Name: single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker
Uploaded: 2019-01-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Vi takker vores kolleger og samarbejdspartnere for deres bidrag til vores arbejde. Denne undersøgelse blev støttet af NIH give GM 29832.

1. underlaget forberedelse
Bemærk: RNA substrater kortere end ~ 65 nukleotider kan syntetiseres kemisk med biotin (B) og foto-cleavable (pc) linker (sammen kaldet foto-cleavable biotin eller pcB) kovalent knyttet til RNA 5' ende (cis konfiguration). RNA substrater indeholdende betydeligt længere bindingssteder skal være genereret i vitro af T7 (eller SP6) transskription og efterfølgende udglødet til en kort supplerende adapter oligonukleotid indeholdende pcB gruppe på 5'-...

<ol>
	<li>Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+the+beta-CASP+ribonucleases:+highly+conserved+and+ubiquitous+metallo-enzymes+involved+in+messenger+RNA+maturation+and+degradation.">Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).</li><li>Dominski, Z., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+3'+end+of+histone+mRNA:+getting+closer+to+the+end.">Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end.</a> Gene. 396 (2), 373-390 (2007).</li><li>Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Proteins+of+the+U7-Specific+Sm+Ring+Function+as+the+Molecular+Ruler+To+Determine+the+Site+of+3+'-End+Processing+in+Mammalian+Histone+Pre-mRNA.">Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).</li><li>Skrajna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U7+snRNP+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+in+a+FLASH-dependent+manner+by+two+separate+regions+of+the+stem-loop+binding+protein.">U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein.</a> RNA. 23 (6), 938-951 (2017).</li><li>Smith, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+affinity+purification+of+U7+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+using+complementary+biotinylated+2'-+O-methyl+oligoribonucleotides.">Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).</li><li>Pillai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Sm+core+structure+of+U7+snRNPs:+assembly+by+a+specialized+SMN+complex+and+the+role+of+a+new+component,+Lsm11,+in+histone+RNA+processing.">Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing.</a> Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).</li><li>Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+U7+snRNPs+lack+the+Sm+proteins+D1+and+D2+but+contain+Lsm10,+a+new+14+kDa+Sm+D1-like+protein.">Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein.</a> EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complex+Containing+the+CPSF73+Endonuclease+and+Other+Polyadenylation+Factors+Associates+with+U7+snRNP+and+Is+Recruited+to+Histone+Pre-mRNA+for+3+'-End+Processing.">A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).</li><li>Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemically+cleavable+biotinylated+nucleotide:+usefulness+in+the+recovery+of+protein-DNA+complexes+from+avidin+affinity+columns.">A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+biotin+phosphoramidite+for+5'-end-labeling,+affinity+purification+and+phosphorylation+of+synthetic+oligonucleotides.">Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).</li><li>Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocleavable+affinity+tags+for+isolation+and+detection+of+biomolecules.">Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules.</a> Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).</li><li>Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+of+catalytically+active+U7-dependent+processing+complexes+assembled+on+histone+pre-mRNA+containing+biotin+and+a+photo-cleavable+linker.">Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker.</a> Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).</li><li>Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3+'+exonuclease+that+specifically+interacts+with+the+3+'+end+of+histone+mRNA.">A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA.</a> Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).</li><li>Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+3'hExo,+a+3'+exonuclease+specifically+interacting+with+the+3'+end+of+histone+mRNA.">Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).</li><li>Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+histone+mRNA+stem-loop,+human+stem-loop+binding+protein,+and+3'hExo+ternary+complex.">Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex.</a> Science. 339 (6117), 318-321 (2013).</li><li>Mayeda, A., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+HeLa+cell+nuclear+and+cytosolic+S100+extracts+for+in+vitro+splicing.">Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).</li><li>Dominski, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+processing+of+Drosophila+histone+pre-mRNAs:+Requirement+for+phosphorylated+dSLBP+and+co-evolution+of+the+histone+pre-mRNA+processing+system.">3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).</li><li>Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+and+similarities+between+Drosophila+and+mammalian+3+'+end+processing+of+histone+pre-mRNAs.">Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs.</a> Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).</li><li>Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+native+spliceosomes+suitable+for+three-dimensional+structural+analysis.">Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis.</a> RNA. 8 (4), 426-439 (2002).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3'+processing+complex.">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).</li><li>Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eri1:+a+conserved+enzyme+at+the+crossroads+of+multiple+RNA-processing+pathways.">Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways.</a> Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).</li><li>Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TUT7+catalyzes+the+uridylation+of+the+3'+end+for+rapid+degradation+of+histone+mRNA.">TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA.</a> RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).</li></ol>

Metoden beskrevet her er ligetil og udover indarbejde en foto-cleavable linker og UV-eluering trin adskiller sig ikke fra de almindeligt anvendte metoder, som drager fordel af de ekstremt stærke interaktion mellem biotin og streptavidin. UV-eluering trin er meget effektiv, typisk frigive mere end 75% af de immobiliserede RNA og proteiner fra streptavidin perler, efterlod en stor baggrund af proteiner, der ikke specifikt binder til perlerne er forbundet. Ved at fjerne denne baggrund, giver UV-eluering trin bemærkelsesv?...

I eukaryoter gennemgå RNA polymerase II-genereret mRNA prækursorer (pre-mRNAs) flere modning begivenheder i kernen før han bliver fuldt funktionel mRNA skabeloner til proteinsyntesen i cytoplasmaet. En af disse begivenheder er 3' enden behandling. For langt de fleste præ-mRNAs omfatter 3' enden behandlingen kavalergang koblet til polyadenylation. Denne to-trins reaktion katalyseret af et forholdsvis rigelig kompleks bestående af mere end 15 proteiner1. Animalske replikation-afhængige Histon pre-mRNAs behandles i 3'-slutningen af en anden mekanisme, hvor hovedrollen spilles af U7 snRNP, en lav overflod kompleks bestående af U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA basepar med en bestemt sekvens i Histon pre-mRNA og en af underenheder af U7 snRNP katalyserer spaltning reaktion, genererer modne Histon mRNA uden en poly(A) hale. 3' enden behandling af Histon pre-mRNA kræver også Stem-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevaret stem-loop beliggende opstrøms af webstedet kavalergang og øger rekrutteringen af U7 snRNP til substratet2,3. Undersøgelser med henblik på at identificere individuelle komponenter af U7-snRNP har været udfordrende på grund af den lave koncentration af U7 snRNP i animalske celler og tendens af komplekset adskille eller gennemgå delvis proteolyse under rensningen brugt milde rengøringsmidler4,5,6, høje salt vasker og/eller flere kromatografiske trin7,8,9.
For nylig, til at bestemme sammensætningen af U7-afhængige behandling maskiner, en kort fragment af Histon pre-mRNA indeholdende biotin på enten 3' eller 5' blev udruget med en nuklear ekstrakt og de forsamlede komplekser blev fanget på streptavidin-belagt Agarosen perler5,6,10. På grund af usædvanlig stærk samspillet mellem biotin og streptavidin, blev proteiner immobiliseret på streptavidin perler elueret under denatureringen betingelser ved kogning i SDS og analyseret af sølv farvning og massespektrometri. Mens denne enkle strategi identificeret en række komponenter af U7 snRNP, givet det forholdsvis rå prøver, ofte kontamineret med et stort antal baggrund proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potentielt maskering nogle komponenter i forarbejdningsmaskiner og forhindre deres opdagelse på sølv farvede geler5,6,10. Vigtigst, udelukket denne tilgang også enhver funktionelle studier med isolerede materialet og dets yderligere rensning til homogenitet yderligere metoder.
En række ændringer blev foreslået over tid til at løse den næsten irreversible karakter af biotin/streptavidin interaktion med de fleste af dem er designet til at enten svækker interaktionen eller levere en kemisk cleavable spacer arm i den Biotin-indeholdende reagenser11,12. Ulempen ved alle disse ændringer var, at de betydeligt reducere effektiviteten af den metode og/eller ofte kræves ikke-fysiologiske tilstande under trinnet eluering, forringe enten integritet eller aktivitet af de rensede proteiner.
Her, vi beskriver en anderledes tilgang for at løse den iboende problem af biotin/streptavidin strategi ved hjælp af RNA substrater som biotin er kovalent knyttet til 5' ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenylfosfat) ethanol gruppe, der er følsomme over for længe bølge UV13,14. Vi har testet denne metode til rensning af begrænsende U7-afhængige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr nukleare ekstrakter15. Efter en kort inkubation af Histon pre-mRNA indeholdende biotin og den foto-cleavable linker med en nuklear ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobiliseret på streptavidin perler, grundigt vasket og forsigtigt frigivet til løsning i en indfødt form af udsættelse for ~ 360 nm UV lys. UV-eluering metode er meget effektiv, hurtig og enkel, giver tilstrækkelige mængder af U7 snRNP at visualisere dets komponenter af splint farvning fra så lidt som 100 µL af ekstrakt15. UV-elueres materialet er gratis baggrund proteiner og egnet til direkte massespektrometri analyse, yderligere rensning trin og enzymatiske assays. Samme metode kan vedtages til rensning af andre RNA/protein komplekser, der kræver relativt korte RNA bindingssteder. Biotin og den foto-cleavable linker kan også være kovalent knyttet til enkelt - og dobbelt-strenget DNA, potentielt udvide UV-eluering metode til rensning af forskellige DNA/protein komplekser.
Kemisk syntese af RNA substrater indeholdende kovalent knyttet biotin og den foto-cleavable linker er praktiske kun med de sekvenser, der ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bliver dyre og ineffektive for betydeligt længere sekvenser. For at løse dette problem, udviklet vi også en alternativ tilgang, der er egnet til meget længere RNA bindende mål. I denne tilgang, RNA af enhver længde og nucleotide sequence er genereret i vitro af T7 eller SP6 transskription og udglødet til en kort supplerende oligonukleotid der indeholder biotin og den foto-cleavable linker på 5'-enden (trans konfiguration). Den resulterende duplex efterfølgende bruges til at rense individuelle bindende proteiner eller makromolekylære komplekser på streptavidin perler efter samme protokol beskrevet for RNA substrater som indeholder foto-cleavable biotin knyttet kovalent (cis konfiguration). Med denne ændring, kan den foto-cleavable biotin bruges sammen med in vitro- genereret udskrifter som indeholder hundredvis af nukleotider, udvide UV-eluering metoden til rensning af en bred vifte af RNA/protein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1638-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-intensity, long-wave UV lamp</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement bulb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-97600-19</td>
			<td>100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis</td>
			<td>Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td>
			<td></td>
			<td>Requst a quote in Dharmacon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman GH 3.8 swing bucket rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-step purification of macromolecular complexes using rna attached to biotin and a photo-cleavable linker

I mange år, er usædvanlig stærk og hurtigt dannet samspillet mellem biotin og streptavidin med succes udnyttet til delvis rensning af biologisk vigtige RNA/protein komplekser. Men denne strategi lider af en væsentlig ulempe, der begrænser dens bredere udnyttelse: biotin/streptavidin interaktion kan brydes kun under denatureringen betingelser, der også forstyrre integriteten af de eluted komplekser, dermed udelukker deres efterfølgende funktionalanalyse og/eller yderligere rensning af andre metoder. Derudover er eluted prøverne ofte forurenet med de baggrund proteiner, som nonspecifically forbinder med streptavidin perler, komplicerer analysen af de oprensede komplekser af sølv farvning og massespektrometri. For at overvinde disse begrænsninger, udviklede vi en variant af biotin/streptavidin strategi, biotin er knyttet til en RNA-substratet via en foto-cleavable linker og komplekser immobiliseret på streptavidin perler er selektivt elueres til løsning i en Native form af langbølge UV, forlader baggrund proteiner på perlerne. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kemisk med biotin og den foto-cleavable linker kovalent knyttet til 5'-enden af RNA, mens længere RNA substrater kan være forsynet med de to grupper af en supplerende oligonukleotid. Disse to varianter af UV-eluering metode blev testet for rensning af U7 snRNP-afhængige behandling-komplekser, der kløver Histon pre-mRNAs på 3'-enden, og de begge vist sig at sammenligne positivt med andre tidligere udviklet rensning metoder. De UV-elueres prøver indeholdt let påviselige mængder af U7 snRNP, der var fri for store protein forureninger og egnet til direkte analyse af massespektrometri og funktionelle assays. Den beskrevne metode kan let tilpasses til rensning af andre RNA bindende komplekser og bruges sammen med enkelt - og dobbelt-strenget DNA bindingssteder til at rense DNA-specifikke proteiner og makromolekylære komplekser.

Metoden UV-eluering blev testet med to kemisk syntetiseret RNA substrater kovalent fastgjort på 5' enden at pcB gruppe (cis konfiguration): pcB-SL (figur 1) og pcB-dH3/5 m RNA'er (figur 2). 31-nukleotid pcB-SL RNA indeholder en stem-loop-struktur, efterfulgt af en 5-nukleotid enkelt strandede hale og dens sekvens er identisk til 3'-enden af modne Histon mRNA (dvs., efter kløvningen af Histon pre-mRNA af U7 snR...

Watch this Scientific Journal Video about Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker at JoVE.com

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

RNA/protein komplekser renset ved hjælp af botin-streptavidin strategi er elueret løsning på denaturering betingelser i en form, der er uegnet til yderligere rensning og funktionelle analyse. Her, beskriver vi en ændring af denne strategi, der udnytter en foto-cleavable linker i RNA og en blid UV-eluering skridt, fremstilling af indfødte og fuldt funktionel RNA/protein komplekser.

Enkelt-trins rensning af makromolekylære komplekser ved hjælp af RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Denne metode bør være af interesse for forskere, der forsøger at isolere RNA-proteinkomplekser og identificere deres sammensætning ved massespektrometri. Vi mener, at vores protokol vil være særligt nyttig til rensning af komplekser, der findes i celler i begrænsede mængder og har tendens til at adskille under lange multi-trins rensningsprocedurer. Den største fordel ved denne metode er, at det kun involverer et enkelt renselsestrin og kan bruges med RNA-bindingssteder af enhver længde og sekvens.Demonstrere nogle af de skridt vil være Xiao-cui Yang, der er en senior forskning tekniker i vores gruppe. For bindingssteder, der er betydeligt længere end 65 nukleotider, skal du anskaffe T7-genereret RNA og en adapter PCB oligonukleotid som beskrevet i tekstprotokollen. Bland 20 picomoles af RNA med 100 picomoles af adapteren oligonukleotid i et 1,5 milliliter rør, der indeholder 100 mikroliter bindingsbuffer.Rørret røret i kogende vand og lad det inkubere i 5 minutter. Lad derefter vandet køle ned til stuetemperatur. Første tillæg 1 milliliter mus nukleare ekstrakt med 80 millimolar EDTA på pH 8 til en endelig koncentration på 10 millimolar.Derefter tilføjes mellem 5 og 10 picomoles af RNA substrat, der er blevet mærket med PCB moiety. Inkuber på is i 5 minutter, og sørg for lejlighedsvis at blande prøven. Næste brug en forkølet mikrocentrifuge ved 4 grader Celsius at centrifuge blandingen ved 10, 000 gange g i 10 minutter for at fjerne eventuelle udfældelser.Opsam forsigtigt supernatanten i et nyt rør på is, samtidig med at du skal være omhyggelig med at undgå at overføre pellet. Ca. 100 mikroliter streptavidin agaroseperadaffjedring overføres til et 1,5 milliliterrør. Tilføj ca. 1 milliliter bindingsbuffer for at begynde at vaske perlerne.Centrifuge røret ved 25 gange g i 2 til 3 minutter og aspirere supernatant. Gentag denne vaske- og centrifugeringsproces 2 til 3 gange for at ligevægte perlerne med bindingsbufferen. Læg den tidligere indsamlede supernatant, som indeholder det samlede kompleks over de ligevægtede perler.Ved hjælp af en rør rotator, rotere røret i 1 time ved 4 grader Celsius at immobilisere RNA og bundet komplekser på perlerne. Næste spin røret på 25 gange g i 2 til 3 minutter for at indsamle perlerne i bunden af røret. Aspirate supernatant.Og skyl perlerne to gange med bindende buffer ved hjælp af den tidligere beskrevne vaskeproces. Efter fjernelse af supernatanten af den anden vask tilsættes 1 milliliter bindingsbuffer og drejes prøven i 1 time ved 4 grader Celsius. Spin prøven ned ved 25 gange g i 2 til 3 minutter.Næste tilføje 1 milliliter bindende buffer og overføre suspensionen til et nyt rør. Drej prøven ved 4 grader Celsius i op til 1 time. Centrifuge de immobiliserede komplekser på 25 gange g i 2 til 3 minutter.Derefter aspirere supernatant, og tilsæt 200 mikroliter af bindende buffer. Overfør perlerne til et 500 mikroliterrør. Tænd for en højintensitets UV-lampe, der udsender UV-lys ved 365 nanometer og gør det muligt at nå fuld glans.Fyld bunden af en petriskål med tætpakket isstabling det over skålens låg. Kort vortex røret, der indeholder immobiliserede komplekser. Placer den derefter vandret på isen og dæk den med den forvarperede lampe, og sørg for, at prøven er 2 til 3 centimeter fra pærens overflade.Bestråling af prøven i i alt 30 minutter, mens røret ofte inverteres og hvirvles, for at sikre ensartet eksponering og for at undgå overophedning. Derefter drejer du perlerne ned ved 25 gange g i 2 til 3 minutter og opsamler supernatanten. Centrifuge denne supernatant igen ved hjælp af de samme betingelser.Saml den resulterende supernatant og sørg for at efterlade en lille mængde i bunden af røret for at undgå at overføre eventuelle resterende perler. Brug SDS-PAGE elektroforese, adskille en brøkdel af UV eluted supernatant og den tilsvarende fraktion fra materialet tilbage på perlerne efter UV elution. Næste brug en kommercielt tilgængelig sølv farvning kit til at plette gelen.Vurder effektiviteten af UV-elution ved at sammenligne intensiteten af de proteiner, der findes i UV-eluterede supernatant, og dem, der er tilbage på perlerne efter UV-bestråling. Punktafgifter protein bånd af interesse og bestemme deres identitet ved massespektrometri. Efter dette, direkte analysere en brøkdel af UV eluted supernatant ved massespektrometri til at bestemme hele proteome af det rensede materiale i en upartisk måde.I denne undersøgelse inkuberes stamløkke RNA mærket med fotokløver biotin med 1 milliliter cytoplasmatisk S100-ekstrakt fremstillet af mus myelomatoseceller. Og effekten og effektiviteten af UV elution analyseres ved sølv farvning. En række proteiner påvises på streptavidin perler før UV-opløsning.Bestråling med langbølge UV frigiver kun nogle af disse proteiner i supernatanten, hvilket efterlader en ikke-specifik baggrund på perlerne. Dette understreger betydningen af UV-elution-trinnet. Massespektrometri identificerer de vigtigste UV eluterede proteiner som 3'hExo og SLBP med SLBP repræsenteret af både fuld længde protein og en række kortere nedbrydningsprodukter.Mindre mængder af andre proteiner identificeret som forskellige RNA bindende proteiner også selektivt frigives til opløsning ved UV-bestråling. UV elution af immobiliseret Drosophila histone pre-mRNA mærket med foto-kløvet biotin inkuberet med et nukleart ekstrakt resulterede i en selektiv frigivelse af kun et lille antal proteiner i supernatant med en intens baggrund af ikke-specifikke proteiner tilbage på perlerne. Massespektrometri identificerer disse proteiner som komponenter i U7 snRNP.De er ikke opdaget i overværelse af forarbejdning konkurrenter, der blokerer binding af U7 snRNP til histon pre-mRNA. Det er vigtigt at bruge høj intensitet UV-lampe og placere den tæt afstand til den bestrålede prøve og samtidig sørge for, at den ikke overophedes. UV-elutionsmetoden giver indfødte RNA-proteinkomplekser, der mangler større forurenende stoffer og er direkte egnede til yderligere rensningstrin og funktionelle analyser.Undgå øjen- og hudeksponering under UV-bestråling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Isolering af sammenhørende RNA-protein-komplekser fra celler under anvendelse Oligonucleotid-rettet Eluering

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem affinitetsoprensning af proteinkomplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

En oligonukleotid-baserede Tandem RNA isolering Procedure at inddrive eukaryote mRNA-Protein komplekser

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...