Name: quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00
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Diese Arbeit wurde großzügig unterstützt von 1R21AI129881-01 (bis T.M.C), Start-up-Mittel aus den nationalen Emerging ansteckende Krankheiten Laboratorien und der Boston University School of Medicine.

Serumproben, die in dieser Studie verwendet wurden von menschlichen Teilnehmern einer Kohorte von Columbia erhalten. Sample-Sammlung wurde von der internen Review Board (IRB) Universidad de Pamplona (Kolumbien, Südamerika) und Los Potios Hospital8genehmigt. Die Proben wurden anonym und Ermittler hatten keinen Zugang zu Patientendaten. Die Serumproben wurden für die DENV Serotyp überprüft. Die Proben wurden weitere DENV Infektion neutralisieren bestätigt in-vitro-. Zur Kontrolle wurde...

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Kreuzreaktivität von DENV Antikörpern führt zu ADE von anderen Serotypen DENV hat die Entwicklung eines wirksamen Impfstoff11behindert. ZIKV gehört zu der gleichen Familie Flaviviridae, und hat eine beträchtliche Homologie mit anderen Flaviviren, vor allem DENV12. Das Hauptziel von neutralisierenden Antikörpern für ZIKV und DENV ist das Hüllprotein, das eine sehr hohe strukturelle und quartären Sequenzhomologie zwischen den zwei Viren13...

Unter den Mücken übertragenen Viruserkrankungen gehört Zika Infektion klinisch wichtig1. Die Infektion wird durch die Flavivirus ZIKV verursacht, die in den meisten Fällen, Aedes Aegypti als seine primäre Vektor1,2nutzt. Allerdings gibt es Studien, die als primäre Vektor in einigen ZIKV Ausbrüche3 Aedes Albopictus gemeldet haben. Obwohl die Infektion in vielen Fällen symptomlos, sind die häufigsten Symptome Fieber, Kopfschmerzen und Muskel-Schmerz-2. Es gibt keine Behandlung oder Impfung zur ZIKV Infektion und die Behandlung ist meist unterstützend. Den jüngsten Ausbrüchen von ZIKV in Südamerika führte zu schweren Fällen der Krankheit und ca. 20-fold Zunahme der Neurodevelopmental Störung bei Feten Mikrozephalie2benannt. Da Südamerika eine Fläche in mehrere Arboviren wie DENV und West-Nil-Virus endemisch ist, ist es wichtig zu untersuchen, ob vorherige Immunität gegen andere flavivirus(es) eine Rolle in der Schwere der ZIKV Infektionen und Krankheiten spielt.
Im Laufe der Jahrhunderte haben Viren entwickelt verschiedene Strategien um ihre Chance auf Infektiosität um Host Cell Maschinen übernehmen und unterdrücken die antivirale Reaktion zu erhöhen. Eines der faszinierendsten von allen ist die Verwendung der Host vor Immunsystem Antikörper durch Viren, die Replikation mit dem Phänomen ADE4zu verbessern. ADE über alle vier Serotypen DENV wurde auch untersucht und nachgewiesen, virale Titer und Krankheit Ergebnis5,6,7zu erhöhen. In einer früheren in-vitro-Studie haben wir erhebliche Verbesserung der ZIKV Replikation durch Vorerkrankungen DENV Immunität in primären menschlichen Immunzellen8gezeigt. Wir haben auch gezeigt, dass eine entsprechende in-vitro-Methode um die Fähigkeit der DENV bereits vorhandene Antikörper, ZIKV Replikation in Primärzellen verbessern zu quantifizieren.
Das Protokoll, das wir entwickelt haben verwendet menschliches Serum-Proben, die geprüft werden DENV Neutralisation TCID / 50 oder Plaque Reduktion Neutralisation Test (PRNT) assays, zusammen mit ZIKV in biologisch relevanten Zellen oder Zellen aus Geweben, die ZIKV zu infizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:119px;">GEMINI</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">iCycler&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">785BR02188</td>
			<td>Model No. CFX96 Optics Module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microfuge 18 Centrifuge</td>
			<td style="width:119px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanodrop-1000</td>
			<td style="width:119px;">Thermoscientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">204154</td>
			<td>Used for 1 step RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RNeasy RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RPMI-medium&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells

Die jüngste Entstehung der Flavivirus Zika und neurologischen Komplikationen, wie z. B. Guillain-Barré-Syndrom und Mikrozephalie bei Säuglingen, brachte schwere öffentliche Sicherheitsbedenken. Unter den Risikofaktoren ist Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE) die bedeutendste Gefahr wie der jüngsten Wiederauftauchen der Zika-Virus (ZIKV) vor allem in Bereichen, ist wo die Bevölkerung ausgesetzt war und ist in einem Zustand der Pre-Immunität gegen andere nahestehende Flaviviren, vor allem Dengue-Virus (DENV). Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Wirkung von humanem Serum Antikörper gegen DENV auf ZIKV Infektion in primären humanen Zellen oder Zell-Linien.

In Abbildung 1gibt es eine Schritt für Schritt schematische Darstellung der alle Schritte zur Durchführung der ADE-Protokoll. Es ist eine schematische Darstellung zeigt die ganze Prozedur von ADE ZIKV durch bereits vorhandene Immunität zu DENV. Abbildung 2 zeigt, wie menschliches Serum Proben wurden in drei verschiedene Gruppen kategorisiert: DENV-Infektion bestätigt Proben werden als die DENV-infizierten Gruppe bezeichnet, D...

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Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Diese Methode kann verwendet werden, um die Auswirkungen der bereits bestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf Zika-Virus-Infektion zu bewerten, mit tatsächlichen menschlichen Patienten serum und primäre menschliche Immunzellen. Die Verwendung von tatsächlichen menschlichen Patientenserumproben und menschlichen Primärzellen bietet tiefere Einblicke in die Antikörperabhängige Verbesserung des Zika-Virus durch präimmunistische Seren und Antikörper. Diese Methode bietet Einblick in die Fähigkeit von Antikörpern im Blut eines Patienten, eine Virusinfektion in anderen menschlichen Zellen zu verbessern.Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Virusinfektionsniveaus hoch genug für die Erkennung sind, aber niedrig genug, um die Zellen nicht zu überwältigen oder die Dateninterpretation zu stören. Beginnen Sie mit der Aussaat dreimal zehn bis vier Zellen in 100 Mikroliter Zellkultur Medium pro Brunnen in einer sterilen, flachen unteren 96-Well-Platte. Wenn alle Zellen plattiert sind, legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator und machen 10-fache serielle Verdünnungen von aufgetauten menschlichen Serumproben in Serum-freien Medium.Achten Sie darauf, die Serumverdünnungen und Verdünnungsfaktor für alle präimmunen Seren konstant zu halten, bevor Sie die Verdünnungen zu den Viruslösungen und den Zellen hinzufügen. Als nächstes belastet das Tauwetter das Zika-Virus die Stammlösung in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für ein bis zwei Minuten, bevor der Bestand schnell auf Eis übertragen wird. Fügen Sie dem Serum aliquots eine 0,1-Multiplikation des Infektionsäquivalents des Zika-Virus hinzu und legen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator, damit die Dengue-Virus-Antikörper komplexe Komplexe mit den Zika-Virionen bilden können.Am Ende der Inkubation die Zellen mit 100 Mikroliter PBS pro Brunnen waschen und jeweils 50 Mikroliter Immunkomplex zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach der zweistündigen Inkubation das Medium entfernen und die Brunnen zweimal mit 100 MikroliterPBS pro Brunnen waschen, um die Immunkomplexe und alle ungebundenen Virionen vollständig zu entfernen. Dann füttern Sie die Zellen mit 100 Mikroliter pro Brunnen der Zellkultur Medium ergänzt mit 10%fetalen Rinderserum.Dann geben Sie die Zellen für 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Zwei Tage nach der Infektion, waschen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikroliter sterilen PBS pro Brunnen, bevor Sie 250 Mikroliter Zelllysepuffer mit 10%beta Mercaptoethanol zu jedem Brunnen hinzufügen. Pipette mindestens fünfmal mit Kratzern nach oben und unten, um den Lyseprozess zu beschleunigen und die Zelllysate in sterile, beschriftete 1,5-Milliliter-Rohre zu übertragen.Fügen Sie jedem Rohr und jeder Pipette ein gleiches Volumen von 70% Ethanol hinzu und geben Sie die Lysatlösung vier- bis fünfmal nach oben und unten. Wenn die Lysatsuspensionen klar sind, übertragen Sie jede Lösung in beschriftete Kieselsäuresäulen in zwei Milliliter-Sammelrohren für die Zentrifugation. Entsorgen Sie den Durchfluss, bei dem die Spalten in den gleichen Sammelrohren gehalten werden, und fügen Sie 700 Mikroliter Waschpuffer 1 zu jeder Spalte für eine zweite Zentrifugation hinzu.Nach dem Wegwerfen des Durchflusses spülen Sie die Säulen noch zwei Mal mit 500 Mikroliter Waschpuffer zwei pro Wäsche ab. Nach der zweiten Wäsche die Säulen für eine weitere Zentrifugation in neue Zwei-Milliliter-Sammelrohre übertragen. Fügen Sie 30 Mikroliter 42 Grad Celsius RNasefreies Wasser in die Mitte jeder Säule für die Zentrifugation und die eluierte RNA wieder.Für quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion oder QRTPCR-Analyse fügen Sie einen Mikroliter genspezifischer Vorwärts- und Reverse-Primer aus 10 Mikromolaren-Beständen zusammen mit 0,25 Mikroliter Reverse-Transkriptase-Mix pro Reaktion hinzu. Beachten Sie, dass Primer, die genetisches Material des Zika-Virus erkennen, virale Gene erkennen und eine Infektionsquantifizierung ermöglichen. Als nächstes fügen Sie 12,5 Mikroliter SYBR Green Mix hinzu, gefolgt von 25 Mikroliter Wasser zu jeder Reaktion, die 15 Mikroliter Master Mix in jedem Brunnen der 96-Well-QPCR-Platte hinzufügt.Wenn Sie einen Master Mix verwenden, fügen Sie 100 Nanogramm der RNA-Probe in die Mischung ein und pipetteden Sie den Master Mix in einzelne Brunnen der QRTPCR-Platte. Beachten Sie, dass Proben in dreifacher Ausführung auf derselben QRTPCR-Platte ausgeführt werden sollten. Führen Sie dann die Proben auf einer quantitativen PCR-Maschine gemäß den in der Tabelle beschriebenen Parametern aus.Klicken Sie in der Systemsoftware auf die Registerkarte Schmelzekurve, um die Schmelzekurve zu überwachen. Die Schmelzekurve zeigt einen einzigen Peak in allen Proben für ein bestimmtes Gen, um das Vorhandensein von nur einem Amplikon zu bestätigen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie 0,5 Grad Celsius Temperaturschritte zwischen den Schritten und eine Mindesthaltezeit von 10 Sekunden im Schmelzkurvenprotokoll.Klicken Sie dann auf die Registerkarte Quantifizierungsdaten, um einen quantitativen Zyklus für jede Stichprobe zu erhalten, und exportieren Sie die Daten zur weiteren Quantifizierungsanalyse in eine Kalkulationstabelle. Die humanen Serumproben können in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden: Dengue-Virus-Infektion bestätigte Proben, Dengue-Virus-Antikörper bestätigte Proben und gesunde Seren ohne Dengue-Virus neutralisierenantikörper oder RNA. Nach 48 Stunden Infektion zeigt die QRTPCR-Analyse, dass die meisten Seren, die Dengue-Virus-Serotyp eins bis vier Antikörper enthalten, in der Lage sind, die Zika-Virusreplikation auf verschiedenen Ebenen zu verbessern.Der höchste Anstieg der Zika-Virus-Titres findet sich in Makrophagen, die mit dem Sera-haltigen Dengue-Virus Serotyp Serotyp zwei und vier Antikörper behandelt werden, verglichen mit Serotyp eins und drei, die eine relativ geringere Induktion des Zika-Virus aufweisen. Es ist wichtig, eine sterile Umgebung zu erhalten, die richtige persönliche Schutzausrüstung zu tragen und die aufgetauten Virusserumproben und QPCR-Reagenzien immer auf Eis zu halten. Dieses Protokoll kann leicht geändert werden, um Antikörper-abhängige Verbesserung anderer Flaviviren wie Gelbfiebervirus, Dengue-Virus oder West-Nil-Virus mit einem Panel von Patientenserum zu untersuchen.Diese Technik wird sehr nützlich für die Durchführung zukünftiger antikörperabhängiger Verbesserungsstudien in den Bereichen Arbovirus oder Virologie sein. Die richtige Biosicherheitsstufe zwei persönliche Schutzausrüstungen sollten jederzeit verwendet werden, und alle viralen Abfälle sollten 30 Minuten vor der Entsorgung in 10 % Bleichmittel dekontaminiert werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...