Name: quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00
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この作品は、1R21AI129881-01 (T.M.C.) へ、国立新興感染症研究所とボストン大学医学部からスタートアップ資金によって支えられた寛大。

本研究では血清試料は、コロンビアからコホートの人間の参加者から得られました。検体の採取は、グァテマラ ・ デ ・ パンプローナ (コロンビア、南アメリカ) とロサンゼルス Potios 病院8内部審査委員会 (IRB) によって承認されました。サンプルは匿名で提供された、患者情報にアクセスしていた捜査官。血清サンプルは、DENV 血清型についてチェックされました。サンプ?...

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その他 DENV 血清型の ADE につながる DENV 抗体の交差反応性は、効果的なワクチン11の開発を阻害しています。ZIKV は同じ、フラビに属し、他の発現、特に DENV12とかなり相同性を持っています。ZIKV、DENV 中和抗体の主なターゲットは、2 つのウイルス13,14,15間非常に高い構造と第四紀のシー?...

蚊媒介性ウイルス疾患、間ジカ感染症は臨床的に最も重要な1であります。感染は、ほとんどの場合、その主要なベクトル1,2としてネッタイシマカを使用する ZIKV フラビ ウイルスによって引き起こされます。ただし、いくつかの ZIKV の発生3の主要なベクトルとしてヒトスジシマカを報告している研究もあります。感染症は多くの場合無症候性であるが、最も一般的な症状は発熱、頭痛、筋肉痛2。治療法やワクチン使用可能なありません ZIKV 感染症のため、利用できる治療法は主に支持。南アメリカの ZIKV の最近の発生は、重症の病気と小頭症2という名前の胎児の神経発達障害で、約 20 倍の増加をもたらした。南アメリカは、DENV と西ナイル ウイルスなどいくつかのアルボ ウイルスに固有の領域は、他の flavivirus(es) に前の免疫が ZIKV 感染症と疾患の重症度の役割を果たしているかどうかを調査することが重要です。
昔からウイルスは宿主の細胞機構を引き継ぐし、抗ウイルス応答を抑制するために感染の機会を増やすにさまざまな戦略を進化してきました。すべての中で最も魅力的なの 1 つは、ADE4現象とのレプリケーションを強化するウイルスによるホスト前免疫抗体の使用です。よく学び、ウイルス抗体価と疾患の結果5,6,7を向上させる実証 DENV の 4 血清型すべてにわたって ADE がされています。以前の in vitro の研究では、既存のプライマリひと免疫細胞8DENV 免疫のために ZIKV レプリケーションの重要な拡張機能を示しました。また、初代培養細胞で ZIKV のレプリケーションを強化する DENV 既存抗体の機能を定量化する関連する in vitro 法を示した。
私たちが開発したプロトコル使用テスト、血清サンプル TCID 50 DENV 中和または生体関連セルまたは ZIKV に感染することができます組織由来細胞の ZIKV と共に、プラック減数中和試験 (PRNT) の試金。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:119px;">GEMINI</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">iCycler&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">785BR02188</td>
			<td>Model No. CFX96 Optics Module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microfuge 18 Centrifuge</td>
			<td style="width:119px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanodrop-1000</td>
			<td style="width:119px;">Thermoscientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">204154</td>
			<td>Used for 1 step RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RNeasy RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RPMI-medium&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells

フラビ ウイルス ジカとギランバレー症候群や乳児、小頭症などの神経合併症の最近の出現は深刻な公共の安全の懸念をもたらしています。ジカ ウイルス (ZIKV) の最近の再出現は、地域人口がさらされているし、他の密接に関連する事前の免疫の状態は、主に、最も重要な脅威となる抗体依存的な増強 (ADE) 危険因子のうち発現、特にデング熱ウイルス (DENV)。ここでは、ひと初代細胞または細胞株における ZIKV 感染 DENV に対する血清抗体の効果を定量化するためのプロトコルについて述べる。

図 1、ADE プロトコルの実施に関わるすべての手順のステップバイ ステップの図式図があります。DENV に ADE の ZIKV の既存の免疫のための全体の手順を示す模式図です。図 2は、どのように人間の血清サンプルは、3 つのグループに分類された: DENV 感染確認サンプル DENV 感染グループと呼ばれます、DENV 抗体確認サンプルは DEN...

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Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染症の定量化、ひと初代細胞、ひと血清を用いたデング ウイルスに対する耐性が既存のジカ ウイルス感染に及ぼす影響を評価する方法について述べる。

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

この方法は、実際のヒト患者血清および原発性ヒト免疫細胞を用いて、デング熱ウイルスに対する既存の免疫がジカウイルス感染に及ぼす影響を評価するために使用することができる。実際のヒト患者血清サンプルおよびヒト初代細胞の使用は、免疫前血清および抗体によるジカウイルスの抗体依存性増強に関するより深い洞察を提供する。この方法は、他のヒト細胞におけるウイルス感染を増強する患者の血液内の抗体の能力に関する洞察を提供する。ウイルス感染レベルが検出に十分高いが、細胞を圧倒したり、データ解釈を妨げないように十分に低いことを確認することが重要です。滅菌された平らな底96ウェルプレートで、1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞培養培地で30〜4番目の細胞を播種することから始めます。すべての細胞がめっきされたら、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、解凍したヒト血清サンプルの10倍の連続希釈液を血清フリー培地に入れます。ウイルス溶液および細胞に希釈液を添加する前に、すべての免疫前血清の血清希釈および希釈因子を一定に保つようにしてください。次に、ジカウイルスは、すぐに氷にストックを転送する前に、1〜2分間37°Cの水浴でストック溶液を解凍します。血清アリコートにジカウイルスの感染等価量の0.1倍量を加え、細胞培養インキュベーターにプレートを1時間置き、デング熱ウイルス抗体がジカビリオンと複合体を形成できるようにする。インキュベーションの終わりに、ウェルあたり100マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、各ウェルに50マイクロリットルの免疫複合体を加えます。2時間のインキュベーションの後、培地を取り除き、よく100マイクロリットルのPBSで井戸を2回洗い、免疫複合体と未接続のビリオンを完全に除去します。次に、10%のウシ胎児血清を添加した細胞培養培地のウェルあたり100マイクロリットルで細胞を供給する。その後、細胞を48時間培養インキュベーターに戻す。感染の2日後、細胞を1ウェルあたり100マイクロリットルの無菌PBSで2回洗浄してから、各ウェルに10%βメルカプトエタノールを含む250マイクロリットルの細胞溶菌バッファーを添加する。ピペットは、リシスプロセスをスピードアップし、細胞ライセートを無菌標識1.5ミリリットルチューブに移すために、スクラッチで少なくとも5回上下します。各チューブに70%エタノールの等量を加え、溶解液を上下に4〜5回ピペットします。溶解液懸濁液が明確な場合は、各溶液を2ミリリットルの回収チューブ内の標識されたシリカベースのカラムに移し、遠心分離を行います。フロースルーは、同じコレクションチューブ内の列を保持し、2番目の遠心のために各列に700マイクロリットルのウォッシュバッファ1を追加します。フロースルーを廃棄した後、洗浄ごとに500マイクロリットルのウォッシュバッファを2回洗い流します。2回目の洗浄後、カラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに移し、別の遠心分離を行います。遠心分離のために各カラムの中心に摂氏42度のRNaseフリー水の30マイクロリットルを加え、溶出したRNAを回収します。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応またはQRTPCR分析では、10マイクロモル株の遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを1マイクロリットル加え、反応ごとに0.25マイクロリットルの逆転写酵素ミックスを加えます。ジカウイルス遺伝物質を認識するプライマーは、ウイルス遺伝子を検出し、感染定量を可能にする。次に、12.5マイクロリットルのSYBRグリーンミックスを加え、各反応に25マイクロリットルの水を加え、96ウェルQPCRプレートの各ウェルに15マイクロリットルのマスターミックスを加えます。マスターミックスを使用する場合は、100ナノグラムのRNAサンプルをミックスに加え、マスターミックスをQRTPCRプレートの個々のウェルにピペットします。サンプルは、同じQRTPCRプレート上で三重に実行する必要があることに注意してください。次に、表に示したパラメータに従って定量PCRマシン上でサンプルを実行します。システム ソフトウェアのメルト カーブ タブをクリックして、メルト カーブをモニタします。メルト曲線は、特定の遺伝子に対するすべてのサンプルにおいて単一のピークを示し、1つのアンプリコンの存在を確認する。最適な結果を得るには、融解曲線プロトコルで、ステップ間の0.5°Cの温度増分と最低保持時間10秒を使用してください。次に、[定量データ]タブをクリックして各サンプルの定量サイクルを取得し、さらに定量分析のためにデータをスプレッドシートにエクスポートします。ヒト血清サンプルは、デングウイルス感染確認サンプル、デング熱ウイルス抗体確認サンプル、デング熱ウイルス中和抗体またはRNAのない健康血清の3つの異なるグループに分類することができます。48時間の感染後、QRTPCR分析は、デングウイルス血清型1〜4抗体を含むほとんどの血清が異なるレベルでジカウイルス複製を増強できることを示している。ジカウイルスの価動体の最も高い増加は、ジカウイルスの比較的低い誘導を示す血清型1および3と比較して、血清含有デング熱ウイルス血清型2および4抗体で治療されたマクロファージに見られる。滅菌環境を維持し、適切な個人保護装置を着用し、融解されたウイルス血清サンプルとQPCR試薬を常に氷の上に保つことが重要です。このプロトコルは、患者血清のパネルを使用して、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、または西ナイルウイルスなどの他のフラビウイルスの抗体依存性増強を研究するために容易に改変することができる。この技術は、アルボウイルスまたはウイルス学分野において、将来の抗体依存性増強研究を行う上で非常に有用である。適切なバイオセーフティレベル2つの個人保護装置は常に使用する必要があり、すべてのウイルス廃棄物は、廃棄前に30分間10%漂白剤で除染する必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

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ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

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Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

ジカ特定診断エピトープの探索

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...