Name: single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Bu eser NIH (5R01MH094705-04 ve R01MH109665-01 Z.J.H. için) gelen hibe, CSHL Robertson Neuroscience fon (Z.J.H.) ve NARSAD bulunan Bursu (için A.P.) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları IACUC soğuk Spring Harbor Laboratuvarı, NY (IACUC #16-13-09-8) tarafından onaylanmıştır.
1. Manuel Fluorescently etiketli fare nöronlar sıralama
<ol><li>(Bkz: Malzemeler tablo) cam microcapillaries 10-15 µm çıkış çapı aşağıdaki ayarlara sahip bir kılcal çektirmenin kullanarak çekin: ısı: 508, çekme: boş, vel: boş, zaman: boş.</li>
	<li>120-150 cm esnek silikon tüp (~0.8 mm iç çapı) 0.2 µm p...

<ol>
	<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells.">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li><li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells.">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer.">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).</li><li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq.">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883 (2016).</li><li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li><li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq:+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification.">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li><li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity.">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li><li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System.">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li><li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics.">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability.">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101 (2016).</li><li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor.">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li></ol>

Sıralama iletişim kuralı el ile de seyrek olan nüfus farelerin beyninde etiketli veya aksi takdirde geçerli yüksek üretilen iş hücre kullanarak çalışma mümkün değildir nadir hücre nüfusu temsil eden nöron bir denetimli RNA sıralama için uygundur sıralama ve güçlendirme yöntemleri. FACS için genellikle tabi hücreler kılıf ve örnek satır baskıların ~ 9 – 14 PSI, meme boyutuna bağlı olarak aralığında geçmesi ve olay oranları istenen. Ayrıca, meme üzerine çıkıp, hücreleri sert y...

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) transcriptomic çalışmalar dönüştürdü. Büyük ölçekli tek hücreli RNAseq damlacıkları1,2, havacilik3, nanogrids4ve microwells5, gibi teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir iken pek çok yöntem tanımlı hücre tipleri sıralama yapamazsınız genetik olarak kodlanmış fluorophores express. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama hücresini seçin popülasyon yalıtmak için sık sık etiketli hücreleri tek hücre modunda sıralama için kullanılır. Ancak, FACS bazı kısıtlamaları vardır ve titiz örnek işlem adımları gerektirir. Birincisi, genellikle çok sayıda giriş hücresi vardır (genellikle milyon başına birkaç hücreleri mL), önemli bir kısmı ile gerekli (> % 15-20) etiketli nüfus içeren. İkinci olarak, hücre hazırlıklar yoğunluk gradient Santrifüjü adımları gliyal kesir, enkaz ve aksi takdirde meme veya akış hücre yapışmasına neden hücre kümeleri kaldırmak için birden fazla mermi gerektirebilir. Üçüncü olarak, FACS genellikle boyama ve adımları Canlı/Boyama (Örneğin, ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iyodür (PI) ve Cytotracker boyalar), hangi ek sefer ölüme destaining kullanır. Dördüncü olarak, kural iki renkli sıralama (örneğin, DAPI ve yeşil/kırmızı floresan protein (GFP/RFP)), genellikle iki örnek ve bir denetim için gerekli gibi istenen fare zorlanma ek olarak işlenecek şekilde etiketlenmemiş bir örnek gerektiren. Beşinci olarak, süzme genellikle birden çok kez önce ve proaktif bir FACS makine tıkanmış örnek satırları önlemek için örnek sıralama sırasında gerçekleştirilir. Altıncı, zamanı başlatmak ve sıvı akışını dengelemek ve damlacık kalibrasyon gerçekleştirmek için en sık kullanılan FACS kurulumları ayrılmış gerekir. Yedinci, denetimi örnekleri genellikle gerçek örnek toplama kadar tazminat matrisler, kütleye ret ayarla, altı ve yedi kendilerini vaktinden adımları gates, vb kullanıcılar da ayarlama veya gerektirir için önce sırayla çalıştırma paralel bir teknisyeni yardımıyla. Son olarak, post-FACS, çoğu zaman sadece tek etiketli hücreleri her kuyuya; bulunduğundan emin olmak için adımlar Örneğin, bir yüksek-içerik tarama kurulum hızlı plaka Imager gibi örnekleri kontrol ederek.
Biz son derece hassas içinde vitro iki tur tarafından takip yordam sıralama a elle yapılan tarif yukarıda özetlenen adımları engelleyecek ve nispeten hızlı, tek fluorescently etiketli nöronlar, küçük bir nüfusa sıralama hedef kolaylaştırmak Çift In vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama adlı amplifikasyon protokolü. RNA amplifikasyon ve cDNA Kütüphanesi nesil Eberwine vd adapte olmuşlardır 6 ve Hashimshony vd. 7, küçük hücresel birimleri var fare interneurons uygun bazı değişiklikler ile; Ayrıca, aynı zamanda eşit eksitatör piramidal nöronların için yararlı olduğunu bulduk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:895px;" width="893">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:344px;">Cat# 4456740</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SuperScript III</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 18080093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# 10777019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA fragmentation buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# E6105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">RNA MinElute kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Cat# 74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Antarctic phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Poly nucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">T4 RNA ligase2, truncated</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>Cat# M0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ampure Xp magnetic&#160; beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Cat# A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">SPRIselect size selection magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# B23317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DL-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 0105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">CNQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">TTX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>Cat# 1078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Protease from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Message Amp II kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat# AM1751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Carbogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Cat# UN3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Illumina TrueSeq smallRNA kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>Cat# RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer RNA Pico chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Cat# 5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.&#160; (Leica model MZ-16F).</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model MZ-16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:261px;">Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>Model GC100-15, Order# 30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Capillary pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:261px;">Vibratome</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Microm</td>
			<td>HM 650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome tissue cooling unit</td>
			<td>Thermo Microm</td>
			<td>CU 65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell rna sequencing of fluorescently labeled mouse neurons using manual sorting and double in vitro transcription with absolute counts sequencing (diva-seq)

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) şimdi gen ekspresyonu raporlaması için yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Piyasada bulunan tek hücreli RNA-sıralama platformlar ayrım gözetmeksizin tüm giriş hücresi işlemek. Bazen, floresans aktif hücre (FACS) sıralama akıntıya karşı faiz özel olarak etiketlenmiş bir nüfusa izole etmek için kullanılır. Bir FACS önemli ölçüde etiketli kesirli sayıları, giriş hücresi sayısının fazlalığı için ihtiyaç hangi toplamak ve nadir veya seyrek etiketli nöron popülasyonları--dan fare beyin profil oluşturma zordur kısıtlamasıdır. Burada, el ile fluorescently tek neurons taze etiketli seyrek toplama fare beyin dokusu ayrışmış için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlem için esir alma tek etiketli nöronlar yüksek saflıkta ve endojen transkript oranları korur bir vitro amplifikasyon transkripsiyon tabanlı iletişim kuralı ile sonraki entegrasyon sağlar. Biz bireysel mRNA sayar oluşturmak için benzersiz molekül tanımlayıcıları (UMIs) kullanan bir çift doğrusal amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Yüksek derecede gen algılama tek hücre başına amplifikasyon sonuçlarında iki mermi.

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, GABAergic nöronlar el ile edildi (Şekil 1) sıralanmış ve RNA güçlendirilmiş sonra cDNA Kütüphanesi (Şekil 2) yaptım.. yüksek derinliği8' de sıralı. Güçlendirilmiş RNA (aRNA) ürünleri değişmekteydi arasında 200 – 4000 bp boyutunda bir tepe dağıtım biraz üzerinde 500 ile bp (Şekil 3A). Boncuk s...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Bu iletişim kuralı vitro transkripsiyon tabanlı mRNA amplifikasyon yüksek-derinlik tek hücreli RNA sıralama için ardından tek fluorescently etiketli nöronların izole etmek için yordam sıralama kılavuzu açıklanır.

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Bu yöntem, tek nöron izolasyon u ve sıralama alanında önemli bir engeli çözmeye yardımcı olabilir. Örneğin, kullanıcı tanımlı beyin bölgesinden belirli bir popülasyon veya floresan olarak etiketlenmiş nöron alt popülasyonu toplamak gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek bir nöronun enkazları kirletmeden yakalanmasını sağlamasıdır.Aynı zamanda nispeten nazik, hangi hızlı bir şekilde geleneksel FACS sıralama sıvı basınçlarına tabi ölmek kırılgan nöron tipleri için önemlidir. Kılcal bir çekmece kullanarak 10 ila 15 mikron çıkış çapı ile çekilmiş cam mikrokapiller hazırlayarak başlayın. İstenilen tahta çapı elde etmek için kılcal ucu kesmek için ince makas kullanın.Daha sonra 0,8 milimetre iç çapı 0,8 milimetre lik esnek silikon borunun 120 ila 150 santimetre uzunluğundaki kısmını 0,2 mikron PVDF membran şırınga filtresine ve iki yönlü boru vanasına takmak için boru konektörlerini kullanın. 500 mililitre soğutulmuş yapay serebral spinal sıvı veya ACSF hazırlayın ve bir Airstone ile %5 karbondioksit dengeli oksijen köpürerek 15 dakika veya çözelti tamamen temizlenene kadar oksijen. Her biri 100 mililitre ACSF içeren üç adet 150 mililitrelik gaga hazırlayın.Bir, aktivite engelleyicileri bir kokteyl ekleyin. Başka bir, mililitre başına bir miligram son konsantrasyonproteaz için Streptococcus fraksiyonu ekleyin. Son kabın için, % 1'lik son konsantrasyona FBS ekleyin ve bir Hava Taşı aracılığıyla %5 karbondioksit dengeli oksijenle oksijenlendirin.Son olarak, üç uzun saplı Pasteur pipetler azalan çıkış çapları ile açık bir alev üzerinde haddeleme olun. Kafatasını küçük bir makasla açarak ve kortekse zarar vermeden ince keler kullanarak taze beyni çıkararak ötenazili bir fareden beyni ayırın. Kesit boyunca %5 karbondioksit dengeli oksijene bağlı bir Hava Taşı bırakarak beyni soğutulmuş ve oksijenli ACSF'ye yerleştirin.Vibratom chuck beyin konumlandırın ve 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal kesitler kesti. En az 10 ila 50 etiketli hücre elde etmek için gerektiği kadar kesit toplayın. Bir kabın içine yerleştirilen pamuklu dilim tutucuya dilimler koyun, böylece oksijenli ACSF ile yıkanabilirler.Bir Hava Taşı kullanarak oksijen köpürtme sırasında aktivite engelleyicileri ile ACSF içeren beher içine dilimleri taşıyın ve oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika blok. Oda sıcaklığında hafif sindirim gerçekleştirmek için proteaz çözeltisi ile ACSF içeren beher için dilimleri taşıyın. Sindirimi takiben, oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika boyunca aktivite engelleyici çözeltisi ile ACSF içeren kabına geri dilimler taşıyarak proteaz yıkayın.Oksijen köpürmeye devam et. Daha sonra, oda sıcaklığında %1 FBS ile ACSF içeren 100 milimetrelik bir Petri kabı hazırlayın ve mikrodiseksiyon için tek tek bölümleri diske taşıyın. Floresan diseksiyonlar kapsamında, en az 10 ila 50 hücreye sahip alanları ve ilgi katmanlarını mikro parçalara ayırmak için bir çift ince çiş kullanın.Pasteur pipeti kullanarak, mikro-diseksiyon lu parçaları ACSF çözeltisinde yaklaşık 0,8 mililitre lik 1 FBS içeren 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Oda sıcaklığında mikro-fuge tüpünde parçalanmış dokuyu titre. En büyük ve en küçük çıkış çapı ile biten yanan Pasteur pipetlerin her biri ile yaklaşık 10 vuruş gerçekleştirin.Ayrık hücreleri oksijenli ACSF içeren 100 milimetrelik petri kabına dağıtın ve hücrelerin yavaş yavaş yerleşmesi için beş ila yedi dakika bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında GFP ve RFP sinyalini gözlemleyin. Parlak alan aydınlatması altında morfolojiince enkaz tanımlayın.Az enkaz ile hücrelerin bir alan tespit edildikten sonra, kılcal kullanın ve dil ile tüp vana sının ucunu engelleyerek hücreleri almak için tüp eklemek. Daha sonra kılcal damarı hücrelere yakın konumlandırın. Kılcal damar üzerindeki bloğu serbest bırakın ve kılcal etki kullanarak hücreyi yakalamak için hızlı bir şekilde tekrar bloke edin.Taze oksijenli ACSF ile 100 milimetrelik Petri kabına kılcal damarı taşıyın ve hücreleri çanağa dağıtmak için floresan optik altında kılcal ucu gözlemlerken yavaşça tüpiçine üfler. Toplama işlemini 100 ila 150 hücre toplanana kadar tekrarlayın ve enkaz gibi kirleticimaddelerin parlak alan diferansiyel girişim kontrast optiklerinde minimum olduğundan emin olun. Son olarak, her seferinde taze bir mikro kılcal pipet kullanarak, tek bir hücre seçin ve en fazla 0,5 mikrolitre içinde bir mikrolitre örnek toplama tampon bir mikrolitre içeren bir mikrolitre astar içeren mikro-fuge tüp içine dışarı.Hücrenin toplama tamponunda kaldığından emin olmak için pipet ucunu mikro-fuge tüpünde kırın. Tüpleri kuru buzüzerine koyarak hücreleri dondurun. RNA amplifikasyon için işleme kadar eksi 80 derece santigrat derecelik dondurucuda saklayın.GABAerjik nöronlar fare beyninin cingulet korteksinden izole edildi. Elle sıralanmış nöronlardan güçlendirilen RNA, 200 ile 4 arasında değişmekteve 500 baz çiftinin biraz üzerinde bir tepe dağılımı ile boyut olarak 000 baz çifti olarak değişmektedir. Boncuk arınması ndan sonra, cDNA kütüphanesi, 200 baz çiftinden daha az olan parçaları ortadan kaldırmak için boncuklar kullanılarak ikinci bir arınma turu ile ve yaklaşık 350 baz çiftinin zirvesine kadar sınırlandırılmıştır.Sıralama, hücre başına ortalama haritalanmış okumasayısının ortalamasıolan 5'e 4,8 çarpı 10 veya 5'inci ortancaya 6,9 çarpı 10 gösterdi. UMI'ler kullanılarak yinelenen RNA kaldırma işleminden sonra, her bir hücrede 1,0 çarpı 10 ile 5.ortanca veya 1.4 çarpı 10 hücre başına ortalama benzersiz okuma vardı. Her bir hücre dış RNA kontrol konsorsiyumunda, numuneye eklenen moleküllerin mutlak sayısını hesaplamak için RNA'daki ani artış iç kontrol olarak kullanılmıştır.0.92 eğimi ve 0.94'lük ayarlanmış R karesi ile gözlemlenen sayımlarla doğrusal bir girdi ilişkisi vardı. Tek bir nöron başına ortalama 10.000 gen, 6.000'den fazla geni tespit eden tek hücrelerin %95'inden fazlası ile bu prosedür kullanılarak tespit edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra moleküler biyologların farklı iyi karakterize li fare kortikal internöronlarının transkripsiyonu keşfetmelerinin önünü açmış ve hücresel kimliğin kodlanmasından sorumlu belirli gen kategorilerini belirlemİştir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Transkripsiyon faktörü Olig2 genomik bağlayıcı siteleri içinde akut tanımlayan PDGFRα + hücreleri tarafından analiz sıralama düşük hücreli Kromatin Immunoprecipitation saf

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...