse Brain för Total RNA Isolering och nedströms nästa generations sekvensering och Gene expression profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Profilering spänningskänsliga Kalium Expression Kanal mRNA i Nigral nervceller med hjälp av encelliga RT-PCR-teknik

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Tillförlitlig identifiering av Living dopaminerga neuroner i mellanhjärnan kulturer Använda RNA sekvensering och TH-promotor-driven EGFP uttryck

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

En-cell-RNA-Seq av definierade deluppsättningar av retinala Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjärnbarriären permeabilitet test på möss med Fluorescently märkt spårämnen

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Att identifiera transkription faktorn Olig2 genomisk bindningsställen i akut renat PDGFRα + celler av låg-cell kromatin Immunoprecipitation sekvensering analys

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Polymeraskedjereaktion i enskild Cell Multiplex omvänd Transkription efter Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolering av vuxna ryggmärgen kärnor för massivt parallella singel-nucleus RNA-sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...