Name: quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00
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यह काम उदारता से 1R21AI129881-01 (T.M.C.), शुरू से धन राष्ट्रीय उभरते संक्रामक रोगों प्रयोगशालाओं, और बोस्टन चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्कूल द्वारा समर्थित किया गया ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त सीरम नमूने कोलंबिया से एक पलटन के मानव प्रतिभागियों से प्राप्त किया गया । नमूना संग्रह आंतरिक समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा Universidad de पाम्प्लोना (कोलंबिया, दक्षिण अमेरिका) और लॉस Potios ...

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पार देंव एंटीबॉडी के अंय देंव serotypes के ADE के लिए अग्रणी की जेट एक प्रभावी वैक्सीन11के विकास में बाधा है । ZIKV एक ही परिवार के अंतर्गत आता है, Flaviviridae, और अंय flaviviruses के साथ एक काफी समरूपता है, विशेष रूप से<sup class="x...

मच्छरों जनित वायरल रोगों के बीच, Zika संक्रमण सबसे नैदानिक महत्वपूर्ण1में से एक है । संक्रमण flavivirus ZIKV के कारण होता है, जो ज्यादातर मामलों में, एडीज aegypti का प्राथमिक वेक्टर1,2के रूप में उपयोग करता है । हालांकि, वहां अध्ययन है कि कुछ ZIKV प्रकोपों में एक प्राथमिक सदिश के रूप में एडीज albopictus की सूचना दी है3। हालांकि संक्रमण कई मामलों में स्पर्शोन्मुख है, सबसे आम लक्षण बुखार, सिरदर्द, और मांसपेशियों में दर्द2हैं । वहां कोई इलाज या ZIKV संक्रमण के लिए उपलब्ध वैक्सीन और उपचार उपलब्ध है ज्यादातर सहायक है । दक्षिण अमेरिका में ZIKV के हाल के प्रकोप रोग के गंभीर मामलों के लिए नेतृत्व किया और एक लगभग 20 microcephaly2नाम भ्रूण में neurodevelopmental विकार में वृद्धि गुना । के रूप में दक्षिण अमेरिका के एक ऐसे देंव और पश्चिम नील नदी वायरस के रूप में कई arboviruses के लिए स्थानिकमारी वाले क्षेत्र है, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि पहले अंय flavivirus (es) के लिए प्रतिरक्षा ZIKV संक्रमण और रोग की गंभीरता में एक भूमिका निभाता है ।
उम्र के दौरान, वायरस मेजबान सेल मशीनरी पर लेने के लिए और एंटीवायरल प्रतिक्रिया को दबाने के क्रम में infectivity के अपने मौका बढ़ाने के लिए विभिन्न रणनीतियों विकसित किया है. सभी का सबसे आकर्षक में से एक की मेजबानी पूर्व वायरस द्वारा प्रतिरक्षा एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए घटना ADE4के साथ उनकी प्रतिकृति बढ़ाने है । देंव के सभी चार serotypes भर ADE अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है और वायरल titers और रोग के परिणाम को बढ़ाने के लिए प्रदर्शन5,6,7. में एक पिछले इन विट्रो अध्ययन में, हम ZIKV प्रतिकृति प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं8में पूर्व मौजूदा देंव उन्मुक्ति की वजह से महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई है । हम भी प्रदर्शन में एक प्रासंगिक इन विट्रो विधि प्राथमिक कोशिकाओं में ZIKV प्रतिकृति को बढ़ाने के लिए देंव पूर्व मौजूदा एंटीबॉडी की क्षमता यों तो ।
प्रोटोकॉल है कि हम विकसित किया है मानव सीरम नमूने है कि TCID में देंव बेअसर के लिए परीक्षण कर रहे है का उपयोग करता है-५० या पट्टिका कमी बेअसर परीक्षण (PRNT) परख, जैविक रूप से प्रासंगिक कोशिकाओं या कोशिकाओं है कि ZIKV संक्रमित कर सकते है ऊतकों से व्युत्पंन में ZIKV के साथ ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:119px;">GEMINI</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">iCycler&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">785BR02188</td>
			<td>Model No. CFX96 Optics Module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microfuge 18 Centrifuge</td>
			<td style="width:119px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanodrop-1000</td>
			<td style="width:119px;">Thermoscientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">204154</td>
			<td>Used for 1 step RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RNeasy RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RPMI-medium&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells

flavivirus Zika और स्नायविक जटिलताओं के हाल ही में उद्भव, जैसे Guillain-Barré सिंड्रोम और शिशुओं में microcephaly, गंभीर सार्वजनिक सुरक्षा चिंताओं लाया है । जोखिम वाले कारकों में, एंटीबॉडी-निर्भर वृद्धि (ADE) सबसे महत्वपूर्ण खतरा बन गया है, के रूप में हाल ही में पुनः Zika वायरस के उद्भव (ZIKV) मुख्य रूप से क्षेत्रों में जहां जनसंख्या उजागर किया गया है और पूर्व के एक राज्य में है प्रतिरक्षा अंय बारीकी से संबंधित flaviviruses, खासकर डेंगू वायरस (देंव) । यहां, हम प्राथमिक मानव कोशिकाओं या सेल लाइनों में ZIKV संक्रमण पर देंव के खिलाफ मानव सीरम एंटीबॉडी के प्रभाव को बढ़ाता है के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

चित्र 1में, ADE प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए शामिल सभी चरणों का एक चरण दर चरण diagrammatic चित्रण है । यह एक योजनाबद्ध देंव करने के लिए पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति के कारण ZIKV के ADE की पूरी प्रक्रि?...

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Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

हम मानव सीरम, प्राथमिक मानव कोशिकाओं का उपयोग करके Zika वायरस के संक्रमण पर डेंगू वायरस के खिलाफ पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि का वर्णन है, और मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा संक्रमण ठहराव.

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में Zika विषाणु के एंटीबॉडी-आश्रित संवर्धन की ठहराव

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

इस विधि का उपयोग वास्तविक मानव रोगी सीरम और प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग करके जीका वायरस संक्रमण पर डेंगू वायरस के खिलाफ पहले से मौजूद प्रतिरक्षा के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है । वास्तविक मानव रोगी सीरम नमूनों और मानव प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग पूर्व प्रतिरक्षा सेरा और एंटीबॉडी द्वारा Zika वायरस के एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । यह विधि अन्य मानव कोशिकाओं में वायरस संक्रमण को बढ़ाने के लिए रोगी के रक्त के भीतर एंटीबॉडी की क्षमता में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वायरल संक्रमण का स्तर पता लगाने के लिए काफी अधिक है लेकिन कोशिकाओं को डूबने या डेटा व्याख्या में हस्तक्षेप करने के लिए पर्याप्त नहीं है। एक बाँझ, फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली में सेल संस्कृति माध्यम प्रति अच्छी तरह से १०० माइक्रोलीटर में चौथी कोशिकाओं के लिए तीन बार दस बोने से शुरू करो । जब सभी कोशिकाओं को चढ़ाया गया हो, तो प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में रखें और सीरम मुक्त माध्यम में गल गए मानव सीरम नमूनों के 10 गुना सीरियल कमजोर कर दें।वायरस के समाधान और कोशिकाओं को कमजोर करने को जोड़ने से पहले सभी पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के लिए सीरम कमजोर पड़ने और कमजोर पड़ने कारक को स्थिर रखना सुनिश्चित करें। इसके बाद, गल ज़िका वायरस जल्दी से बर्फ के लिए शेयर स्थानांतरित करने से पहले एक से दो मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में शेयर समाधान उपभेदों । सीरम एलिकोट्स में जीका वायरस के संक्रमण समकक्ष मात्रा की ०.१ बहुलता जोड़ें और प्लेट को एक घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें ताकि डेंगू वायरस एंटीबॉडी को जीका विरियंस के साथ कॉम्प्लेक्स बनाने की अनुमति दी जा सके ।इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से धोएं और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिरक्षा परिसर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। दो घंटे इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को हटा दें और प्रतिरक्षा परिसरों और किसी भी असंबद्ध विरेशन को पूरी तरह से हटाने के लिए पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ दो बार कुओं को धोएं। फिर कोशिका संस्कृति माध्यम के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाएं।फिर कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में वापस करें। संक्रमण के दो दिन बाद, कोशिकाओं को 10% बीटा मर्केप्टोथेनॉल के साथ सेल लाइसिस बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले बाँझ पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर के साथ दो बार धोएं। लिसिस प्रक्रिया को गति देने के लिए स्क्रैचिंग के साथ कम से कम पांच बार पिपेट करें और सेल लाइसेट को बाँझ लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।प्रत्येक ट्यूब में 70% इथेनॉल की बराबर मात्रा जोड़ें और चार से पांच बार लिसेट समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें। जब lysate निलंबन स्पष्ट होते हैं, तो प्रत्येक समाधान को अपकेंद्रित्र के लिए दो मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में लेबल सिलिका-आधारित स्तंभों में स्थानांतरित करें। एक ही संग्रह ट्यूबों में कॉलम रखने के माध्यम से प्रवाह को त्यागें और एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए प्रत्येक कॉलम में वॉश बफर 1 के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें।प्रवाह के माध्यम से त्यागने के बाद, प्रति वॉश बफर दो प्रति वॉश बफर के 500 माइक्रोलीटर के साथ दो बार कॉलम कुल्ला। दूसरे धोने के बाद, कॉलम को एक और अपकेंद्रित्र के लिए नए दो मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अपकेंद्रित्र के लिए प्रत्येक कॉलम के केंद्र में 42 डिग्री सेल्सियस RNase-मुक्त पानी के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें और eluted आरएनए को ठीक करें।मात्रात्मक वास्तविक समय पॉलीमरेज चेन रिएक्शन या क्यूआरटीपीसीआर विश्लेषण के लिए 10 माइक्रोमोलर स्टॉक्स से जीन विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें, साथ ही रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज मिक्स प्रति प्रतिक्रिया के 0.25 माइक्रोलीटर के साथ। ध्यान दें कि जीका वायरस आनुवंशिक सामग्री को पहचानने वाले प्राइमर वायरल जीन का पता लगा एंगे और संक्रमण मात्राकरण के लिए अनुमति देंगे । इसके बाद, 12.5 माइक्रोलीटर SYBR ग्रीन मिक्स जोड़ें और इसके बाद प्रत्येक प्रतिक्रिया में 25 माइक्रोलीटर पानी मिलाकर 96-वेल क्यूपीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं में मास्टर मिक्स के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।मास्टर मिक्स का उपयोग करते समय, आरएनए नमूने के 100 नैनोग्राम को मिश्रण में जोड़ें और मास्टर मिक्स को क्यूआरटीपीसीआर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में पिपेट करें। ध्यान रहे कि सैंपल एक ही क्यूआरटीपीसीआर प्लेट पर ट्रिपलीकेट में चलाए जाएं। इसके बाद टेबल में बताए गए मापदंडों के अनुसार मात्रात्मक पीसीआर मशीन पर नमूने चलाएं।पिघल वक्र की निगरानी के लिए सिस्टम सॉफ्टवेयर में पिघल वक्र टैब पर क्लिक करें। पिघल वक्र केवल एक एम्प्लिकॉन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक विशेष जीन के लिए नमूनों के सभी में एक चोटी दिखाएगा । इष्टतम परिणामों के लिए, पिघल वक्र प्रोटोकॉल में चरणों और न्यूनतम होल्डिंग समय 10 सेकंड के बीच 0.5 डिग्री सेल्सियस तापमान वृद्धि का उपयोग करें।फिर प्रत्येक नमूने के लिए मात्रात्मक चक्र प्राप्त करने के लिए क्वांटिफिकेशन डेटा टैब पर क्लिक करें और आगे मात्राकरण विश्लेषण के लिए डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें। मानव सीरम नमूनों को तीन विभिन्न समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: डेंगू वायरस संक्रमण की पुष्टि के नमूने, डेंगू वायरस एंटीबॉडी की पुष्टि के नमूने, और स्वस्थ सेरा जिसमें डेंगू वायरस एंटीबॉडी या आरएनए को बेअसर नहीं कर रहा है । संक्रमण के ४८ घंटे के बाद, QRTPCR विश्लेषण दर्शाता है कि डेंगू वायरस सेरोटाइप एक से चार एंटीबॉडी युक्त अधिकांश सेरा विभिन्न स्तरों पर जीका वायरस प्रतिकृति को बढ़ाने में सक्षम हैं ।जीका वायरस टाइट्रेस में सबसे ज्यादा वृद्धि सेरोटाइप वन और थ्री की तुलना में सेरा युक्त डेंगू वायरस सेरोटाइप दो और चार एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज में पाई जाती है जो जीका वायरस के अपेक्षाकृत कम प्रेरण को दर्शाते हैं । यह एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने के लिए, और हमेशा गल वायरस सीरम नमूने और बर्फ पर QPCR reagents रखने के लिए । इस प्रोटोकॉल को रोगी सीरम के पैनल का उपयोग करके अन्य फ्लेविवायरस जैसे येलो फीवर वायरस, डेंगू वायरस या वेस्ट नील वायरस की एंटीबॉडी-निर्भर वृद्धि का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है।यह तकनीक आर्बोवायरस या वायरोलॉजी क्षेत्रों में भविष्य में एंटीबॉडी-निर्भर वृद्धि अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी होगी। उचित जैव सुरक्षा स्तर दो व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण हर समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए और सभी वायरल कचरे को निपटान से पहले 30 मिनट के लिए 10% ब्लीच में दूषित किया जाना चाहिए ।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक Epitope डिस्कवरी

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए इन विट्रो एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

संक्रमित Ifnar1 के Immunoprivileged अंगों में Zika वायरस-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन-चूहों/

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

सिंगल सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Efferocytosis की ठहराव

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

एक माउस में एकाधिक अंगों से ज़िका वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...