Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

ونحن نشكر زملائنا والمتعاونين على مساهمتهم لعملنا. أيد هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 29832.

1-إعداد الركيزة
ملاحظة: ركائز رنا أقصر من النيوكليوتيدات ~ 65 يمكن توليفها كيميائيا مع البيوتين (ب) ورابط الصورة كليفابل (pc) (المشار إليها معا البيوتين صور كليفابل أو ثنائي الفينيل متعدد الكلور) تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (تكوينرابطة الدول المستقلة ). بحاجة...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

الأسلوب الموصوفة هنا واضحة وإلى جانب إدراج رابط صورة كليفابل والأشعة فوق البنفسجية-شطف والخطوة لا تختلف عن الأساليب شيوعاً التي تستفيد من تفاعل قوي جداً بين البيوتين وستريبتافيدين. الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف فعال جداً، عادة الإفراج عن أكثر من 75% من الجيش الملكي النيبالي المعطل تداو?...

في حقيقيات النوى، يخضع السلائف مرناً ولدت الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (قبل-مرناس) عدة أحداث نضج في النواة قبل أن تصبح قوالب مرناً تعمل بكامل طاقتها تخليق البروتين في السيتوبلازم. واحد من هذه الأحداث نهاية تجهيز 3 '. للغالبية العظمى من قبل-مرناس، تتضمن 3 ' المعالجة نهاية الانقسام بالإضافة إلى بوليادينيليشن. هذا رد فعل خطوتين هو تحفزها وفيرة نسبيا معقدة تتألف من أكثر من 15 البروتينات1. معالجة ما قبل الحيوانية المعتمدة على النسخ المتماثل هيستون-مرناس في نهاية 3 ' بواسطة إليه مختلفة التي الدور الرئيسي الذي تؤديه سنرنب U7، وفرة منخفضة معقدة تتألف من سنرنا U7 ~ 60 النيوكليوتيدات والبروتينات متعددة2،3 . زوج قاعدي سنرنا U7 مع تسلسل معين في هيستون قبل-مرناً وواحدة من الوحدات فرعية سنرنب U7 يحفز رد فعل الانقسام، وتوليد هيستون الناضجة ذيل مرناً دون poly(A). هيستون-مرناً قبل نهاية تجهيز 3 ' يتطلب أيضا حلقة الجذعية ملزمة البروتين (سلبب)، الذي يربط حلقة جذعية مصانة يقع المنبع لموقع الانقسام ويعزز تجنيد سنرنب U7 إلى الركيزة2،3. الدراسات الرامية إلى تحديد المكونات الفردية سنرنب U7 كانت صعبة بسبب تركيز منخفض من سنرنب U7 في الخلايا الحيوانية، واتجاه المجمع ننأى أو الخضوع proteolysis الجزئي أثناء تنقية نتيجة استخدام المنظفات خفيفة4،،من56ويغسل الملح عالية و/أو متعددة الخطوات الكروماتوغرافي7،،من89.
لتحديد تكوين الآلية U7-تعتمد على المعالجة، وكان المحتضنة جزء قصير من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين في 3 أو 5 ' مع خلاصة نووية مؤخرا، وتم القبض على مجمعات المجتمعون في المغلفة ستريبتافيدين [اغروس] الخرز5،،من610. بسبب تفاعل قوية على نحو استثنائي بين البيوتين و streptavidin، الوتيد تحت يشوه الظروف من الغليان في الحزب الديمقراطي الصربي بروتينات معطلة على الخرز ستريبتافيدين وتحليلها بواسطة تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. بينما هذا النهج بسيطة حددت عددا من عناصر سنرنب U7، أسفرت عن عينات بدائية نسبيا، وغالباً ما تكون ملوثة بعدد كبير من البروتينات الخلفية نونسبيسيفيكالي ملزمة بالخرز ستريبتافيدين، يحتمل أن إخفاء بعض عناصر إليه معالجة ومنع الكشف عنها على الفضة الملون الهلام5،،من610. الأهم من ذلك، يمنع هذا النهج أيضا أي الدراسات الفنية مع المواد المعزولة وفي تنقية إضافية إلى التجانس بطرق إضافية.
واقترح عددا من التعديلات على مر الزمن لمعالجة الطبيعة تقريبا لا رجعة فيه تفاعل البيوتين/streptavidin، مع معظمهم ويجري تصميم أما يضعف التفاعل أو تقديم ذراع مباعدة كيميائيا كليفابل في المحتوية على البيوتين الكواشف11،12. وكان الجانب السلبي لجميع هذه التعديلات أنها تقلل إلى حد كبير كفاءة الأسلوب و/أو الشروط غير الفسيولوجية المطلوبة غالباً أثناء الخطوة شطف، يعرض للخطر سلامة أو نشاط البروتينات المنقاة.
وهنا يصف لنا مقاربة مختلفة لحل المشكلة الكامنة استراتيجية البيوتين/ستريبتافيدين باستخدام الحمض النووي الريبي نهاية ركائز التي أرفقت البيوتين تساهمي إلى 5 ' عبر ' 1 صور--كليفابل-(2-نيتروفينيل) moiety إيثيل هو حساسة للأشعة فوق البنفسجية13،14موجه طويلة. وقمنا باختبار هذا النهج لتنقية إليه تجهيز U7-تعتمد على الحد من المورفولوجية والثدييات النووية مقتطفات15. معطلة في الخرز streptavidin عقب حضانة قصيرة من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين ورابط صور كليافابلي مع خلاصة نووية، مجمعات المعالجة المجمعة وغسلها جيدا وصدر برفق للحل في مسقط النموذج قبل التعرض للضوء ~ 360 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية. أسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف جداً فعالة وسريعة وواضحة، مما أسفر عن كميات كافية من سنرنب U7 تصور مكوناته بالشظية تلطيخ من قدر ضئيل من 100 ميليلتر من استخراج15. المواد التيد الأشعة فوق البنفسجية خال من البروتينات أساسية ومناسبة لتحليل الطيف الكتلي المباشر وخطوات تنقية إضافية وفحوصات الانزيمية. قد اعتمدت نفس الأسلوب لتطهير المجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين الأخرى التي تتطلب مواقع ربط الحمض النووي الريبي قصيرة نسبيا. البيوتين ورابط الصورة كليافابلي يمكن أيضا تساهمي إرفاق إلى واحد-ومزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي، واحتمال توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية مختلف الحمض النووي/البروتين المجمعات.
التوليف الكيميائي للحمض النووي الريبي الركازات المحتوية على تساهمي تعلق البيوتين ورابط الصورة كليفابل العملي فقط مع تسلسل التي لا تتجاوز النيوكليوتيدات ~ 65، أصبحت مكلفة وغير فعالة لتسلسل أطول بشكل ملحوظ. ولمعالجة هذه المشكلة، وضعنا أيضا نهج بديل مناسب لأهداف ملزمة الحمض النووي الريبي أطول بكثير. في هذا النهج، والجيش الملكي النيبالي من أي طول والنوكليوتيدات تسلسل الذي تم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 أو SP6 وتعتيق إلى اليغنوكليوتيد تكميلية قصيرة التي تحتوي على البيوتين ورابط الصورة كليفابل في 5 ' نهاية (ترانس التكوين). مزدوج الناتجة بعد ذلك، تستخدم لتنقية البروتينات الربط الفردي أو مجمعات الجزيئات في الخرز streptavidin بعد البروتوكول نفسه وصف لركائز الجيش الملكي النيبالي المحتوية على البيوتين كليفابل الصور المرفقة تساهمي (رابطة الدول المستقلة التكوين). مع هذا التعديل، يمكن استخدام البيوتين صور كليفابل بالاقتران مع في المختبر التي تم إنشاؤها بالنصوص التي تحتوي على مئات النيوكليوتيدات، توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية للتنقية لنطاق واسع من الجيش الملكي النيبالي/البروتين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

لسنوات عديدة، استخدمت بنجاح قوية على نحو استثنائي وشكلت سرعة تفاعل البيوتين وستريبتافيدين لتنقية جزئية هامة بيولوجيا الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات. إلا أن هذه الاستراتيجية تعاني من عيب رئيسي واحد يحد من استخدامها الأوسع: تفاعل البيوتين/ستريبتافيدين يمكن كسرها إلا بمعرفة الظروف التي تعطل أيضا سلامة مجمعات الوتيد، ومن ثم تحول دون بهم تحليل وظيفي اللاحقة و/أو تنقية كذلك بطرق أخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات التيد غالباً ملوثة بالبروتينات الأساسية التي تربط نونسبيسيفيكالي بالخرز streptavidin، تعقيد تحليل المجمعات المنقي تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير البديل من البيوتين/ستريبتافيدين الاستراتيجية التي يتم إرفاق البيوتين الركيزة الحمض النووي الريبي عن طريق رابط صورة كليفابل ومجمعات معطلة على الخرز streptavidin هي التيد بشكل انتقائي للحل في النموذج الأصلي بموجة طويلة الأشعة فوق البنفسجية، تاركاً البروتينات الخلفية في الخرز. يمكن توليفها أقصر من ركائز ربط الحمض النووي الريبي كيميائيا مع البيوتين ورابط الصورة كليفابل تساهمي يعلق على نهاية 5 ' من الجيش الملكي النيبالي، بينما أطول الحمض النووي الريبي ركائز يمكن أن تقدمها مع الفريقين اليغنوكليوتيد تكميلية. تم اختبار هذه نوعين مختلفين من الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية U7 سنرنب-تعتمد على تجهيز المجمعات أن تنشق هيستون قبل-مرناس في نهاية 3 ' وكلاهما أثبت إيجابية مقارنة بأخرى قبل وضع أساليب تنقية. عينات التيد الأشعة فوق البنفسجية الواردة مبالغ سنرنب U7 التي كانت خالية من الملوثات الرئيسية البروتين ومناسبة للتحليل المباشر من الطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية سهولة الاكتشاف. يمكن تكييفها لتنقية مجمعات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى الأسلوب الذي وصف بسهولة واستخدامها بالاقتران مع مواقع مفرد، ومزدوج تقطعت الحمض النووي ملزم لتنقية البروتينات الخاصة بالحمض النووي ومجمعات الجزيئات.

تم اختبار طريقة الأشعة فوق البنفسجية-شطف مع اثنين من ركائز الجيش الملكي النيبالي مركباً كيميائيا يعلق تساهمي في النهاية 5 ' لمجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (تكوينرابطة الدول المستقلة ): ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL (الشكل 1) وثنائي الفينيل متعدد ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة للباحثين الذين يحاولون عزل مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي وتحديد تكوينها عن طريق القياس الطيفي الشامل. ونحن نعتقد أن بروتوكول لدينا سوف تكون مفيدة بشكل خاص لتنقية المجمعات الموجودة في الخلايا بكميات محدودة وتميل إلى فصل خلال إجراءات تنقية متعددة الخطوات طويلة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تنطوي على خطوة تنقية واحدة فقط ويمكن استخدامها مع مواقع الربط RNA من أي طول وتسلسل.ومن بين الخطوات التي سيتم فيها وضع شياو-كوي يانغ، وهو أحد كبار فنيي البحوث في مجموعتنا. وبالنسبة لمواقع الربط التي تزيد كثيراً عن 65 نيوكليوتيدات، احصل على مادة T7 المولدة من الحمض النووي الريبي (RNA) والمحول ثنائي الفينيل متعدد الكلور oligonucleotide كما هو مبين في بروتوكول النص. مزيج 20 picomoles من الجيش الملكي النيبالي مع 100 picomoles من oligonucleotide محول في أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة.ضع الأنبوب في الماء المغلي واتركه يحتضن لمدة 5 دقائق. ثم تسمح للماء لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. الملحق الأول 1 ملليلتر من استخراج الماوس النووية مع EDTA 80 ملليمولار في 8 درجة PH إلى تركيز نهائي من 10 ملليمولار.ثم إضافة بين 5 و 10 picomoles من الركيزة RNA التي تم وضع علامة مع moiety PCB. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، مع التأكد من خلط العينة في بعض الأحيان. بعد ذلك استخدام ميكروسنتروجي قبل التبريد في 4 درجات مئوية إلى الطرد المركزي الخليط في 10، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي الترسبات المحتملة.جمع بعناية في supernatant في أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب نقل بيليه. نقل ما يقرب من 100 ميكرولترات من streptavidin تعليق الخرز agarose إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ما يقرب من 1 ملليلتر من العازلة ملزمة لبدء غسل الخرز.الطرد المركزي الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وpirate اسخناب. كرر هذه عملية الغسيل والطرد المركزي 2 إلى 3 مرات لتكبيل الخرز مع العازلة ملزمة. تحميل supernatant التي تم جمعها سابقا ، والذي يحتوي على مجمع تجميعها على الخرز التوازنية.باستخدام دوار أنبوب، تدوير الأنبوب لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية لشل الجيش الملكي النيبالي والمجمعات ملزمة على الخرز. تدور المقبل الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق لجمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب. استلهموا المُنطّع.وشطف الخرز مرتين مع العازلة ملزمة، وذلك باستخدام عملية الغسيل الموصوفة سابقا. بعد إزالة افرنح من غسل الثاني، إضافة 1 ملليلتر من العازلة ملزمة وتدوير العينة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. تدور أسفل العينة في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.أضف التالي 1 ملليلتر من العازلة ملزمة ونقل التعليق إلى أنبوب جديد. قم بتدوير العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي المجمعات غير المُشلَّة في 25 مرة ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.ثم pirnatate supernatant ، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة. نقل الخرز إلى أنبوب 500 ميكرولتر. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة الذي ينبعث منه ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 365 نانومتر ويسمح له بالوصول إلى التألق الكامل.ملء الجزء السفلي من طبق بيتري مع الجليد معبأة بإحكام التراص على غطاء الطبق. دوامة وجيزة الأنبوب الذي يحتوي على المجمعات غير المُشلَّلة. ثم ضعه أفقياً على الجليد واغطيه بالمصباح الذي تم تسخينه قبل ذلك، مع التأكد من أن العينة تتراوح من 2 إلى 3 سنتيمترات من سطح المصباح.تشع العينة لمدة إجمالية 30 دقيقة بينما كثيراً ما تُعكس وتدامة الأنبوب لضمان التعرض الموحد ومنع ارتفاع درجة الحرارة. بعد ذلك، تدور أسفل الخرز في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وجمع ناظر. جهاز طرد مركزي هذا الماسخ مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.جمع نابيراتون الناتجة التأكد من ترك كمية صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب نقل أي الخرز المتبقية. باستخدام الكهرباء SDS-PAGE، فصل جزء من UV مائل فائقة والكسر المقابل من المواد المتبقية على الخرز بعد elution الأشعة فوق البنفسجية. المقبل استخدام طقم ملونة الفضة المتاحة تجاريا لطخة هلام.تقييم كفاءة elution الأشعة فوق البنفسجية من خلال مقارنة شدة البروتينات الموجودة في UV eluted فائقة وتلك التي تركت على الخرز بعد الأشعة فوق البنفسجية. اكوس نطاقات البروتين من الفائدة وتحديد هوياتهم عن طريق القياس الطيفي الشامل. بعد ذلك، تحليل مباشرة جزء من UV مائل متراكب بواسطة قياس الطيف الشامل لتحديد البروتيوم بأكمله من المواد النقية بطريقة غير متحيزة.في هذه الدراسة، الجذعية حلقة RNA الموسومة مع البيوتين الصورة مشقوق هو محتضن مع 1 ملليلتر من مستخلص S100 السيتوبلازمي التي تم الحصول عليها من خلايا المايلوما الفئران. ويتم تحليل تأثير وكفاءة للأشعة فوق البنفسجية من قبل تلطيخ الفضة. يتم الكشف عن عدد من البروتينات على الخرز streptavidin قبل elution الأشعة فوق البنفسجية.الإشعاع مع الموجات الطويلة UV تطلق فقط بعض هذه البروتينات في supernatant ترك خلفية غير محددة على الخرز. وهذا يؤكد على أهمية خطوة elution الأشعة فوق البنفسجية. يحدد قياس الطيف الكتلي البروتينات UV المائلة الرئيسية على أنها 3'hExo و SLBP مع SLBP يتم تمثيلها من خلال كل من البروتين الكامل الطول وعدد من منتجات التحلل الأقصر.كميات أصغر من البروتينات الأخرى التي تم تحديدها كبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي المختلفة التي يتم إطلاقها أيضًا بشكل انتقائي في محلول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. أدى elution من شل الحركة Drosophila histone قبل مرنا الموسومة مع biotin يندمج مع مستخلص نووي إلى إطلاق انتقائي لعدد قليل فقط من البروتينات في السوبر مع خلفية مكثفة من البروتينات غير محددة المتبقية على الخرز. يحدد قياس الطيف الكتلي هذه البروتينات لتكون مكونات U7 snRNP.لم يتم الكشف عنها في وجود المنافسين معالجة التي كتلة ملزمة من U7 snRNP إلى histone قبل مرنا. من المهم استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالية الكثافة ووضعها على مسافة قريبة من العينة المشععة مع التأكد أيضا من أنها لا ترتفع درجة الحرارة. طريقة elution الأشعة فوق البنفسجية تسفر عن مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي الأصلي التي تفتقر إلى الملوثات الرئيسية ومناسبة مباشرة لمزيد من خطوات تنقية والتقديس الوظيفي.تجنب التعرض للعين والجلد أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

إجراء جنبا إلى جنب على أساس اليغنوكليوتيد عزل الحمض النووي الريبي لاسترداد مجمعات البروتين مرناً حقيقية النواة

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...