Name: quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado generosamente por 1R21AI129881-01 (a Interpetative), fondos de puesta en marcha de los laboratorios nacionales de emergentes infecciosas enfermedades y la escuela de medicina de la Universidad de Boston.

Las muestras de suero utilizadas en este estudio se obtuvieron de los humanos participantes de una cohorte de Columbia. Recogida de la muestra fue aprobada por la Junta de revisión interna (IRB) en Universidad de Pamplona (Colombia, América del Sur) y Los Potios Hospital8. Las muestras se anónimamente y los investigadores no tenían acceso a información para el paciente. Se revisaron las muestras de suero para el serotipo DENV. Las muestras más fueron confirmadas para neutralizar la infecció...

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Reactividad cruzada de anticuerpos contra DENV hacia ADE de otros serotipos DENV ha obstaculizado el desarrollo de una vacuna eficaz11. ZIKV pertenece a la misma familia, Flaviviridae y tiene una considerable homología con otros flaviviruses, especialmente DENV12. El objetivo principal de anticuerpos neutralizantes por ZIKV y DENV es la proteína, que comparte una homología de secuencia estructural y cuaternario muy alto entre los dos virus13,...

Entre las enfermedades virales transmitidas por mosquitos, la infección Zika es uno de los más clínicamente importantes1. La infección es causada por un flavivirus ZIKV que, en la mayoría de los casos, Aedes aegypti el vector primario1,2. Sin embargo, hay estudios que han reportado Aedes albopictus como vector primario en algunos brotes ZIKV3. Aunque la infección es asintomática en muchos casos, los síntomas más comunes son fiebre, dolor de cabeza y musculares dolor2. No existe ninguna cura o una vacuna para la infección por ZIKV y el tratamiento disponible es principalmente de apoyo. Los brotes recientes de ZIKV en América del sur llevaron a casos severos de la enfermedad y un aumento de aproximadamente 20-fold en el trastorno del desarrollo neurológico en fetos llamado microcefalia2. Como América del sur es una zona endémica de varios arbovirus como virus DENV y del oeste del Nilo, es crucial investigar si inmunidad previa a otros flavivirus(es) desempeña un papel en la severidad de las infecciones ZIKV y enfermedad.
A lo largo de la edad, los virus han evolucionado diferentes estrategias para aumentar sus probabilidades de infectividad para apoderarse de la maquinaria de la célula huésped y suprimir la respuesta antiviral. Uno de los más fascinantes de todos es el uso de anticuerpos previamente inmune anfitrión por los virus para mejorar su replicación con el fenómeno ADE4. ADE a través de los cuatro serotipos de DENV ha sido bien estudiado y demostrado aumentar títulos virales y enfermedad resultado5,6,7. En un estudio in vitro, hemos demostrado realce significativo de replicación ZIKV debido a pre-existir inmunidad DENV en células inmunes humanas primaria8. También hemos demostrado un método in vitro pertinente para cuantificar la capacidad de mejorar la replicación ZIKV en células primarias de anticuerpos preexistente contra DENV.
El protocolo que hemos desarrollado utiliza muestras de suero humano que se prueban para la neutralización de DENV TCID 50 o análisis de la prueba de neutralización de la reducción de placa (PRNT), junto con ZIKV en células biológicamente relevantes o células derivadas de tejidos que pueden infectar ZIKV.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:119px;">GEMINI</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">iCycler&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">785BR02188</td>
			<td>Model No. CFX96 Optics Module</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Microfuge 18 Centrifuge</td>
			<td style="width:119px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:119px;">367160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Nanodrop-1000</td>
			<td style="width:119px;">Thermoscientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">204154</td>
			<td>Used for 1 step RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RNeasy RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">74106</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">RPMI-medium&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of antibody-dependent enhancement of the zika virus in primary human cells

La reciente aparición del flavivirus Zika y complicaciones neurológicas, tales como síndrome de Guillain-Barré y microcefalia en los bebés, ha llevado a preocupaciones graves de seguridad pública. Entre los factores de riesgo, estimulación dependiente de anticuerpos (ADE) representa la amenaza más significativa, como el reciente resurgimiento del virus Zika (ZIKV) es principalmente en las zonas donde la población ha estado expuesta y está en un estado de inmunidad previa a otros estrechamente relacionados flaviviruses, especialmente el virus del dengue (DENV). Aquí, describimos un protocolo para cuantificar el efecto de los anticuerpos del suero humano contra DENV en infección por ZIKV en las células humanas primarias o líneas celulares.

En la figura 1, hay una ilustración diagramática paso a paso de todos los pasos necesarios para llevar a cabo el protocolo de ADE. Es un diagrama esquemático mostrando el procedimiento entero de ADE de ZIKV debido a inmunidad preexistente a DENV. La figura 2 muestra cómo humano suero muestras se categorizaron en tres grupos diferentes: muestras de la infección confirmada de DENV se refieren como el grupo de infectados con DE...

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Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Se describe un método para evaluar el efecto de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección del virus Zika mediante el uso de suero humano, las células humanas primarias y cuantificación de la infección por reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Este método se puede utilizar para evaluar los efectos de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección por el virus del Zika, utilizando el suero real del paciente humano y las células inmunes humanas primarias. El uso de muestras de suero reales para pacientes humanos y células primarias humanas proporciona una visión más profunda de la mejora dependiente de los anticuerpos del virus del Zika mediante sueros y anticuerpos preinmunes. Este método proporciona información sobre la capacidad de los anticuerpos dentro de la sangre de un paciente para mejorar una infección por virus en otras células humanas.Es importante asegurarse de que los niveles de infección viral son lo suficientemente altos para la detección, pero lo suficientemente bajos como para no abrumar las células o interferir con la interpretación de los datos. Comience por sembrar tres veces diez a las cuartas células en 100 microlitros de medio de cultivo celular por pozo en una placa estéril y plana inferior de 96 pozos. Cuando todas las células hayan sido chapadas, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%y haga diluciones seriales de 10 veces de muestras de suero humano descongeladas en medio libre de suero.Asegúrese de mantener constantes las diluciones séricas y el factor de dilución para todos los sueros preinmunes antes de agregar las diluciones a las soluciones del virus y las células. A continuación, descongelar la solución de las cepas del virus del Zika en un baño de agua de 37 grados Celsius durante uno a dos minutos antes de transferir rápidamente la población al hielo. Añadir un volumen equivalente de 0,1 multiplicidad de infección del virus del Zika a las alícuotas séricas y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante una hora para permitir que los anticuerpos del virus del dengue formen complejos con los viriones del zika.Al final de la incubación, lavar las células con 100 microlitros de PBS por pozo y añadir 50 microlitros de complejo inmune a cada pocóteo. Después de las dos horas de incubación, retire el medio y lave los pozos dos veces con 100 microlitros de PBS por pozo para eliminar completamente los complejos inmunológicos y cualquier virión no conectado. A continuación, alimentar las células con 100 microlitros por pozo de medio de cultivo celular complementado con 10%suero bovino fetal.Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Dos días después de la infección, lavar las células dos veces con 100 microlitros de PBS estériles por bien antes de agregar 250 microlitros de tampón de lysis celular con 10%beta mercaptoetanol a cada pozo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces con arañazos para acelerar el proceso de lelisis y transferir los tonos celulares a tubos estériles etiquetados de 1,5 mililitros.Añadir un volumen igual de 70% etanol a cada tubo y pipetear la solución de izado hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces. Cuando las suspensiones de izado estén claras, transfiera cada solución a columnas etiquetadas a base de sílice en dos tubos de recolección de mililitros para centrifugación. Deseche el flujo que mantiene las columnas en los mismos tubos de recogida y agregue 700 microlitros de Wash Buffer 1 a cada columna para una segunda centrifugación.Después de desechar el flujo a través, enjuague las columnas dos veces más con 500 microlitros de Wash Buffer dos por lavado. Después del segundo lavado, transfiera las columnas a nuevos tubos de recogida de dos mililitros para otra centrifugación. Agregue 30 microlitros de agua libre de RNase de 42 grados Celsius al centro de cada columna para la centrifugación y recupere el ARN eluido.Para la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real o el análisis QRTPCR agregue un microlitro de imprimaciones específicas de genes hacia adelante y hacia atrás de 10 existencias micromolares junto con 0,25 microlitros de mezcla de transcriptasa inversa por reacción. Tenga en cuenta que los imprimadores que reconocen el material genético del virus del Zika detectarán genes virales y permitirán la cuantificación de infecciones. A continuación, agregue 12,5 microlitros de SYBR Green Mix seguidos de 25 microlitros de agua a cada reacción añadiendo 15 microlitros de Master Mix en cada pozo de placa QPCR de 96 pozos.Cuando utilice una mezcla maestra, añada 100 nanogramos de la muestra de ARN a la mezcla y pipetee la mezcla maestra en pozos individuales de la placa QRTPCR. Tenga en cuenta que las muestras deben ejecutarse por triplicado en la misma placa QRTPCR. A continuación, ejecute las muestras en una máquina de PCR cuantitativa de acuerdo con los parámetros descritos en la tabla.Al hacer clic en la pestaña de curva de fusión en el software del sistema para supervisar la curva de fusión. La curva de fusión mostrará un solo pico en todas las muestras para un gen en particular para confirmar la presencia de un solo amplón. Para obtener resultados óptimos, utilice incrementos de temperatura celsius de 0,5 grados entre pasos y un tiempo de retención mínimo de 10 segundos en el protocolo de curva de fusión.A continuación, haga clic en la pestaña de datos de cuantificación para obtener un ciclo cuantitativo para cada muestra y exportar los datos a una hoja de cálculo para un análisis de cuantificación adicional. Las muestras de suero humano se pueden clasificar en tres grupos diferentes: muestras confirmadas por infección por el virus del dengue, muestras confirmadas de anticuerpos del virus del dengue y sueros sanos sin anticuerpos neutralizantes del virus del dengue o ARN. Después de 48 horas de infección, el análisis QRTPCR demuestra que la mayoría de los sueros que contienen serotipo uno a cuatro anticuerpos del virus del dengue son capaces de mejorar la replicación del virus del Zika a diferentes niveles.El mayor aumento de los títulos del virus del Zika se encuentra en los macrófagos tratados con serotipo dos y cuatro del virus del dengue que contienen sueros en comparación con el serotipo uno y tres que muestran una inducción relativamente menor del virus del Zika. Es importante mantener un ambiente estéril, usar el equipo de protección personal adecuado y mantener siempre en hielo las muestras de suero del virus descongelado y los reactivos QPCR. Este protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar la mejora dependiente de anticuerpos de otro flavivirus, como el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue o el virus del Nilo Occidental utilizando un panel de suero del paciente.Esta técnica será muy útil para llevar a cabo futuros estudios de mejora dependientes de anticuerpos en los campos del arbovirus o la virología. Se deben utilizar en todo momento un equipo adecuado de bioseguridad, dos equipos de protección personal y todos los residuos virales deben descontaminarse en un 10% de lejía durante 30 minutos antes de su eliminación.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

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Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

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Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

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Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

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Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

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Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...